微生物技术综合实验
年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201
学号：1301014026
姓名：徐红贞
指导老师：刘凤霞教授
日期：二零一三十月五号
目录
1实验目的及原理 (1)
1.1实验目的 (1)
1.2实验原理 (1)
2实验材料 (1)
2.1实验仪器 (1)
2.2实验试剂 (1)
2.3培养基 (2)
2.3.1 生长培养基 (2)
2.3.2鉴定培养基 (2)
2.3.3摇瓶培养基 (2)
3试验方法 (2)
3.1仪器的准备 (2)
3.2培养基的配置 (2)
3.3初步筛选及鉴定 (2)
3.3.1采集土样 (3)
3.3.2富集培养 (3)
3.3.3稀释分离、纯化 (3)
3.3.4初筛 (3)
3.4复筛及鉴定 (4)
3.4.1革兰染色 (4)
3.5酶活力的测定 (4)
3.5.1摇瓶培养 (4)
3.5.2酶液稀释 (4)
3.5.3酶液测定 (4)
4结果分析 (5)
4.1平板涂布分离 (5)
4.2平板划线分离 (5)
4.3初筛 (5)
4.4复筛 (5)
4.5摇瓶培养 (6)
4.6酶活力测定 (6)
5参考资料 (7)
6附录 (8)
微生物上游技术综合实验
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定
1.实验目的及原理
1.1实验目的
（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。
（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。
（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。
（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。
（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
1.2实验原理
选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。
2. 实验材料
2.1实验仪器
无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。
2.2 实验试剂
○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。
○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定
准确加入2.00mL碘液储备液，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每天配制一次）。
○320g/L可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于250mL烧杯中，用少量水调成糊状，在搅拌下加入约80mL沸水，继续加热煮沸至透明（20min），冷却后用水定容至100mL（此溶液需当天配制，存放冰箱备用）
○4pH6.0磷酸缓冲溶液：称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解定容至1000mL，配好后用酸度计校正其pH至6.0
○50.1mol/L盐酸溶液：量取9.4mL浓盐酸，用水稀释定容至1000mL。
草酸铵结晶紫番红碘液95%酒精无菌水香柏油吸水纸擦镜纸
2.3 培养基
2.3.1 斜面培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g琼脂15~20g，自来水1000ml，pH 7.2~7.4
2.3.2鉴定培养基
可溶性淀粉20g, 硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20 g, 自来水1000ml，校正pH至7.2～7.4,
2.3.3摇瓶培养基
玉米粉2g，黄豆饼粉1.5g，氯化钙0.02g，硫酸镁0.02g，氯化钠0.25g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸氢二钠0.2g，柠檬酸钠0.2g，硫酸铵0.075g,(溶解后加)，校正pH值7.0 3.实验方法
3.1仪器的准备
①准备试管若干支，洗净晾干，其中7支各装9毫升蒸馏水（或自来水），上塞，10支一捆121度高压灭菌20-30分钟。
②培养皿若干个并洗净晾干，每5个一包，高压灭菌。
③移液管洗净塞上脱脂棉，用报纸条包好、捆扎高压灭菌。
④准备一个三角瓶装入自来水300-400毫升，上棉塞并用纸包好高压灭菌。
3.2培养基的配置
按各培养基配方配置培养基，并将生长培养基分装6支试管，上棉塞，放入大烧杯中待灭菌。其余的培养基分装入三角瓶内，上棉塞，包扎灭菌。
3.3初步筛选及鉴定
微生物上游技术综合实验
3.3.1采集土样
用无菌铲铲去表层5-10厘米，用无菌器具规范采取50-100克，装入无菌纸袋中并记录采集的时间、地点及植被情况等等。
3.3.2富集培养
将采集的土样称取5克，放入装有45毫升无菌水的三角瓶中，放入恒温振荡培养箱中于37度下培养10-20分钟。
3.3.3稀释分离、纯化
取装有9毫升无菌水试管5支，用记号笔编上10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7取已稀释成10-1土壤液，振荡后静置30秒，用无菌的移液管吸取1毫升土壤悬液加入10-2的无菌水试管中，并在试管内轻轻反复吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1毫升稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。并做9个平板，每个稀释度做3个。
用一支新的无菌移液管，由低浓度开始（10-3,10-4,10-5），从各试管土壤稀释液中各吸取1ml，对号注入生长培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃棒涂匀，每个浓度做三个平板（重复），倒置于37℃温箱中培养24到48小时。
培养后，挑选10-5梯度上的单菌落进行平板划线分离，共划四个平板，并进行编号1、2、3号，于37℃倒置培养24h。
3.3.4初筛
透明圈实验
将疑枯草芽孢杆菌用平板划线法接种于鉴定培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24-48h后，用胶头滴管将碘液直接滴于菌落周围，观察现象。阳性反应（淀粉被分解）菌落周围出现透明圈，呈紫色；阴性反应则无透明环，呈深蓝色。（透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低）。
3.4复筛及鉴定
革兰氏染色：
（1）涂片：左手持培养皿，右手持接种环，用接种环从培养皿中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定
（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。
（4）染色
○1初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗至流下的水无色为准。
○2媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗至流下的水无色为准。
○3脱色：将载玻片上的水用吸水纸吸干，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精，至流下的水为无色为准。
○4复染：吸水纸吸干，后用番红液染1—2分钟，水洗至流下的水为无色为准。
（5）.镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
3.5酶活力的测定
3.5.1摇瓶培养
选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5毫升无菌生理盐水中吸取此液体加入液体培养液中，30度摇瓶培养72小时。
3.5.2酶液稀释
取发酵液进行4000r/min 离心5分钟，取上清夜，用磷酸缓冲液稀释酶活力为65—70U/ml，便于准确测定。
3.5.3酶液测定
○1吸取20.00mL 20g/L可溶性淀粉溶液和5.00mLpH6.0磷酸缓冲溶液于大试管中，在60℃恒温水浴中预热平衡5min。
○2加入待测酶液1.00mL，立即摇匀并用秒表计时，准确反应5min。
○3立即用结晶干燥的吸管吸取上述反应液 1.00mL至预先盛有0.50mL 0.1mol/L HCl溶液和5.00mL碘液使用液的10mL具塞比色管中，摇匀。
○4以0.50mL 0.1mol/LHCl溶液5.00mL碘液使用液和1.00mL磷酸缓冲溶液的混合
微生物上游技术综合实验
溶液做空白，于660nm波长下，用1cm比色皿迅速测定其吸光度，根据吸光度查附录“吸
光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表”，求得测试溶液的浓度C 。
4.结果分析
4.1平板涂布分离
经48h培养后，结果见表4-1
表4-1 平板涂布菌落状况
1 2 3 菌落形态
10-3 10-4 10-5菌体成片生长，有
3个单菌落
平板四周有菌生长
有杂菌生长充满平
板
菌体成片生长，有
1个单菌落
菌体充满整个平
板，无单菌落
有杂菌生长，并有
单菌落
菌落充满整个平
板，有5个单菌
落
有2个单菌落
有1个单菌落
有褶皱，表面光滑，
湿润呈圆形乳白色
经分析，由于操作不熟练导致10-4、10-5梯度有少量菌体生长，10-6梯度中菌体少且培养时为倒置培养从而导致无菌落生长。
4.2平板划线分离
挑选10-5梯度的菌落进行平板划线分离，经48h培养后，每平板最大菌落结果见表4-2
表4-2 平板划线菌落状况
1号2号3号4号
大小／cm 形态
0.5
表面光滑，
0.7
有褶皱呈
0.8
乳白色或
0.4
淡黄色圆形
经分析，由于菌体为野生菌而各自的生长能力不同，从而导致菌落大小不同。
4.3初筛
培养24h后，结果见表4-3
表4-3 透明圈大小
1号2号3号4号
透明圈大小／㎝ 1.9 2.2 2.6 2.0
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定
经分析，菌落周伟产生透明圈，可判断该菌可以产生淀粉酶，由于菌体本身利用淀粉的能力不同，而导致透明圈直径各异。
4.4复筛
在显微镜下观察，发现菌体成杆状且呈现蓝紫色，初步判断其为杆菌且为阳性菌。
4.5摇瓶培养
培养52h后，用碘液检验，结果见表4-4
表4-4 24h碘液检验
1号2号3号4号
颜色深蓝色深蓝色焦糖色棕色
表4-5 72h碘液检验
1号2号3号4号
颜色深蓝色深蓝色棕黄色棕黄色
经分析，3号、4号摇瓶中的菌产生淀粉酶的能力较强，故对其进行淀粉酶活力测定。
4.6酶活力测定
在660nm波长下，吸光度见表4-6
表4-6 吸光度
1 2 3
吸光度﹙A﹚0.110 0.120 0.100
根据附录表可知，当吸光度为0.174时，相对应的酶浓度为4.329u/mL，当吸光度为0.214时，相对应的酶浓度为4.156u/mL，则其平均浓度为4.243 u/mL。
α-淀粉酶活力：
X=c×n=4.243×1=4.243 u/mL
式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL) ；
c——测试酶液平均浓度，u/mL；
n——样品的稀释倍数
微生物上游技术综合实验
5.参考资料
[1]徐颖高产α-淀粉酶生产菌的筛选鉴定及其酶学性质研究[D]-四川大学2007
[2]刘雅琴.陈海魁.李瑞雪α- 淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究[J]-安徽农业
科学2010(34)
[3]刘雅琴.陈海魁.孔令全α-淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育[J]-畜牧与饲料科学
2010(9﹚
[4]刘雅琴.乌日娜.段金华耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件优化[J] -安徽农业科学
2010(35)
[5]卢福芝.钱丰.杨琴.劳斌淀粉酶产生菌的分离筛选[J] -河池学院学报2012(2)
[6]潘康成产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究[D]-四川农业大学2009
[7]张建军淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达[D] -福建师范大学2009
[8]李力高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选[D]-新疆农业大学2009
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定
附录：
吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表
微生物上游技术综合实验
浅谈枯草芽孢杆菌 1. 抗生作用 抗生作用是指拈抗微生物通过产生代谢产物在低浓度下就能够对病原微生物的生长和代谢产生抑制作用，从而来影响病原微生物的生存和活动。近半个世纪以来，人们从枯草芽孢杆菌不同菌株的代谢产物中分离纯化了多种有效的抗菌物质。 2 溶菌作用 枯草芽孢杆菌的溶菌作用主要表现在是通过吸附在病原菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质造成原生质泄露使得菌丝体断裂；或者是产生抗菌物质通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等现象从而抑制孢子萌发。 3 诱导植物产生抗性及促进植物生长 诱导植物产生抗性作用是指枯草芽孢杆菌不但能够抑制植
物病原菌，而且还能够诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能的作用。什么是PGPR国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根圈细菌(Plant growth promoting rhizobaceria)，简称为PGPR。 其中以枯草芽孢杆菌的抗逆性最强、功能最多、适应性最广、效果最稳定。枯草芽孢杆菌能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长使植物抵抗病原菌的侵害。 4保护环境。 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。
5 枯草芽孢杆菌对土壤中的菲与苯并芘的吸附及生物降解功能 土壤与其相连的水环境称为土壤-水环境系统，其中存在着大量的土壤固有微生物，并在表面存在生物膜，因为生物膜形成了隔离层，有机污染物在接触到支撑生物膜的固体基底之前，必须首先到达并且穿过这个隔离层，这样就强烈地改变矿物颗粒或基底的吸附行为，对吸附作用有重要的影响，近年的研究表明，由于受污染影响，导致土壤中含有多环芳烃（PAHs），沉积物中PAHs主要为原油污染以及工业或民用煤不完全燃烧所致，枯草芽孢杆菌对菲与苯并芘的吸附及生物降解研究，研究表明以枯草芽孢杆菌为接种微生物，对菲与苯并芘都可进行吸附或生物降解，48h液相PAHs浓度达到平衡时，微生物对菲消除了98％，对苯并芘消除85％；接种的样品48h吸附等温线均呈线形，能较好地符合线性方程；在接种微生物情况下，沉积物与土壤对菲和苯并芘吸附特征均发生较大变化，对菲的吸附量增大约35倍，而对苯并芘的吸附量却降低了2／3左右；未接种微生物的土壤和沉积物对菲解吸率为20％，接种的样品组为2.9％，而对苯并芘的解吸结果与菲相反，未接种
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案 一、材料准备 （1）实验仪器 培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪 （2）实验试剂 NA培养基： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水 枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105 （3）培养基配方 牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。 二、实验步骤 （1）制备菌液 称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①； 用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧; （2）进行涂板 向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；
待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记； 每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次； 将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。 （3）菌落计数 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数： 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数； 若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数； 若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数； 若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。5.6若三个稀释度的平均菌落数不在30个-300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。 （4）结果统计与计算 有效活菌总数按式（1）计算； A=B×C /D (1)
微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号
目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)
微生物上游技术综合实验 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。 2.2 实验试剂 ○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。 ○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0
山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
山东大学实验报告2017年12月4日 ___________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康 一、目的要求 1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的 酶系统。 2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、基本原理 1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。 （1）吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。 （2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 （3）伏-普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉
利福平标记枯草芽孢杆菌实验 1、实验材料 1.1试剂 利福平溶液：用95%乙醇配制10mg/mL的利福平溶液，配好后经0.22um无菌滤膜除菌。 1.2培养基 NA（牛肉膏蛋白胨培养基）培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1.0L，琼脂18.0g，pH7.0-7.2 200μg/mL利福平NA培养基：NA培养基经高温灭菌，冷却至50-55℃时加入利福平（1LNA培养基加入20mL10mg/mL利福平溶液）。 液体培养基为对应固体培养基不添加琼脂，其余成分一致。 2、抗生素标记试验 首先制备利福平浓度为100μg/mLNA平板，检测枯草芽孢杆菌天然抗药性。 根据天然抗药性检测结果，进行抗生素标记实验（杜立新等，2004），取纯化好的枯草芽孢杆菌单菌落接种到含有5ug/mL利福平NA液体培养基中，150r/min，28℃培养，待出现浑浊后稀释菌液，取三个不同浓度的稀释液100μL 加到含有相同浓度抗生素的NA细菌平板，涂匀，继代培养一次，待长出单菌落后转入下一高浓度的利福平NA培养基，依次经过利福平5、10、20、40、80、120、160、200ug/mLNA液体培养基诱导，直至筛选出能耐受的最高利福平浓度200ug/mL。筛选耐药枯草芽孢杆菌能否应用于研究，还必须验证其耐药的稳定性及拮抗性能。耐药稳定性试验参考吴春胜等（1994）方法。（1）将筛选的枯草芽孢杆菌在利福平含量依次升高的NA培养基上连续传代6次，观察其是否始终有菌落出现。（2）将筛选枯草芽孢杆菌接种至不含利福平NA培养基中，连续传代3-5次，然后将其涂布于含200μg/mL利福平的NA培养基上，观察其是否有菌落出现。（3）将抗药菌株置于4℃的低温中保藏2-3周，然后接种于含200μg/mL 利福平的NA液体培养基上进行培养，观察是否出现浑浊，并在含200μg/mL利福平的NA培养基上划线培养，观察其是否有菌落出现。
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
微生物设计性实验 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 分 离 及 筛 选 第二小组 组长：杨泽升 组员：王亭亭 叶宁 霍克
枯草芽孢杆菌的分离和筛选 1 实验目的 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 2 实验原理 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 3实验材料 3.1选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基， 配方： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml 调整pH至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 3.2溶液或试剂 牛肉膏 1.25g 蛋白胨 2.5g 氯化钠 1.25g 可溶性淀粉 2.5g 琼脂 5g 碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。 3.4仪器或其他用品 平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 4 实验流程
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
G25 Q 江苏苏滨生物农化有限公司企业标准 Q/320922 BN 032-2014 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药 2014-08–18发布 2014-08–30实施 江苏苏滨生物农化有限公司发布
前言 本标准按照 GB/—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GH/—2003《农药母药产品标准编写规范》进行编制而成。 本标准附录A为规范性附录。 本标准附录B为资料性附录。 本标准由江苏苏滨生物农化有限公司提出并起草。 本标准主要起草人：赵福兵、许军、沈文权。
Ⅰ 引言 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药是我公司自行研制开发的微生物发酵产品。 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药经过加工可以主要用于防治水稻纹枯病、稻曲病。 雌、雄性均＞经测定1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药对大白鼠的经口毒性LD 50 雌、雄性均＞2150mg/kg。 4640mg/kg，经皮毒性为LD 50
Ⅱ 1000亿cfu/g枯草芽孢杆菌母药 本品有效成分的其他名称、结构式和基本物化参数如下： a)枯草芽孢杆菌 中文通用名称：枯草芽孢杆菌—+菌株编号。 拉丁学名：Bacillus subtilis。 分类地位：细菌（Bacteria）；厚壁菌门（Firmicutes）;芽孢杆菌纲（Bacilli）；芽孢杆菌目（Bacillales）；芽孢杆菌科（Bacillaceae）；牙孢杆菌属（Bacillus）。 形态学特征：菌体呈杆状，单个、成对或短链排列，大小为μm～μm×μm～μm，无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢μm～μm×μm～μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大；革兰氏染色阳性；菌落圆或不规则形，表面粗糙不透明，可以起皱，呈奶油色或污白色。 有效成分主要存在形式：芽孢。 主要生物活性：抑菌（防病）。 培养保存条件：最适生长温度为30℃—37℃；适合培养基为营养琼脂（NA）或营养肉汤（NB）培养基；适宜贮存温度为0℃—4℃。 1 范围 本部分规定了细菌微生物农药枯草芽孢杆菌母药的要求、试验方法、检验与验收以及标志、标签、包装、贮运。 本部分适用于以芽孢为主要活性成分的粉状枯草芽孢杆菌母药。 2 规范性引用文件 下列文件中对于本文件的应用是必不可少。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1601-1993农药pH值的测定方法 GB/T 1604-1995商品农药验收规则 GB/T 1605-2001商品农药采样方法 GB 3796-2006农药包装通则 GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定
20L全自动发酵罐枯草芽孢杆菌产淀粉 酶实验 实验时间：2012年6月17日—2012年6月28日 学生姓名：xxxxxx 学号： 院系：生命学院 专业：生物技术 指导教师： 2012年6月30日
目录 一. 实验目的要求 (4) 二、实验试剂和仪器 (4) 1、种子培养基：57＃培养基 (5) 2、发酵培养基 (5) 3、发酵过程中相关参数的测定 (6) 三、实验步骤与方法 (6) 1、了解发酵罐系统的结构 (6) 2、种子培养 (6) 3、发酵罐空消 (6) 4.PH电极与DO电极的首次校正 (8) 5、发酵培养基的配置 (9) 5.1 培养基摇瓶试验 (9) 5.2 种子的摇瓶 (9) 6.装料 (10) 7、实消 (10) 8.PH电极与DO电极的再次校正 (10) 9、接种 (11) 10、设定发酵参数，运行发酵指令 (11) 11、发酵过程中相关参数的记录 (11) 12、发酵过程中取样及相关参数的测定 (12) （1）参数测定所需的溶液的配置 (12)
（2）取样 (13) （3）样品处理 (13) （4）残糖含量测定（DNS法） (13) （5）生物量的测定（比浊法） (14) （6）淀粉酶发酵活力的测定 (14) （7）葡萄糖标准曲线的制作 (15) （8）麦芽糖标准曲线的制作 (15) 13. 放料,清洗罐体，空消，保养 (16) 四、实验结果与讨论 (17) 五. 实验心得体会 (26)
一、实验目的要求： 1.掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构 (1)发酵罐主体 (2)蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作 (3)通气系统 (4)加热冷却循环系统：各管道联络关系 (5)搅拌动力系统 (6)智能控制系统 2.掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种， 参数设定 3.掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度， 搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。 4.运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某 一特定菌株的发酵规律。 二、实验试剂和仪器 1、种子培养基：57＃培养基 试剂及药品：麸皮50g 豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30g NaCl 2 g 蒸馏水、斜面培养的枯草芽孢杆菌 器材：1000ml烧杯、玻璃棒、100ml锥形瓶（20个）、天平、粉碎机、电热炉、高压灭菌锅、灭菌枪头、1000移液枪、酒精灯、75%
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 一、实验原理 以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 二、实验材料 （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌 （二）培养基： 1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯 化钠)：1% 调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl 2 0 .02 % 、 MgSO 40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K 2 HPO 4 0 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、 Na 2HPO 4 0 .2 % 调节pH 值7 .0 （三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0） （四）实验仪器 离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管 三、实验过程 1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。 2、种子斜面及种子液准备 A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。 B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。 C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。（6瓶/组） 3、发酵培养 A、按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。 B、在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。40-48h酶活降低后结束实验。 4、发酵结束后，用显微镜检查是否染菌。 5、待测酶液的制备： 称取1g~2g酶粉(精确至0.000 1 g)或准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。
细菌的生理生化反应实验报告 【实验目的】 了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。了解生理生化反应在鉴别细菌中的意义。 【实验原理】 通过测定微生物校内某些酶类的有无、对某些第五的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物带血的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚， 吲哚与对二甲基氨基苯甲醛发生反应，形成红色的玫瑰吲哚，为吲哚反应阳性。微生物发酵葡萄糖成丙酮酸，2分子丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下与 肌酸类物质反应，生成红色化合物为.反应阳性。有些细菌发酵糖类产生有机酸较多，使发 酵液的pH下降到以下，当加入甲基红试剂后，时发酵液变红色，为甲基红反应阳性。某种 微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 【实验材料和用具】 1.菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌。 2.培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗 糖）、V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂 3.仪器：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液枪、滴管、 杜氏小管。 【实验方法】 （一）V-P反应 1.试管标记取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、 普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录去除以上培养物，分别取出2ml培养液加入另外5支相应编号的空试管中，加入与培养液等量的V-P试剂，充分震荡2min。放置37度恒温培养箱中培养30min观察记录结果。 （二）甲基红实验 于V-P实验留下的培养液中，分别加入2-3滴甲基红指示剂，立即观察培养液的颜色变化（三）吲哚实验 1.试管标记取5只装有蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变 形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙 醚层浮于培养液的上面，此时沿试管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂。观察记录结果 （四）糖发酵试验 1.试管标记取分别装有葡萄糖、蔗糖、乳糖发酵培养液试管各4支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。 2.接种培养以无菌操作分别接种少量菌苔至上述相应试管的培养基中。空白对照不接种。 置37度恒温培养箱中培养24-48h。 3.观察记录 【实验结果与分析】 （一）V-P 大肠产气枯草变形对照 结果—+———
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培
实验七枯草芽孢杆菌最适生长条件的研究 一、实验原理 采用正交设计法，选择培养基浓度、培养温度、PH等四个因素的三个水平来设计实验，并采用极差法分析实验结果，得出枯草芽孢杆菌的最适生长条件。本实验不考虑四种因素之间的相互影响。 二、实验材料 1、菌种：枯草芽孢杆菌48小时培养液100ml； 2、器材：恒温培养箱（20℃、30℃、40℃各一）；电子天平（感量为0.01g）；PH 计；2000W电炉、量筒、烧杯、漏斗、玻璃棒、刀、不锈钢锅、高压蒸汽灭菌 锅、250ml三角瓶20个、5ml吸管4~8支； 3、药品：蛋白胨；酵母膏；NaCl；蒸馏水；NaOH（1mol/L）、HCl（1mol/L） 三、实验步骤 1、实验设计 （1）确定实验因素和水平数： 根据实验的目的确定实验要研究的因素。如果对研究的问题了解较少，可多取一些实验因素；若反之可抓住主要因素研究。因素确定后，就要选择测试水平，每个因素的水平数可以相等，也可以不等，重要因素或特别希望了解的因素水平数可以多一些。 选择LB培养基中蛋白胨与酵母膏的浓度、培养基PH值以及培养温度等三个因素为优化对象，设计三个测试水平，因此可以选用L9（34）正交表，若考虑交互作用则应选择L27（313）正交表。本实验不考虑交互作用，选择L9（34）正交表即可。 （2）正交表的选择
（3）表头设计 所谓表头设计，就是把实验中挑选的各个因素，填写在正交表的表头各列。不考虑交互作用时，因素的排列顺序可任意放置，只要每一因素占一列即可；若要考虑交互作用时，则应按照指定的列安排，不能任意放置。本实验不考虑交互作用，可任意排列。 枯草芽孢杆菌最适生长条件的研究表头设计： （4）实验安排 表头设计好后，把各列中的水平号换算成各因素的具体水平就成实验方案。
微生物学实验报告 （格式标准参考） (生命科学专业，生物技术专业) 教师：黎勇
目录索引 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 (3) 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 (4) 实验三常用培养基的配制 (6) 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 (7) 实验五、微生物大小的测定与显微计数 (9) 实验六环境中微生物的检测和分离纯化 (10) 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应 (12) 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 (13) 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科
实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1.N·A=n·sinα 2.D=λ/2N.A 3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制） 菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌 放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5） 特殊结构：无特殊结构：无 视野观察下微生物的形态 2、油镜使用时为什么必须干燥装片？
微生物技术综合实验 年级： 13级生物工程（专升本）班级： 2013011201 学号： 1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：凤霞教授 日期：二零一三十月五号
目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7)
6附录 (8)
微生物上游技术综合实验 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。 2.2 实验试剂 ○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。 ○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，准