微生物技术综合实验
年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201
学号：1301014026
姓名：徐红贞
指导老师：凤霞教授
日期：二零一三十月五号
目录
1实验目的及原理 (1)
1.1实验目的 (1)
1.2实验原理 (1)
2实验材料 (1)
2.1实验仪器 (1)
2.2实验试剂 (1)
2.3培养基 (2)
2.3.1 生长培养基 (2)
2.3.2鉴定培养基 (2)
2.3.3摇瓶培养基 (2)
3试验方法 (2)
3.1仪器的准备 (2)
3.2培养基的配置 (2)
3.3初步筛选及鉴定 (2)
3.3.1采集土样 (3)
3.3.2富集培养 (3)
3.3.3稀释分离、纯化 (3)
3.3.4初筛 (3)
3.4复筛及鉴定 (4)
3.4.1革兰染色 (4)
3.5酶活力的测定 (4)
3.5.1摇瓶培养 (4)
3.5.2酶液稀释 (4)
3.5.3酶液测定 (4)
4结果分析 (5)
4.1平板涂布分离 (5)
4.2平板划线分离 (5)
4.3初筛 (5)
4.4复筛 (5)
4.5摇瓶培养 (6)
4.6酶活力测定 (6)
5参考资料 (7)
6附录 (8)
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定
1.实验目的及原理
1.1实验目的
（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。
（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。
（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。
（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。
（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
1.2实验原理
选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。
2. 实验材料
2.1实验仪器
无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅
玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。
2.2 实验试剂
○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。
○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，准确加入2.00mL碘液储备液，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每天配制一次）。
○320g/L可溶性淀粉溶液：称取2.00g可溶性淀粉于250mL烧杯中，用少量水调成糊状，在搅拌下加入约80mL沸水，继续加热煮沸至透明（20min），冷却后用水定容至100mL（此溶液需当天配制，存放冰箱备用）
○4pH6.0磷酸缓冲溶液：称取磷酸氢二钠45.23g，柠檬酸8.07g，用水溶解定容至1000mL，配好后用酸度计校正其pH至6.0
○50.1mol/L盐酸溶液：量取9.4mL浓盐酸，用水稀释定容至1000mL。
草酸铵结晶紫番红碘液95%酒精无菌水香柏油吸水纸擦镜纸
2.3 培养基
2.3.1 斜面培养基
牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g琼脂15~20g，自来水1000ml，pH 7.2~7.4
2.3.2鉴定培养基
可溶性淀粉20g, 硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20 g, 自来水1000ml，校正pH至7.2～7.4,
2.3.3摇瓶培养基
玉米粉2g，黄豆饼粉1.5g，氯化钙0.02g，硫酸镁0.02g，氯化钠0.25g，磷酸氢
二钾0.2g，磷酸氢二钠0.2g，柠檬酸钠0.2g，硫酸铵0.075g,(溶解后加)，校正pH值7.0
3.实验方法
3.1仪器的准备
①准备试管若干支，洗净晾干，其中7支各装9毫升蒸馏水（或自来水），上塞，10支一捆121度高压灭菌20-30分钟。
②培养皿若干个并洗净晾干，每5个一包，高压灭菌。
③移液管洗净塞上脱脂棉，用报纸条包好、捆扎高压灭菌。
④准备一个三角瓶装入自来水300-400毫升，上棉塞并用纸包好高压灭菌。
3.2培养基的配置
按各培养基配方配置培养基，并将生长培养基分装6支试管，上棉塞，放入大烧杯中待灭菌。其余的培养基分装入三角瓶，上棉塞，包扎灭菌。
3.3初步筛选及鉴定
3.3.1采集土样
用无菌铲铲去表层5-10厘米，用无菌器具规采取50-100克，装入无菌纸袋中并记录采集的时间、地点及植被情况等等。
3.3.2富集培养
将采集的土样称取5克，放入装有45毫升无菌水的三角瓶中，放入恒温振荡培养箱中于37度下培养10-20分钟。
3.3.3稀释分离、纯化
取装有9毫升无菌水试管5支，用记号笔编上10-2 、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7取已稀释成10-1土壤液，振荡后静置30秒，用无菌的移液管吸取1毫升土壤悬液加入
10-2的无菌水试管中，并在试管轻轻反复吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法从10-2的试管中吸取1毫升稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释为10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。并做9个平板，每个稀释度做3个。
用一支新的无菌移液管，由低浓度开始（10-3,10-4,10-5），从各试管土壤稀释液中各吸取1ml，对号注入生长培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃棒涂匀，每个浓度做三个平板（重复），倒置于37℃温箱中培养24到48小时。
培养后，挑选10-5梯度上的单菌落进行平板划线分离，共划四个平板，并进行编号1、2、3号，于37℃倒置培养24h。
3.3.4初筛
透明圈实验
将疑枯草芽孢杆菌用平板划线法接种于鉴定培养基上，在37℃恒温培养箱中培养24-48h后，用胶头滴管将碘液直接滴于菌落周围，观察现象。阳性反应（淀粉被分解）菌落周围出现透明圈，呈紫色；阴性反应则无透明环，呈深蓝色。（透明圈的大小可初步判断该菌水解能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低）。
3.4复筛及鉴定
革兰氏染色：
（1）涂片：左手持培养皿，右手持接种环，用接种环从培养皿中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。
（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。
（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。
（4）染色
○1初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗至流下的水无色为准。
○2媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗至流下的水无色为准。
○3脱色：将载玻片上的水用吸水纸吸干，并衬以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒，立即用水冲净酒精，至流下的水为无色为准。
○4复染：吸水纸吸干，后用番红液染1—2分钟，水洗至流下的水为无色为准。
（5）.镜检：干燥后，置显微镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
3.5酶活力的测定
3.5.1摇瓶培养
选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶于5毫升无菌生理盐水中吸取此液体加入液体培养液中，30度摇瓶培养72小时。
3.5.2酶液稀释
取发酵液进行4000r/min 离心5分钟，取上清夜，用磷酸缓冲液稀释酶活力为65—70U/ml，便于准确测定。
3.5.3酶液测定
○1吸取20.00mL 20g/L可溶性淀粉溶液和5.00mLpH6.0磷酸缓冲溶液于大试管中，在60℃恒温水浴中预热平衡5min。
○2加入待测酶液1.00mL，立即摇匀并用秒表计时，准确反应5min。
○3立即用结晶干燥的吸管吸取上述反应液1.00mL至预先盛有0.50mL 0.1mol/L HCl溶液和5.00mL碘液使用液的10mL具塞比色管中，摇匀。
○4以0.50mL 0.1mol/LHCl溶液5.00mL碘液使用液和1.00mL磷酸缓冲溶液的混合溶液做空白，于660nm波长下，用1cm比色皿迅速测定其吸光度，根据吸光度查附录“吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表”，求得测试溶液的浓度C 。
4.结果分析
4.1平板涂布分离
经48h培养后，结果见表4-1
表4-1 平板涂布菌落状况
1 2 3 菌落形态
10-3 10-4 10-5菌体成片生长，有
3个单菌落
平板四周有菌生长
有杂菌生长充满平
板
菌体成片生长，有
1个单菌落
菌体充满整个平
板，无单菌落
有杂菌生长，并有
单菌落
菌落充满整个平
板，有5个单菌
落
有2个单菌落
有1个单菌落
有褶皱，表面光滑，
湿润呈圆形乳白色
经分析，由于操作不熟练导致10-4、10-5梯度有少量菌体生长，10-6梯度中菌体少且培养时为倒置培养从而导致无菌落生长。
4.2平板划线分离
挑选10-5梯度的菌落进行平板划线分离，经48h培养后，每平板最大菌落结果见表4-2
表4-2 平板划线菌落状况
1号2号3号4号
大小／cm 0.5
表面光滑，
0.7
有褶皱呈
0.8
乳白色或
0.4
淡黄色圆形
形态
经分析，由于菌体为野生菌而各自的生长能力不同，从而导致菌落大小不同。
4.3初筛
培养24h后，结果见表4-3
表4-3 透明圈大小
1号2号3号4号
透明圈大小／㎝ 1.9 2.2 2.6 2.0
经分析，菌落周伟产生透明圈，可判断该菌可以产生淀粉酶，由于菌体本身利用淀粉的能力不同，而导致透明圈直径各异。
4.4复筛
在显微镜下观察，发现菌体成杆状且呈现蓝紫色，初步判断其为杆菌且为阳性菌。
4.5摇瓶培养
培养52h后，用碘液检验，结果见表4-4
表4-4 24h碘液检验
1号2号3号4号
颜色深蓝色深蓝色焦糖色棕色
表4-5 72h碘液检验
1号2号3号4号
颜色深蓝色深蓝色棕黄色棕黄色经分析，3号、4号摇瓶中的菌产生淀粉酶的能力较强，故对其进行淀粉酶活力测
定。
4.6酶活力测定
在660nm波长下，吸光度见表4-6
表4-6 吸光度
1 2 3
吸光度﹙A﹚0.110 0.120 0.100
根据附录表可知，当吸光度为0.174时，相对应的酶浓度为4.329u/mL，当吸光度为0.214时，相对应的酶浓度为4.156u/mL，则其平均浓度为4.243 u/mL。
α-淀粉酶活力：
X=c×n=4.243×1=4.243 u/mL
式中：X——样品的酶活力，u/g(u/mL) ；
c——测试酶液平均浓度，u/mL；
n——样品的稀释倍数
5.参考资料
[1]徐颖高产α-淀粉酶生产菌的筛选鉴定及其酶学性质研究[D]-大学2007
[2]雅琴.海魁.瑞雪α- 淀粉酶产生菌的分离筛选及酶学性质研究[J]-农业科学
2010(34)
[3]雅琴.海魁.孔令全α-淀粉酶产生菌的分离筛选与诱变选育[J]-畜牧与饲料科学
2010(9﹚
[4]雅琴.乌日娜.段耐酸性α-淀粉酶产生菌的发酵条件优化[J] -农业科学2010(35)
[5]卢福芝.钱丰.琴.劳斌淀粉酶产生菌的分离筛选[J] -学院学报2012(2)
[6]康成产酶芽孢杆菌的筛选、鉴定及对肉鸡的微生态效应研究[D] -农业大学2009
[7]建军淀粉酶产生菌的筛选及α-淀粉酶在米曲霉中的同源表达[D] -师大学2009
[8]力高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选[D] -新疆农业大学2009
附录：
吸光度与测试α-淀粉酶酶浓度对照表