细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制
【摘要】目的探讨细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在高糖引起的β细胞胰岛素分泌障碍中的作用机制。方法设立空白组、对照组（5.5mmol/L）和高糖组（33.3mmol/L）培养β-TC6细胞72h。采用丙酮酸脱氢酶（E1）活性检测试剂盒检测各组β-TC6细胞中E1活性。E1-siRNA转染细胞后，采用ELISA法检测各组核内乙酰辅酶A的变化情况；ChIP-qPCR法检测各组Islet1、Ins、Pdx1基因表达水平；Western blot法检测各组ISLET1、INS、PDX1蛋白表达水平。结果与对照组相比，高糖组β-TC6细胞E1活性降低，间接表明PDC 受损（P <0.05）；采用E1-siRNA处理后，核内乙酰辅酶A的生成量明显减少（P < 0.05）；细胞内的Islet1、Ins和Pdx1基因表达和蛋白水平均降低（P< 0.05）。结论高糖会引起PDC损伤，造成核内乙酰辅酶A生成减少，胰岛素及其分泌相关基因和蛋白水平降低，导致胰岛素分泌障碍。
【关键词】丙酮酸脱氢酶复合体；高糖；乙酰辅酶A；乙酰化；胰岛素分泌障碍
Mechanism of pyruvate dehydrogenase complex in nucleus in insulin secretion disorder caused by high
glucose
【Abstract】Objective: To investigate effect of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in the nucleus on insulin secretion deficiency of β-TC6 cells induced by high glucose condition. Methods:β-TC6 cell was cultured with blank group, control group (5.5mmol/L) and high glucose
group (33.3mmol/L) for 72 hours. Pyruvate dehydrogenase (E1) activity was analyzed by its kit. Acetyl-CoA in the nucleus of β-TC6 cell transfected with E1-siRNA was measured by ELISA kit. The expressions of Islet1, Ins and Pdx1 gene were detected by ChIP-qPCR. Their levels of proteins were analyzed by Western blot. Results:E1 of β-TC6 cell reduced under high glucose load (P <0.05). The amount of acetyl-CoA decreased after β-TC6 cell was transfected with EI-siRNA (P < 0.05). The gene expression and their protein levels of Islet, Ins and Pdx1 were significantly inhibited (P < 0.05).Conclusion:High glucose condition will cause damaging of PDC, decreasing production of acetyl-CoA, suppressing expression of Islet, Ins and Pdx1 gene and their proteins, which lead to insulin secretion deficiency.
【Key words】Pyruvate dehydrogenase complex; Acetyl-CoA; High glucose; Insulin secretion disorder
丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex, PDC）是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合物，由丙酮酸脱氢酶（E1）、二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）、二氢硫辛酸脱氢酶（E3）和六种辅助因子组成[1]。其活性的调控主要通过E1的磷酸化和去磷酸化来实现[2]。
过去认为PDC在哺乳动物体内仅存在于线粒体中，作为线粒体基质内的重要的多酶复合物，利用饮食中的碳水化合物生成乙酰辅酶A产生能量[3]。但有研究发现PDC同样参与了细胞核内乙酰辅酶A的
生成，而在细胞核中，PDC参与生成乙酰辅酶A是为了实现组蛋白乙酰化[4, 5]。Chakrabarti[6]等研究阐述了组蛋白乙酰化在调控胰岛素基因的表达中的重要作用，并发现胰岛β细胞胰岛素基因启动子邻近区域的组蛋白H3乙酰化水平明显升，与糖尿病的发生关系密切[7]。同时Bajotto[8]和Wu[9]等发现2型糖尿病的发生发展伴随着PDC活性下降，并与胰岛素抵抗呈平行性改变[9]。由此我们猜测PDC可能参与了胰岛β细胞核中乙酰辅酶A的生成及其组蛋白的乙酰化，进而影响胰岛素分泌及其相关基因和蛋白的表达。目前还没有相关研究能够证明高糖引起的胰岛素分泌障碍[11, 12]与上述过程有关。因此，本研究以PDC为切入点，探讨核内的PDC在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制，为二型糖尿病的预防与治疗找到新的视角。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
小鼠β-TC6胰岛β细胞系（购买于中国科学院上海细胞库）；DMEM 高糖培养基、PBS（以色列Biological Industries公司）、FBS和胰蛋白酶（Gibco公司）；Lipofectamine2000转染剂（Invitrogen公司）；RT-PCR试剂盒、引物（上海生工）；E1活性检测试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）；ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）；CHIP Assay Kit（Millipore 17-245RF）；快速DNA产物纯化试剂盒和UltraSYBR Mixture（Low ROX）（康为世纪）；Anti-Histone H3 (acetyl K27)、ISLET1、INS、PDX-1抗体（英国Abcam公司）；HRP标记的山羊抗兔抗体ΙgG二抗（美国Proteintech公司）；苯甲基磺酰氟
（PMSF，德国Merck公司）、RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱）。二氧化碳培养箱（HF90上海力申科学仪器有限公司），实时荧光定量PCR仪（CFX96）、小型垂直电泳槽、小型蛋白转运槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司产品）；细胞破碎仪（VCX800）（SONICS公司产品）；倒置显微镜（德国徕卡）。
1.2 方法
1.2.1 β-TC6细胞培养与干预
β-TC6细胞培养于含有15%FBS的高糖DMEM培养基中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，当细胞汇合率达80%左右时，用0.05%胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。将处于对数生长期的β-TC6细胞同等密度分别接种于60nm培养皿中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养24h，弃上清。设定空白组（培养基不额外添加葡萄糖），对照组（添加5.5mmol/L葡萄糖），高糖组（添加33.3mmol/L葡萄糖）培养72h。收集细胞，采用E1活性检测试剂盒检测E1活性。根据样品的蛋白浓度Cpr，按照公式E1活性=1904*△A/Cpr计算各实验组的E1活性。
1.2.2 β-TC6细胞的转染
将处于对数生长期的β-TC6细胞接种于六孔板，采用新鲜不含抗生素的培养基培养（800μL/孔），待细胞长至90%融合时，预备转染。
将200μL无血清DMEM 高糖培养基和5μL 20μmol/L siRNA （siRNA序列见表1），800μL无血清DMEM 高糖培养基和20μL 1mg/mL的lip2000转染试剂分别混合。室温静置5min，将两种混合液等体积混合，静置20min。将上述混合好的siRNA-lip2000复合物
加入到六孔板对应培养孔中，于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养5h，去除含siRNA培养基，更换完全新鲜的培养基，继续培养48h。
表1 各基因位点siRNA序列
名称siRNA序列
E1-siRNA序列
Sense GGUCAGAUCUUUGAAGCUUTT
Antisense AAGCUUCAAAGAUCUGACCTT
Scrambled siRNA Sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTT Antisense ACGUGACACGUUCGGAGAATT
1.2.3细胞核内乙酰辅酶A的检测
将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理的β-TC6细胞，采用无葡萄糖培养基培养24h后，分离提取细胞核。加入丙酮酸（10mmol/L）培养8h后，ELISA试剂盒检测细胞核内乙酰辅酶A的水平。
1.2.4染色质免疫共沉淀实时荧光定量核酸扩增技术（ChIP-qPCR）检测Islet1、Ins、Pdx1的基因表达
将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理后的β-TC6细胞，利用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术特应性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并采用DNA产物纯化试剂盒对其进行纯化，得到纯化DNA产物。用q-PCR法检测纯化产物Islet1、Ins、Pdx1基因表达（引物序列见表2）。
表2 引物序列表
名称序列
Islet1 Sense TTACCTTTTCGTTTGACCTTTGC Antisense ACCCTGTTACTCCCCAATCTGAG
Ins Sense TCAGGCCATCTGGTCCCTTA Antisense CCTGGACTTTGCTGTTTGGC
Pdx1 Sense AAACAAGTGCAGGTGTTCGC Antisense CCCCAGATCGCTTTGACAGT
1.2.5 Western Blot法检测各组ISLET1、INS和PDX1蛋白的水平
将E1-siRNA或Scrambled siRNA处理后的β-TC6细胞加入80μL 含PMSF的RIPA裂解液，裂解细胞提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。Western Blot法测定各组ISLET1、INS和PDX1蛋白的表达水平。
2 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计处理，正态分布的计量资料采用均数±标准差（?X±S）表示，各组数据采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t 法。p<0.05时差异有统计学意义。
3 结果
3.1高糖培养对胰岛β细胞PDC活性的影响
方差分析显示空白组、对照组和高糖组中E1活性差异有统计学意义（F=27.775，P<0.05）。与对空白组相比，高糖组的E1活性下降（P<0.05）；与对照组相比，高糖组E1活性明显降低（P<0.05）（表3）。由此表明，高糖刺激能够抑制E1的活性，进而引起胰岛β细胞内PDC损伤。
表3高糖培养对PDC活性的影响
分组样品例数?X±S (μg/mL)
空白组 4 13.9028±2.0445
对照组 4 21.6227±2.1827
高糖组 4 10.2096±2.3894 *#
3.2 PDC受损对乙酰辅酶A生成量的影响
采用siRNA技术沉默E1后，方差分析显示空白组、Scrambled
siRNA组及E1-siRNA组细胞核中乙酰辅酶A的生成量差异有统计学意义（F=159.703，P<0.05）。LDS-t法两两比较显示，空白组与Scrambled siRNA组，差异无统计学意义（P>0.05）；空白组与E1-siRNA组、Scrambled siRNA组与E1-siRNA组间，差异均有统计学意义（P <0.05）（表4）。由此表明，细胞转染后引起PDC损伤，影响了细胞核内乙酰辅酶A的生成。
表4 ELISA法中各样品中乙酰辅酶A含量
分组样品例数?X±S (μg/mL)
空白组12 1.7247±0.0309
Scrambled siRNA组10 1.7289±0.0301
E1-siRNA组10 1.0205±0.0340*#
与空白组比较p<0.05；与Scrambled siRNA组比较p<0.05
3.3染色质免疫共沉淀实时荧光定量核酸扩增技术（ChIP-qPCR）检测Islet1、Ins、Pdx1基因表达
由图1可见，细胞转染后E1-siRNA组的Islet1、Ins和Pdx1基因表达与Scrambled siRNA组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。PDC受损后Islet1、Ins和Pdx1基因表达较未受损的细胞相比明显受到抑制。由此可以表明PDC与β-TC6细胞的Islet1、Ins和Pdx1基因的组蛋白乙酰化有关。
图2 PDC受损对Islet1、Ins和Pdx1基因表达的影响
3.4 PDC受损对ISLET1、INS和PDX1蛋白的影响
Western Blot法检测细胞转染前后ISLET1、INS和PDX1蛋白水平，方差分析显示三组的ISLET1（F=112.786，P<0.05）、INS （F=372.091，P<0.05）、PDX1（F=170.793，P<0.05）的蛋白表达水平，差异均有统计学意义（表5）。LDS法两两比较显示，E1-siRNA 组与Scrambled siRNA组和空白组相比，三组蛋白的表达水平均降低（P<0.05）（图2）。由此说明，PDC受损细胞内的ISLET1、INS、PDX1的蛋白水平较PDC未受损时降低。
表5 PDC受损对胰岛素分泌相关基因蛋白相对表达量的影响（n=4?X±S ）蛋白种类空白组Scrambled siRNA组E1-siRNA组ISLET1/Actin 0.2267±0.0115 0.2100±0.0100 0.0867±0.0153*#
INS/Actin 0.4767±0.0153 0.4467±0.0058 0.2500±0.0100*# PDX1/ 0.4733±0.0153 0.4200±0.0173 0.2167±0.0120*#与空白组比较p<0.05；与Scrambled siRNA组比较p<0.05
ISLET1:胰岛素增强结合因子-1（Insulin gene enhancer binding protein 1）
INS:胰岛素（Insulin）
PDX1:胰岛素启动子因子-1（Pancreatic duodenal homeobox-1）
图2 各组胰岛β细胞中PDX1、ISLET1和INS蛋白表达电泳图
4 讨论
胰岛β细胞具有合成及分泌胰岛素的功能，是机体调节糖、蛋白质及脂肪代谢的重要保障[13]，其损伤程度是胰岛素分泌障碍发生发展的一个重要因素[14]。长期高糖会损伤胰岛β细胞，使胰岛素分泌障碍[15, 16]，本次研究发现长期高糖状态还会引起β-TC6细胞E1活性下降，
间接表明长期高糖状态会使PDC功能受损。
PDC作为丙酮酸转化为乙酰辅酶A的关键酶，与乙酰辅酶A关系密切，其损伤会直接影响乙酰辅酶A的生成[17, 18]。本研究采用siRNA技术沉默PDC后，检测β-TC6细胞核内乙酰辅酶A的生成量，发现E1-siRNA组的乙酰辅酶A的含量明显低于未处理组和Scrambled siRNA组。进一步证实PDC不但存在于线粒体中，它还存在于细胞核中，参与核内乙酰辅酶A的生成。该研究结果与Sutendra G等的研究结论一致[4]。核内的乙酰辅酶A又与组蛋白乙酰化密切相关，组蛋白乙酰化直接参与基因活化组蛋白翻译后修饰所引起的染色质结构重塑，在真核生物基因表达调控中发挥着十分重要的[19, 20]。进一步检测Islet1、Ins和Pdx1的基因表达发现PDC受损后细胞中Islet1、Ins和Pdx1的基因表达较未受损的细胞相比明显受到抑制。
ISLET1是最早的胰岛素增强结合蛋白，对于促进胰岛内分泌细胞发育、成熟和存活具有重要作用，可在胰腺内分泌细胞中高水平表达，并可通过与不同因子之间的相互作用，激活多种内分泌激素相关基因的转录[21]。INS是一种由胰腺β细胞分泌的蛋白质激素，也是机体内唯一降低血糖的激素。PDX1是胰岛β细胞分化中至关重要的转录因子，其主要功能是促进胰岛β细胞增殖，抑制胰岛β细胞凋亡，调节胰岛素基因等相关特异性基因的转录[22]。这几种蛋白都对于胰岛β细胞功能的稳定及糖尿病的发生、发展均具有重要意义。继续采用Western Blot法检测细胞转染前后ISLET1、INS和PDX1的蛋白水平发现PDC受损后细胞中的ISLET1、INS和PDX1蛋白表达水平明显较未受损者降低，并与基因表达结果相一致。
综上所述，高糖引起的β胰岛细胞内胰岛素分泌障碍与其细胞核内PDC损伤有关。PDC损伤抑制了核内乙酰辅酶A的生成，阻碍了组
蛋白的乙酰化，进而抑制了Ins基因转录起始，同时对其相关的调节基因也产生了抑制，最终引起INS分泌障碍。因此，维持PDC的活性可以直接或间接促进胰岛素及其分泌相关基因的转录，促进其相关蛋白的表达。该结论不仅为进一步探寻糖尿病的发病机制找的新的切入点，也为糖尿病的预防和治疗提供了新的靶点。
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真题回顾 【2002 - 22 生物化学A 型题】在三羧酸循环中，经底物水平磷酸化生成的高能化合物是 A. ATP B. GTP C. UTP D. CTP E. TTP 题目解析 在糖的无氧酵解和三羧酸循环中一共有三个底物水平磷酸化： 1,3-二磷酸甘油酸+ ADP →3-磷酸甘油酸+ ATP； 磷酸烯醇式丙酮酸+ ADP →丙酮酸+ ATP； 琥珀酰辅酶A + GDP →琥珀酸+ GTP。 故该题正确选项为B。 考点讲解 【2015 年西综大纲，生物化学，（二）物质代谢及其调节，2. 糖的有氧氧化（三羧酸循环）的过程、意义及调节】
一、三羧酸循环的过程 1. 在柠檬酸合酶的催化下乙酰辅酶A + 草酰乙酸缩合→柠檬酸。 2. 柠檬酸→顺乌头酸→异柠檬酸。 3. 在异柠檬酸脱氢酶的作用下异柠檬酸氧化脱羧→α-酮戊二酸。 4. 在α-酮戊二酸脱氢酶复合体的作用下α-酮戊二酸氧化脱羧→琥珀酰辅酶A。 5. 琥珀酰辅酶A 合成酶催化下琥珀酰辅酶A 经底物水平磷酸化→琥珀酸。 6. 琥珀酸脱氢酶作用下琥珀酸→延胡索酸。 7. 延胡索酸酶作用下延胡索酸→苹果酸。 8. 苹果酸脱氢酶作用下苹果酸→草酰乙酸。 二、总结 1. 反应5 为一次底物水平磷酸化产生GTP。
2. 每个循环消耗一分子乙酰辅酶A。 3. 反应3、4 两次脱羧，体内CO2 的主要来源。 4. 反应1、3、4 中三个关键酶柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶。 5. 反应3、4、8 脱氢由NAD+ 接受，反应6 脱氢由FAD 接受，共4 次脱氢。 6. 反应于线粒体内进行，乙酰辅酶A 起始产生10 ATP，丙酮酸起始产生12.5 ATP，葡萄糖起始产生30 / 32 ATP。 7. 三大营养物资的代谢通路，糖、脂肪、蛋白质联系的枢纽。 8. 反应1、3、4 为不可逆反应，其他为可逆反应。 三、三羧酸循环的意义 1. 三羧酸循环是三大营养物资的最终代谢通路 （1）糖、脂肪、氨基酸生物氧化后都会生成乙酰辅酶A，然后，其进入三羧酸循环进行降解。
丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号:BC0380 规格:50T/48S 产品内容： 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体1mL×1支，-20℃避光保存； 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：粉剂×1支，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 工作液的配制：临用前把试剂四、五、六、七转移到试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周。 产品说明： PDH（EC4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本的处理 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃11000g离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。 2、每个样本需要900μL工作液，按样本数加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中孵育5min。 3、空白管：在1mL比色皿中加入900μL工作液和50μL水，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和1min 后的吸光值A2，计算ΔA空白=A1-A2。 4、测定管：在1mL比色皿中加入900μL工作液和50μL样本，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。 三、PDH活性计算 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/g鲜重)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T =913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH活性(U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T =1.828×(ΔA测定-ΔA空白) V反总：反应体系总体积，9.5×10-4L； ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.05mL；
在高等植物中存在着多条呼吸代谢的生化途径，这是植物在长期进化过程中，对多变环境条件适应的体现。在缺氧条件下进行酒精发酵和乳酸发酵，在有氧条件下进行三羧酸循环和戊糖磷酸途径，还有脂肪酸氧化分解的乙醛酸循环以及乙醇酸氧化途径等(图5-2)。 图5-2 植物体内主要呼吸代谢途径相互关系示意图 一、糖酵解 己糖在细胞质中分解成丙酮酸的过程，称为糖酵解（glycolysis）。整个糖酵解化学过程于1940年得到阐明。为纪念在研究这一途径中有突出贡献的三位生物化学家：G.Embden,O.Meyerhof和J.K.Parnas，又把糖酵解途径称为EmbdenMeyerhofParnas途径，简称EMP途径（EMP pathway）。糖酵解普遍存在于动物、植物、微生物的细胞中。 （一）糖酵解的化学历程 糖酵解途径（图5-3）可分为下列几个阶段：
图5-3糖酵解途径 1.己糖的活化(1～9)是糖酵解的起始阶段。己糖在己糖激酶作用下，消耗两个ATP逐步转化成果糖-1，6二磷酸(F-1，6-BP)。 如以淀粉作为底物，首先淀粉被降解为葡萄糖。淀粉降解涉及到多种酶的催化作用，其中，除淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase)是一种葡萄糖基转移酶外，其余都是水解酶类，如α-淀粉酶(α-amylase)、β-淀粉酶(β-amylase)、脱支酶(debranching enzyme)、麦芽糖酶(maltase)等。 2.己糖裂解(10～11)即F-1，6-BP在醛缩酶作用下形成甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸，后者在异构酶(isomerase)作用下可变为甘油醛-3-磷酸。 3.丙糖氧化(12～16)甘油醛-3-磷酸氧化脱氢形成磷酸甘油酸，产生1个ATP和1个NADH，同时释放能量。然后，磷酸甘油酸经脱水、脱磷酸形成丙酮酸，并产生1个ATP，这一过程分步完成，有烯醇化酶和丙酮酸激酶参与反应。
货号：QS2103 规格：50管/48样丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。 测定原理： PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致600nm光吸收的减少。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：1mL×1支，-20℃保存； 试剂四：液体50mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，4℃保存； 试剂六：粉剂×1支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1支，4℃保存； 试剂八：粉剂×1支，4℃保存; 工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 样本的前处理： 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆 器或研钵匀浆。 2、将匀浆600g，4℃离心5min。 3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PDH（此步可选做）。 5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W， 超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体PDH活性测定。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm处，蒸馏水调零。 2、工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中孵育5min。 3、在1mL玻璃比色皿中加入50μL样本和900μL工作液，混匀，立即记录605nm处初始吸光 第1页，共2页
α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC0710 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体0.6mL×1支，-20℃保存； 试剂三：液体55mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：粉剂×1支，4℃保存； 试剂五：粉剂×1支，4℃保存； 试剂六：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂七：粉剂×1支，-20℃保存； 试剂八：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加入2mL双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃保存。 工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。 产品说明： α-KGDH（EC1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。 α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、α-KGDH的提取
称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4℃11000g离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零 2.空白管： 取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL 蒸馏水，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。 3.测定管： 取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。 三、α-KGDH活性计算 1.按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(Cpr×V样)÷T =1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr 2.按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 α-KGDH（U/g鲜重）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T =1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W 3.按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 α-KGDH活性（U/104cell）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×500)÷T
5 糖类分解代谢 一、名词解释 1、糖酵解途径：是在无氧条件下，葡萄糖进行分解，形成2分子丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应。 2、柠檬酸循环：是用于乙酰CoA中的乙酰基氧化生成CO2的酶促反应的循环系统，该循环的第一步反应是由乙酰CoA和草酰乙酸缩合形成柠檬酸。 3、糖的有氧氧化：糖的有氧氧化指葡萄糖或糖原在有氧条件下氧化成水和二氧化碳的过程。是糖氧化的主要方式。 4、磷酸戊糖途径：是指机体某些组织（如肝、脂肪组织等）种一个葡萄糖-6-磷酸经代谢产生NADPH和核糖-5-磷酸的途径。该途径包括氧化和非氧化两个阶段，在氧化阶段，葡萄糖-6-磷酸转化为核酮糖-5-磷酸和CO2,并生成两分子的NADPH；在非氧化阶段，核酮糖-5-磷酸异构化生成核糖-5-磷酸或转化为酵解中的两个中间代谢物果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸。 5、发酵：厌氧有机体把糖酵解生成NADH中的氢交给丙酮酸脱羧后的产物乙醛，使之生成乙醇的过程称之为乙醇发酵。如果将氢交给丙酮酸生成乳酸则叫乳酸发酵。 二、填空 1、糖酵解过程中有3个不可逆的酶促反应，这些酶是磷酸果糖激酶、己糖激酶和丙酮酸激酶。 2、3-磷酸甘油醛脱氢酶酶催化的反应是EMP途径中的第一个氧化反应。 3、糖酵解中催化作用物水平磷酸化的两个酶是磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶。 4、在糖酵解中提供高能磷酸基团，使ADP磷酸化成A TP的高能化合物是1,3-二磷酸甘油酸和PEP。 5、糖酵解在细胞的细胞质中进行，该途径是将葡萄糖转变为丙酮酸，同时生成ATP和NADH的一系列酶促反应。 6、丙酮酸还原为乳酸，反应中的NADH来自于3-磷酸甘油醛的氧化。 7、TCA循环的第一个产物是柠檬酸。由柠檬酸合酶，异柠檬酸脱氢酶，和α-酮戊二酸脱氢酶所催化的反应是该循环的主要限速反应。 8、TCA循环中有二次脱羧反应，分别是由异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶催化。脱去的CO2中的C原子分别来自于草酰乙酸中的C1和C4。 9、TCA循环中大多数酶位于线粒体基质，只有琥珀酸脱氢酶位于线粒体内膜。 10、丙酮酸脱氢酶系由丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙酰基酶和二氢硫辛酸脱氢酶组成。三羧酸循环过程中有4次脱氢和2次脱羧反应。三羧酸循环过程主要的关键酶是柠檬酸合酶；每循环一周可生成1个A TP。 11、磷酸戊糖途径可分为2阶段，分别称为氧化脱羧和非氧化的分子重排，其中两种脱氢酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄酸糖脱氢酶，它们的辅酶是NADP＋。 12、在磷酸戊糖途径中催化由酮糖向醛糖转移二碳单位的酶为转酮醇酶，其辅酶为TPP（焦磷酸硫胺素）；催化由酮糖向醛糖转移三碳单位的酶为转醛醇酶。转酮醇酶(transketolase)就是催化含有一个酮基、一个醇基的二碳基团(羟乙酰基)转移的酶。其接受体是醛，辅酶是TPP。转醛醇酶(transaldolase)是催化含有一个酮基、二个醇基的三碳基团(二羟丙酮基团)转移的酶.其接受体是醛,但不需要TPP. 13、植物中淀粉彻底水解为葡萄糖需要多种酶协同作用，它们是α-淀粉酶，β-淀粉酶，脱支酶，麦芽糖酶。 14、淀粉的磷酸解过程通过淀粉磷酸化酶降解α–1，4糖苷键，靠转移酶和脱支酶降解α–1，6糖苷键。 三、单项选择题 1、丙酮酸脱氢酶系是个复杂的结构，包括多种酶和辅助因子。下列化合物中哪个不是丙酮酸脱氢酶组分？ A、TPP B、硫辛酸 C、FMN D、Mg2＋ E、NAD＋ 2、丙酮酸脱氢酶系受到哪些因素调控？ A、产物抑制、能荷调控、磷酸化共价调节 B、产物抑制、能荷调控、酶的诱导 C、产物抑制、能荷调控 D、能荷调控、磷酸化共价调节、酶的诱导 E.能荷调控、酶的诱导 3、下述那种情况可导致丙酮酸脱氢酶系活性升高？ A、ATP/ADP比值升高 B、CH3COCoA/CoA比值升高 C、NADH/ NAD＋比值升高 D、能荷升高 E、能荷下降 4、三羧酸循环中有底物水平磷酸化的反应是： A、柠檬酸→α-酮戊二酸 B、琥珀酰CoA→琥珀酸（琥珀酸硫激酶） C、琥珀酸→延胡索酸 D、延胡索酸→草酰乙酸 E. 苹果酸→草酰乙酸 5、糖代谢中间产物中含有高能磷酸键的是： A、6-磷酸葡萄糖 B、6-磷酸果糖 C、1，6-二磷酸果糖 D、3-磷酸甘油醛 E、1，3-二磷酸甘油酸 6、1分子葡萄糖酵解时净生成多少个ATP？ A、1 B、2 C、3 D、4 E、5 7、磷酸果糖激酶的最强变构激活剂是： A、AMP B、ADP C、ATP D、2，6-二磷酸果糖 E、1，6-二磷酸果糖 8、糖的有氧氧化的最终产物是： A、CO2+H2O+ATP B、乳酸 C、丙酮酸 D、乙酰CoA A、磷酸戊糖途径 B、糖异生 C、糖的有氧氧化 D、糖原合成与分解 E、糖酵解 10、三碳糖、六碳糖与七碳糖之间相互转变的糖代谢途径是： A、糖异生 B、糖酵解 C、三羧酸循环 D、磷酸戊糖途径 E、糖的有氧氧化
糖酵解的关键酶——己糖激酶Hexokinase ，磷酸果糖激酶-1 PFK-1，丙酮酸激酶regulative factor：Insulin promotes the synthesis of three key enzymes 磷酸果糖激酶-1 PFK-1： 1)6- 磷酸果糖、1,6-二磷酸果糖、2,6-二磷酸果糖、ADP、AMP是变构激活剂。 2)ATP、柠檬酸及长链脂肪酸是变构抑制剂。 丙酮酸激酶： 1)1,6-二磷酸果糖、ADP是变构激活剂 2)ATP，乙酰CoA及长链脂肪酸是变构抑制剂。 丙酮酸氧化脱酸的关键酶——丙酮酸脱氢酶复合体 E1 TPP VitaminB1 E2 硫辛酸硫辛酸 coenzyme A 泛酸 E3 FAD Vitamin B2 NAD+ Vitamin PP Regulation：受催化产物ATP、乙酰CoA的抑制。AMP 、CoA 、NAD+增加乙酰CoA减少，酶激活 三羧酸循环的关键酶—— 1)柠檬酸合酶 2)异柠檬酸脱氢酶（高能状态-ATP多-的情况下受抑制，and vice verse ）， 3)α-酮戊二酸脱氢酶（类似丙酮酸脱氢酶复合体，3，5形式） 产物堆积抑制TCA，主要是ADP 、ATP 的变化。 Ca+ 可促进TCA 磷酸戊糖的关键酶——6-磷酸葡萄糖脱氢酶 受NADPH 的反馈抑制性调节 糖异生的关键酶——G-6-P酶，果糖二磷酸酶，磷酸烯醇式丙酮酸激酶(草酰乙酸磷酸烯醇丙酮酸)、丙酮酸羧化酶（丙酮酸草酰乙酸） 途径Ⅰ：果糖二磷酸酶（1，6二磷酸果糖G-6-P）G-6-P酶（G-6-P Glucose ）2,6-二磷酸果糖和AMP激活G-6-P酶，而抑制果糖二磷酸酶的活性而抑制糖异生 途径Ⅱ：丙酮酸激酶（磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸） 1，6二磷酸果糖是丙酮酸激酶的变构激活剂 增强糖异生，必要抑制糖酵解。 原料增加可促进糖异生，乙酰CoA可加强糖异生 丙酮酸羧化酶，辅基：生物素。需要Mg2+ 和Mn2+ 磷酸烯醇式丙酮酸有能量最高的高能磷酸键 糖原合成的关键酶——糖原合酶
可治性罕见病—丙酮酸脱氢酶E1-α缺乏症 一、疾病概述 丙酮酸脱氢酶缺乏症是一系列的较为常见的神经系统退行性病变，并伴随线粒体代谢异常的疾病，也是儿童高乳酸血症最常见的病因之一。其中，丙酮酸脱氢酶E1 -a缺乏症( pyruvate dehydrogenaseEl -a deficiency)是由于丙酮酸脱氢酶复合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDH complex)中E1 -a亚基的缺陷造成的。编码El-α亚基的PDHA1基因位于Xp22.1上[1]。该病呈X染色体连锁显性遗传，其临床表现和生化缺陷存在较大的异质性。该病尚无明确的发病率和患病率报道，多为散发病例，男女发病率大致相等。 PDH复合物是细胞核基因编码的线粒体基质多酶系统，催化依赖硫胺素的丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A，将糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化连接起来，在线粒体能量代谢中起重要作用。PDH复合物缺乏导致丙酮酸代谢障碍，造成乳酸堆积和能量生成不足，引起神经系统结构和功能异常。该复合物包括 3种酶：丙酮酸脱氢酶(E1酶)、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2酶)、二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3酶)。E1酶的作用是移除丙酮酸上的羧基，并把乙酰基转给E2酶。El酶的a亚基是其活性部位，并且参与组成PDH复合物的核心结构。El-a亚基的缺陷可造成ATP生成减少和丙酮酸盐堆积，PDHA1基因突变是PDH复合物缺乏最常见的病因。ATP缺乏导致的能量供应不足对脑组织影响较大。丙酮酸盐堆积可导致丙酮酸盐、丙氨酸、乳酸之间的平衡被打破，最终引起乳酸酸中毒。ATP缺乏常引起肌张力低下、肌无力或运动不耐受等[2]。 二、临床特征 PDH复合物缺乏症患者的临床表现呈高度的异质性，发病年龄可从胎儿期至成人各年龄阶段，症状可从新生儿期的致死性乳酸酸中毒，到慢性神经功能异常伴大脑发育不全。本病一般在婴儿期和儿童早期发病，临床表现较复杂，主要累及代谢和神经系统。可有胼胝体发育不良、婴儿痉挛、Leigh病、复发性共济失调、慢性神经病变等。病情轻重及存活时间的长短取决于乳酸酸中毒的严重程度。患儿残存的酶活性越低，临床症状出现越早，血乳酸越高，死亡越早[3]。 男性患者可归纳为3类表型：一种是严重的新生儿高乳酸血症和大脑发育
生物化学试题及答案( 4) 第四章糖代谢 【测试题】 一、名词解释 1．糖酵解( glycolysis ) 2．糖的有氧氧化 3．磷酸戊糖途径 4．糖异生( glyconoegenesis) 5．糖原的合成与分解6．三羧酸循环( krebs 循环) 7．巴斯德效应(Pastuer 效应) 8．丙酮酸羧化支路 9．乳酸循环( coris 循环) 10．三碳途径 二、填空题 21．葡萄糖在体内主要分解代谢途径有22．糖酵解反应的进行亚细胞定位是在23．糖酵解途径中仅有的脱氢反应是在底物水平磷酸化反应分别由 11．糖原累积症 12．糖酵解途径 13．血糖(blood sugar) 14．高血糖(hyperglycemin) 15．低血糖 (hypoglycemin) 16．肾糖阈 17．糖尿病 18．低血糖休克 19．活性葡萄糖 20．底物循环 、和 ，最终产物为。酶催化下完成的，受氢体是酶和酶催化。 24．肝糖原酵解的关键酶分别是、和丙酮酸激酶。 25．6—磷酸果糖激酶—1最强的变构激活剂是，是由6—磷酸果糖激酶— 2 催化生成，该酶是一双功能酶同时具有和两种活性。 26．1 分子葡萄糖经糖酵解生成分子ATP，净生成分子ATP，其主要生理意义在于。 27．由于成熟红细胞没有，完全依赖供给能量。 28．丙酮酸脱氢酶复合体含有维生素、、、和。 29．三羧酸循环是由与缩合成柠檬酸开始，每循环一次有次脱氢、 - 次脱羧和次底物水平磷酸化，共生成分子ATP。 30．在三羧酸循环中催化氧化脱羧的酶分别是和。 31．糖有氧氧化反应的进行亚细胞定位是和。1 分子葡萄糖氧化成CO2和H2O 净生 成或分子ATP。 32．6—磷酸果糖激酶—1有两个ATP结合位点，一是ATP 作为底物结合，另一是与 ATP亲和能力较低，需较高浓度ATP才能与之结合。 33．人体主要通过途径，为核酸的生物合成提供。 34．糖原合成与分解的关键酶分别是和。在糖原分解代谢时肝主要受的调控， 而肌肉主要受的调控。 35．因肝脏含有酶，故能使糖原分解成葡萄糖，而肌肉中缺乏此酶，故肌糖原分解增强时，生 成增多。 36．糖异生主要器官是，其次是。 37．糖异生的主要原料为、和。 38．糖异生过程中的关键酶分别是、、和。 39．调节血糖最主要的激素分别是和。
丙酮酸脱氢酶复合体 成都医学院?检验医学院检验一队4班任亮 摘要：丙酮酸脱氢复合体广泛存在于动物、植物和微生物体内。主要是附着于线粒体上。丙 酮酸脱氢酶复合体是2-氧（代）酸脱氢酶复合体中的一种。丙酮酸脱氢酶复合体是一种限 速酶。主要作用是催化丙酮酸不可逆的转变为乙酰辅酶A，同时将NAD+还原成NADH，后 者进入呼吸链产生ATP。丙酮酸脱氢酶复合体还使得糖的有氧氧化中的糖酵解途径和三羧 酸循环联系了起来。 关键词：丙酮酸脱氢酶复合体；调控机制；蛋白质的结构和功能 一、丙酮酸脱氢酶复合体的组成 丙酮酸脱氢酶复合体是由三种酶以及相应的辅助因子形成，因物种的不同其各种成分的所占比例不同。丙酮酸脱氢酶复合体的分子量为7×106kDa。 第一种酶为丙酮酸脱氢酶（E1），它的辅助因子是焦磷酸硫胺素（ThDP），所以这种酶是ThDP依赖型酶。它是以α2β2四聚体的形式存在。α、β亚单位的分子量分别是41和36kDa。 第二种酶为二氢硫辛酰胺转乙酰酶（E2），它的辅助因子是硫辛酸，所以这种酶是硫辛酸依赖型酶，它的分子量是52kDa。 第三种为二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3），它的辅助因子是FAD，所以这种酶是FAD依赖型酶，它的分子量是55kDa，是以二聚体的形式存在。 此外，在高等生物的体内还有丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）、E3蛋白结合酶（E3BP）和NAD+、CoA-SH。 二、丙酮酸脱氢酶复合体的结构 每个丙酮酸脱氢酶复合体是由30个E1、60个E2和12个E3构成的，其中60个E2相互紧密连接但是以非共价键的形式形成的核心部分，而每个E2的亚单位都是由形成核心部分的内部区域和形成外部延伸部分的“Super arm”构成的，所以一个丙酮酸脱氢酶复合体就会有60个外部延伸部分。E1是以非共价键的形式连接在E2的外部延伸部分的E1结构区域。E3则是通过E3连接蛋白与E2的核心部分相连的。 三、丙酮酸脱氢酶复合体的作用机制 在丙酮酸脱氢酶复合体总的催化反应中。首先是丙酮酸在Mg2+( Mg2+结合在 ThDP 的磷酸基团上)存在下脱去的羧基与丙酮酸脱氢酶的辅助因子ThDP 形成羟乙基OThDP, 丙酮酸脱氢酶与 ThDP在α、β亚单位之间的深沟内结合。然后，羟乙基被氧化并将乙酰基转移到 E2,，即二氢硫辛酸乙酰转移酶的硫辛酰基形成中间产物乙酸硫酰胺，同时释放出ThDP，接下来在二氢硫辛酸乙酰转移酶催化下，乙酰硫酰胺上的乙酰基从乙酰硫辛酰基转移给辅酶A ，形成乙酰辅酶A。最后二氢硫辛酸脱氢酶E3 与二硫化物结合，被还原的硫辛酸重新氧化并将氢递给它的辅基FAD。在氧化和脱羧过程中硫辛酸充当乙酰基载体和电子传递体。
生化名词解释1 1．氨基酸的等电点：当溶液在某一特定的pH值时，氨基酸以两性离子的形式存在，正电荷数与负电荷数相等，净电荷为零，在直流电场中既不向正极移动也不向负极移动，这时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点，用pI表示。 2．肽键：是指键，是一个氨基酸的α–COOH基和另一个氨基酸的α–NH2基所形成的酰胺键。 3．多肽链：由许多氨基酸残基通过肽键彼此连接而成的链状多肽，称为多肽链。 4．肽平面：肽链主链的肽键具有双键的性质，因而不能自由旋转，使连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上，此平面称为肽平面。 5．蛋白质的一级结构：多肽链上各种氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸序列。 6．肽单位：多肽链上的重复结构，如Cα–CO–NH–Cα称为肽单位，每一个肽单位实际上就是一个肽平面。 7．多肽：含有三个以上的氨基酸的肽统称为多肽。 8．氨基酸残基：多肽链上的每个氨基酸，由于形成肽键而失去了一分子水，成为不完整的分子形式，这种不完整的氨基酸被称为氨基酸残基。 9．蛋白质二级结构：多肽链主链骨架中，某些肽段可以借助氢键形成有规律的构象，如α–螺旋、β–折叠和β–转角；另一些肽段则形成不规则的构象，如无规卷曲。这些多肽链主链骨架中局部的构象，就是二级结构。 10．超二级结构：在球状蛋白质分子的一级结构顺序上，相邻的二级结构常常在三维折叠中相互靠近，彼此作用，从而形成有规则的二级结构的聚合体，就是超二级结构。 11．结构域：在较大的蛋白质分子里，多肽链的三维折叠常常形成两个或多个松散连接的近似球状的三维实体，即是结构域。它是球蛋白分子三级结构的折叠单位。 12．蛋白质三级结构：指一条多肽链在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步的盘绕、折叠，从而产生特定的空间结构。或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。维系三级结构的力有疏水作用力、氢键、范德华力、盐键（静电引力）。另外二硫键在某些蛋白质中也起着非常重要的作用。 13．蛋白质四级结构：由相同或不同的亚基（或分子）按照一定的排布方式聚合而成的聚合体结构。它包括亚基（或分子）的种类、数目、空间排布以及相互作用。 14．二硫键：指两个硫原子之间的共价键，在蛋白质分子中二硫键对稳定蛋白质分子构象起重要作用。 15．二面角：在多肽链中，Cα碳原子刚好位于互相连接的两个肽平面的交线上。Cα碳原子上的Cα–N和Cα–C都是单键，可以绕键轴旋转，其中以
生物化学试题及答案（4） 第四章糖代谢 【测试题】 一、名词解释 1．糖酵解（glycolysis）11．糖原累积症 2．糖的有氧氧化12．糖酵解途径 3．磷酸戊糖途径13．血糖(blood sugar) 4．糖异生（glyconoegenesis)14．高血糖(hyperglycemin) 5．糖原的合成与分解15．低血糖(hypoglycemin) 6．三羧酸循环（krebs循环）16．肾糖阈 7．巴斯德效应(Pastuer效应) 17．糖尿病 8．丙酮酸羧化支路18．低血糖休克 9．乳酸循环（coris循环）19．活性葡萄糖 10．三碳途径20．底物循环 二、填空题 21．葡萄糖在体内主要分解代谢途径有、和。 22．糖酵解反应的进行亚细胞定位是在，最终产物为。 23．糖酵解途径中仅有的脱氢反应是在酶催化下完成的，受氢体是。两个 底物水平磷酸化反应分别由酶和酶催化。 24．肝糖原酵解的关键酶分别是、和丙酮酸激酶。 25．6—磷酸果糖激酶—1最强的变构激活剂是，是由6—磷酸果糖激酶—2催化生成，该酶是一双功能酶同时具有和两种活性。 26．1分子葡萄糖经糖酵解生成分子ATP，净生成分子A TP，其主要生理意义在于。 27．由于成熟红细胞没有，完全依赖供给能量。 28．丙酮酸脱氢酶复合体含有维生素、、、和。 29．三羧酸循环是由与缩合成柠檬酸开始，每循环一次有次脱氢、 - 次脱羧和次底物水平磷酸化，共生成分子A TP。 30．在三羧酸循环中催化氧化脱羧的酶分别是和。 31．糖有氧氧化反应的进行亚细胞定位是和。1分子葡萄糖氧化成CO2和H2O净生成或分子ATP。 32．6—磷酸果糖激酶—1有两个A TP结合位点，一是ATP作为底物结合，另一是与ATP亲和能力较低，需较高浓度A TP才能与之结合。 33．人体主要通过途径，为核酸的生物合成提供。 34．糖原合成与分解的关键酶分别是和。在糖原分解代谢时肝主要受的调控，而肌肉主要受的调控。 35．因肝脏含有酶，故能使糖原分解成葡萄糖，而肌肉中缺乏此酶，故肌糖原分解增强时，生成增多。 36．糖异生主要器官是，其次是。 37．糖异生的主要原料为、和。 38．糖异生过程中的关键酶分别是、、和。 39．调节血糖最主要的激素分别是和。 40．在饥饿状态下，维持血糖浓度恒定的主要代谢途径是。 三、选择题
货号：MS2100 规格：100管/96样α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。 测定原理： α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和 NADH，NADH 在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存； 试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1瓶，-20℃保存； 试剂六：粉剂×1支，-20℃保存； 样本的前处理： 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研 钵匀浆。 2、将匀浆600g，4℃离心5min。 3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。 4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。 5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W， 超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体α-KGDH活性测定。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；现配现用； （2）在试剂六中加入1mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； （3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。 第1页，共2页
Science：α-酮戊二酸(α-KG)可抑制异柠檬酸脱氢酶-1基因(IDH1基因)突变型致命脑瘤 在特定的脑肿瘤中，存在着编码IDH1的杂合性突变，但是这种突变在肿瘤发展中的机制尚不得而知。我们发现，来源于肿瘤中IDH1的突变损害了此酶对它的底物的亲和力，并通过催化无活性的异二聚体形成，明显的抑制了野生型IDH1的活动。培养细胞中突变的IDH1的强制表达减少了酶产物α酮戊二酸（alpha-KG）的形成，并增加了缺氧诱导因子亚单位α（HIF-1α）的水平。缺氧诱导因子亚单位α（HIF-1α）是一种转录蛋白，能在低氧环境中促使肿瘤生长，它的稳定性能被α酮戊二酸调节。在含有IDH1突变的人类胶质瘤细胞中， HIF-1α的水平要明显高于那些不含IDH1突变的肿瘤细胞。因而IDH1似乎是作为一种肿瘤抑制因子而存在，一旦通过突变使之灭活，则可能会部分的通过 HIF-1α途径参与肿瘤的发生。 人类基因组有5种基因可以编码3种不同的IDH。其中IDH2和IDH3存在于线粒体中，参与三羧酸循环，只有IDH1存在于细胞质和过氧化物酶体中。有研究发现IDH1的突变是在R132位置存在一个单核苷酸取代了原来的精氨酸。 为了证明R132突变与肿瘤产生的关系，作者根据文献建立了IDH1的化学结构模型，发现R132的侧链和底物的α螺旋和β折叠之间形成3个氢键，而未变异的只形成2个氢键，这说明了R132的变异从空间的电子水平影响了酶与底物的结合。 比较在293T细胞中表达的三种R132上的变异，R132H;R132C;R132S。得出与野生型相比，他们的催化活性降低了大约80%。(方法：将在HEK393T 细胞中FLAG标记的野生型和突变型IDH1用免疫沉淀反应纯化，用FLAG肽洗脱；右图：HIS标记的野生型和突变型IDH1用镍树脂纯化)从大肠杆菌的纯化的重组R132同样显示出这种结果。这三种突变使IDH1与异柠檬酸盐的Km 值与野生型相比有很大的下降，但与NADP的Km值下降不明显，最大反应速率下降也不明显。可以得出IDH1突变使酶的活性和协同作用降低。 根据文献可知IDH1酶正常时应该是同二聚体形式，我们猜想IDH1突变的分子与野生型形成了异二聚体，为了验证这一假说，作者在大肠杆菌中用组氨酸标记的野生型IDH1和用FLAG标记的突变型共表达，用第一镍树脂提纯异二聚体。用凝胶过滤分离纯核野生，纯核突变和杂合突变。我们观察到WT:R132H 异二聚体展示出4%的活性。通常情况下，IDH1在催化过程中展示出3种不同的构象，我们的研究表明IDH1的突变影响了其构象的形成。这说明IDH1突变影响了他与异柠檬酸的亲和力。图2C说明降低了突变IDH1与异柠檬酸的协同作用。（异柠檬酸盐浓度不同时同二聚体和异二聚体的最大反应速率不同）
鱼丙酮酸脱氢酶（PDH）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 0.3U/L -15 U/L 使用目的： 本试剂盒用于测定鱼血清、血浆及相关液体样本中丙酮酸脱氢酶（PDH）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鱼丙酮酸脱氢酶（PDH）水平。用纯化的鱼丙酮酸脱氢酶（PDH）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入丙酮酸脱氢酶（PDH），再与HRP标记的丙酮酸脱氢酶（PDH）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体 复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸 的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的丙酮酸脱氢酶（PDH）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鱼丙酮酸脱氢酶（PDH） 浓度。 试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶 2 酶标试剂6ml×1 瓶8 标准品（24U/L）0.5ml×1 瓶 3 酶标包被板12 孔×8 条9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书 1 份 5 显色剂A液6ml×1 瓶11 封板膜 2 张 6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋 1 个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含 NaN3 的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 12 U/L 5 号标准品150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液 6 U/L 4 号标准品150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 3 U/L 3 号标准品150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 1.5U/L 2 号标准品150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液 0.75U/L 1 号标准品150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液
细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体在高糖引起的胰岛素分泌障碍中的作用机制 【摘要】目的探讨细胞核中的丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）在高糖引起的β细胞胰岛素分泌障碍中的作用机制。方法设立空白组、对照组（5.5mmol/L）和高糖组（33.3mmol/L）培养β-TC6细胞72h。采用丙酮酸脱氢酶（E1）活性检测试剂盒检测各组β-TC6细胞中E1活性。E1-siRNA转染细胞后，采用ELISA法检测各组核内乙酰辅酶A的变化情况；ChIP-qPCR法检测各组Islet1、Ins、Pdx1基因表达水平；Western blot法检测各组ISLET1、INS、PDX1蛋白表达水平。结果与对照组相比，高糖组β-TC6细胞E1活性降低，间接表明PDC 受损（P <0.05）；采用E1-siRNA处理后，核内乙酰辅酶A的生成量明显减少（P < 0.05）；细胞内的Islet1、Ins和Pdx1基因表达和蛋白水平均降低（P< 0.05）。结论高糖会引起PDC损伤，造成核内乙酰辅酶A生成减少，胰岛素及其分泌相关基因和蛋白水平降低，导致胰岛素分泌障碍。 【关键词】丙酮酸脱氢酶复合体；高糖；乙酰辅酶A；乙酰化；胰岛素分泌障碍 Mechanism of pyruvate dehydrogenase complex in nucleus in insulin secretion disorder caused by high glucose 【Abstract】Objective: To investigate effect of pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in the nucleus on insulin secretion deficiency of β-TC6 cells induced by high glucose condition. Methods:β-TC6 cell was cultured with blank group, control group (5.5mmol/L) and high glucose
生物化学试题1 一、填空题 21．葡萄糖在体内主要分解代谢途径有_____________、____________ 和 ____________ 。22．糖酵解反应的进行亚细胞定位是在 ____________，最终产物为____________。 23．糖酵解途径中仅有的脱氢反应是在____________酶催化下完成的，受氢体 是 ______,______ 两个。底物水平磷酸化反应分别由___________________酶 和 __________________酶催化。 26．1分子葡萄糖经糖酵解生成________分子ATP，净生成________分子ATP，其主要生理意义在于________________________ 。 27．由于成熟红细胞没有 ____________，完全依赖 ____________供给能量。 28．丙酮酸脱氢酶复合体含有维生素______,______,________,___________,_________。29．三羧酸循环是由____________与 ____________缩合成柠檬酸开始，每循环一次 有 _______次脱氢、_________次脱羧和_______次底物水平磷酸化，共生成分子ATP。30．在三羧酸循环中催化氧化脱羧的酶分别是____________和____________ 。 31．糖有氧氧化反应的进行亚细胞定位是____________和____________。1分子葡萄糖氧化成CO2和H2O净生成____________或____________分子ATP。 33．人体主要通过____________途径，为核酸的生物合成提供 ____________。 39．调节血糖最主要的激素分别是____________和 ____________ 。 40．在饥饿状态下，维持血糖浓度恒定的主要代谢途径是____________。 三、选择题 41．糖类最主要的生理功能是： A.提供能量 B.细胞膜组分 C.软骨的基质 D.信息传递作用 E.免疫作用44．关于糖酵解途径的叙述错误的是： A.是体内葡萄糖氧化分解的主要途径 B.全过程在胞液中进行 C.该途径中有ATP生成步骤 D.是由葡萄糖生成丙酮酸的过程 E.只有在无氧条件下葡萄糖氧化才有此过程45．人体内糖酵解途径的终产物： A.CO2和H2O B.丙酮酸 C.丙酮 D.乳酸 E.草酰乙酸 46．关于糖酵解途径中的关键酶正确的是： A.磷酸果糖激酶-1 B.果糖双磷酸酶-1 C.磷酸甘油酸激酶 D.丙酮酸羧化 酶 E.果糖双磷酸酶-2 47．糖酵解过程中哪种直接参与ATP的生成反应：