一、名词解释
1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。
2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。
3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。
4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。
5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。
6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。
7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。
8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。
9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。
10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。
12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。
13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。
14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。
15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。
16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。
17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。
18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。
19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。
20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
作用而进行分离的一种层析技术。)
22.蛋白质的部分水解: 不完全水解得到的水解产物使各种大小不等的肽段和单个氨基酸。
23.TaqDNA聚合酶: 存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。
24.探针: 在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。
25.引物: 在多聚酶链式反应中，用于引导脱氧核糖核酸合成的一段核苷酸序列。
26.包含体: 包埋病毒粒子具一定形状和大小的蛋白结晶体，在相差显微镜下呈现强的折光性，由单一多肽构成。
27.转基因动物: 通过基因转移技术获得的整合有外源基因的动物个体。
28.序列标签：基因组中任何单拷贝的长度在100～500bp之间的DNA序列，与核酸内切酶识别序列相关联。
29.基峰: 质谱图中表现为最高丰度离子的峰。
30.短通滤片:是一种能让短波方向的光透过,长波方向的截止的滤光片.
31.凝胶过滤: 利用凝胶的网状结构根据被分离物质分子大小进行分离的一种方法。
32.蛋白质的完全水解: 彻底水解得到的水解产物为各种氨基酸的混合物
33.末端脱氧核苷酸转移酶: 不需要模板，以dNTP为底物催化脱氧核糖核苷酸依次加到
DNA链(片段)3′-OH端的酶。
34.切口平移: 制备标记DNA的一种方法。先用DNA酶使DNA双链上形成不对称的切口，再利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切酶活性将切口处的5′-P-核苷酸逐个切除，同时其DNA聚合酶活性又不断将新的含标记的核苷酸按碱基配对原则加入形成新链，这样就使缺口不断向3′端移动，同时标记了DNA。
35.退火: 两条单链多核苷酸通过互补碱基之间的氢键形成双链分子的过程。可发生在同一来源或不同来源核酸链之间，可以形成双链DNA分子、双链RNA或DNA-RNA杂交分子。
36.瞬间表达：转染的DNA不与宿主染色体整合，不能随宿主基因组的复制而扩增，只是临时在一个相对短的时间内大量扩增，只能在细胞内维持两三天。
37.嵌合体：一种含有两种以上基因型组织的机体，可能是基因突变、染色体异常分离或移植的结果。
38.序列图谱：以某一染色体DNA上所含的全部碱基序列绘制图谱，包括：转录序列和非转录序列
39.分子离子：有机质谱分析中，化合物分子失去一个电子形成的离子
40.长通滤片: 是一种能让长波方向的光透过,短波方向的截止的滤光片.
41.基因敲入：利用基因同源重组，将外源有功能基因（基因组原先不存在、或已失活的基因），转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。
42.缺口平移: 缺口翻译法或切口平移法是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用E.coli DNA多聚酶I的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中从而形成高比活性的均匀标记的DNA探针。线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为缺口平移法的模版。
43.随机合成终止法
44.化学断裂法：化学断裂法化学断裂法是采用特殊的化学试剂，将DNA片段分别从特定碱基部分裂解，得到从同一标记端开始，以特定碱基结尾的一系列长短不一的DNA片段(Maxam、Gilbert，1977)。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳使它们按大小分离，根据放射自显影条带的相对位置和裂解专一性读出DNA序列。
45.有效成分：指一种混合物中，对生物体代谢或者化学反应起作用的成分。
46.杂质：物质分离过程中除所要的目的产物外的物质总称为杂质。
47.盐析: 在高盐浓度下，蛋白质溶解度随盐浓度的升高而降低的过程这种现象称为盐析。
48.盐溶：酶蛋白可溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度的升高而增加
49.塔板理论：塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。
时，不同物质在两相中的分布会不同。
50.启动子：在DNA分子中，RNA聚合酶能够结合并导致转录起始的序列。
55.报告基因(reporter gene)：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
61.转基因动物：是指基因组中整合有外源基因、外源基因能够表达并按孟德尔定律遗传
的一类动物。
62.转基因(transgene)：将外源基因整合入动物基因组中的操作。
63转染：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。
64.基因诊断：针对DNA和或mRNA的分子诊断，通过分析这些遗传信息分子的序列，
从而在分子水平上确定疾病的病因，具高度特异性。
65.基因治疗：利用现代分子生物学技术，将正常的基因导入患者靶细胞使其发挥作用以
纠正或补偿基因缺陷或将患者靶细胞异常表达的基因敲除或封闭以达到
对疾病进行治疗的方法。
66.自杀基因：某些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转
变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因
的肿瘤细胞“自杀”。这些基因也相应地被称为“自杀基因”。
67.旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而
且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。
68. CASPASE：是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白
酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基C端的肽键。
Caspase在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是
Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。
69.蛋白质组：一个基因组、一个细胞或组织或一种生物体所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学：是蛋白质组概念的延伸，是在整体水平上研究细胞内蛋白质组及其活动规律的科学。
70.差异表达：基因表达调控的一种方式。指在对信号或诱导物做出应答时，选择表达不
同的基因，或使基因的表达水平有所不同。
71.显微注射：直接用显微注射器将重组DNA注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核中
的方法。是转基因动物技术中将基因导入哺乳动物细胞的主要方法之一。
72.干细胞：具有无限制自我更新能力、同时也可分化成特定组织的细胞，在细胞发育过
程中处于较原始阶段。
73.酶的比活性：酶纯度的度量标志，是指在特定特定条件下，单位质量蛋白质或RNA 所具有的酶活力单位数。
74.提纯倍数：反应纯化方法的效率，纯化倍数=纯化后的比活/纯化前的比活。
75.分子杂交：一条DNA单链或RNA单链与另一条单链通过碱基互补形成双链分子的过程。
76.基因组：一个生物体的基因组是指包含在该生物的DNA（部分病毒是RNA）中的全部遗传信息，又称基因体(genome)。基因组包括基因和非编码DNA。
76.DNA序列标签：STS是基因组中任何单拷贝的长度在100～500bp之间的DNA序列，与核酸内切酶识别序列相关联。
77.SNP: 单核苷酸多态性, 是指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数
很多，多态性丰富。指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和
插入。
79.等电聚焦电泳：用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。
80.变性凝胶电泳：:在DNA、RNA或蛋白质等生物大分子发生变性(如使用十二烷基硫酸钠、尿素、乙二醛等变性剂)的条件下进行的凝胶电泳。
81.粘性末端: 当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时，就可在切口处留下几个未配对的核苷酸片断，即5’突出。这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。因此称这些片断具有粘性，叫做粘性末端。
82.质粒的不相容性: 细菌质粒分类的一种标准，指在无选择压力的条件下，亲缘关系密
切的不同质粒或同一不相容群的质粒不能稳定共存于同一宿主细胞，在细胞增殖过程中将有一种被排斥的现象。
83.稳定表达: 转染的DNA与宿主染色体整合，能随宿主基因组的复制转录和翻译，并被稳定遗传。
84.多克隆位点: 是包含多个（最多20个）限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。也称为多位点切头，是基因工程中藏用到的载体质粒的标准配置序列。在多克隆位点中，每个限制性酶切位点通常是唯一的，即他们在一个特定的载体质粒中只出现一次
85.基因打靶：是利用DNA同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因
重组，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（gene knock out）
和基因敲入（gene knock in）。
86.慢病毒：属于逆转录病毒科。慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因
组运输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。
这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。
87.短串联重复序列：是第二代遗传标志，染色体上的一种串联重复序列，重复单位是2-6
个核苷酸，具有高度多态性，又可以利用ＰＣＲ技术进行自动化
操作，因而为完成人类基因组计划中遗传图采用的主要遗传标志。
88.限制性酶切片段多态性：是第一代遗传标志一位置上由于核苷酸序列的差别而造成的
限制性内切酶酶切位点丢失而体现。
89. .荧光原位杂交：是一种物理图谱绘制方法，使用荧光素标记探针，以检测探针和分
裂中期的染色体活分裂中期的染色体或分裂间期的染色质的杂交。
荧光原位杂交图谱：用不同颜色标记的各种DNA序列（探针），与染色体上的互补序列杂交而不破坏染色体的整体形态，显微镜下观察、辨认荧光标记在染色体上
的定位而绘制的图谱。
90.连续克隆系（图）：是最重要的一种图谱，以序列标签为标志。
91.固相杂交: 是核酸分子杂交的一种，指液相中的核酸探针与固定在固相支持物的上的待测核酸片段进行杂交的过程，分为原位杂交和印记杂交两种。
92.液相杂交：是核酸分子杂交的一种，指待测核酸样品与探针在液相中发生杂交。
93.酶保护分析：主要用来检测染色质结构与功能状态的方法。当染色质结构致密，DNA 被组蛋白压缩很紧时，基因是不表达的，同时也对DNA酶不敏感。反之，结构蓬松、活跃进行基因表达的染色质，则易遭DNA酶的降解。
94.对角线电泳：用于分析混合物中某一组分对某些化学处理或光处理后变化的双向电泳技术。样品加样后先从一个方向进行电泳分离，经化学或光处理后，再以与第一次电泳垂直方向进行第二次电泳分离，则经过处理未被修饰的组分皆位于电泳图谱的对角线上。不在对角线处出现的多肽含有由于二硫键氧化而形成的半胱氨酸残基，由此可分析多肽中二硫键位置。
95.分光光度法：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
96.Ti质粒：是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环状双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。
97.Klenow片段：E.coli DNA聚合酶Ⅰ经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的，保存了5’-3’聚合酶和3’-5’外切酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。
98.分子离子：有机质谱分析中，化合物分子通过某种电离方式失去一个外层电价电子形成的带正电荷的离子，常用M.+表示。
99.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。
100.基峰：质谱图中表现为最高丰度离子的峰。计算各峰相对值时常以基峰为100.
二、填空
1.在生物大分子提取时，材料的选择原则是（含有效成分丰富、稳定性好）、（来源丰富，保持新鲜）（适合加工提取）和（有经济利用价值）。
2.YAC的三个主要功能成份分别是（端粒）、（着丝粒）和（ARS元件）。
3.从功能上可将Caspase分为（ICE亚类）、（凋亡启动亚类）和（凋亡效应亚类）三大类。
4.限制酶切割DNA后产生的切口有（平末端）、（3’粘性末端）和（5’粘性末端）三种形式。
5.印迹技术常用的固相支持物分别是（尼龙膜）和（硝酸纤维素膜）。
6.进行生物活性物质提取时，动物性来源主要有（）、（）、（）和（）。
7.Kozak规则表明在起始密码子上游的（-3 ）、（-6 ）和（-9 ）位置最好是G。
8.流式细胞仪用滤片减少荧光干扰，这些滤片分别是(长通滤片)、( 短通滤片)和( 带通滤片)。
9.基因工程中使用的连接酶有（T4 DNA连接酶）和（大肠杆菌连接酶），其中以（T4 DNA连接酶）更常用。
10.按杂交介质的不同可将杂交分为（固相杂交）和（液相杂交）两类。
11.生物活性物质提取时必需同时建立一套有效的检测手段，常用的技术有（PCR ）、（电泳技术）、（免疫标记技术）及（）。
12.转基因的三个层次分别是（细菌转基因）、（离体真核细胞转基因）和（生物转基因）。
13.流式细胞仪主要由（流动室和液流）系统、（激光源和光学）系统、光电管及检测系统、计算机和分析系统以及（细胞分选系统）系统等五部分组成。
14.连接酶连接目的基因和载体时需要能量，（T4 DNA连接酶）连接酶以ATP为能量形式，而（大肠杆菌连接酶）连接酶则以（NAD+ ）供能。
15.三种印迹技术的名称分别是（Southern）、（Northern ）和（Western ）。
16.细胞破碎的方法主要有（机械破碎法）（物理破碎法）、（化学破碎法）、（酶解法）。
17.转基因动物的主要用途有（疾病型转基因动物）、（利用转基因动物制药）、（动物改良型）和基础生物学研究。
18.流式细胞检测时三个重要的参数分别代表FS（前向散射）、SS（侧向散射）和FL（每条线路上的光强）。
19.连接酶（大肠杆菌连接酶）只能连接粘性末端，而（T4 DNA连接酶）即能连接粘端又能连接平端。
20.三种印迹技术检测的目的物分别为（Southern测蛋白）、(Northern—测RNA）和（western---测DNA）。
21.DNA序列测定的主要方法有（sanger法）、（Maxam-Gilbert化学降解法）、（基因芯片技术）及(PCR测序）等。
22.双脱氧合成终止法是在不同体系的底物中加入一种（ddNTP），在DNA合成过程中聚合酶随机终止合成反应，这个体系中每一条链都以（相应的ddNTP）结尾，经电泳后可（不同片段末端的ddNTP）读出DNA的序列。
23.化学断裂法利用特异的选择性试剂断裂DNA链，其中嘌呤选择试剂为（甲酸），嘧啶选择性试剂为（肼）。
24.PCR时，为了避免假阳性结果的出现需要分别做（阴性对照）、（阳性对照）和（试剂对照）三个对照。
25.PCR的一个循环包含（变性）、（退火）和（延伸）三个过程。
26.常用的测定蛋白质含量的方法有（凯氏定氮法）、（Lowry 法）、（紫外光谱吸收法）及（考马斯亮蓝染色法）等。
27.基因组计划所作的四张图分别是（物理图）、（遗传图）、（转录图）和（序列
图）。
28.遗传图作图时所用的遗传标记分别是（SNP ）、（STR）和（RFLP ）。
29.物理图作图的常用方法为（荧光原位杂交作图）、（限制性酶切作图）、（辐射杂交作图）及（稀有切点限制作图）。
30.原核细胞常用的四个表达系统分别是（大肠杆菌表达系统）、（链霉菌表达系统）、（芽孢杆菌表达系统）和（蓝藻表达系统）。
31.大肠杆菌表达载体构建时必要的顺式元件有（启动子和终止子）（核糖体结合位点）、（复制子）及（筛选标记）等。
32.活化的CASPASES是由同源（4）聚体组成，酶分子中含有（半胱氨酸）残基，作用的底物分子中含有（天冬氨酸）残基。
33.不连续电泳的三个效应分别是（浓缩效应）、（分子筛效应）和（电荷效应）。
34.转基因动物制备过程中，转基因的方法主要有（微量注射）、（胚胎干细胞法）、（生殖细胞载体法）、（逆转录和慢病毒转染法）、（精子载体法）、（受体介导法）等。
35.基因敲除技术是建立在（胚胎干细胞植入）、（胚胎显微操作技术）和（基因重组）三个技术的基础上的边缘技术。
36.酵母质粒载体的主要类型有（YIp）、（YEp）、（YRp）和（YCp）。
三、选择题
C 1.提出双脱氧法测DNA一级结构的科学家是
A Maxam
B Gilbert
C Sanger
D Chargaff
E Crick
A 2.原核表达系统中不包括
A 金黄色葡萄球菌
B 大肠杆菌
C 芽孢杆菌
D 蓝藻
E 链霉菌
C 3.构建真核细胞表达载体时不需要的顺式元件是
A 启动子
B 筛选标记
C SD序列
D 加尾信号
E 增强子
C 4.随机引物一般是由6个核苷酸组成的片段，原则上可设计多少种这样的引物
A 42
B 44
C 46
D 48
E 410
C 5.蛋白质序列测定时对蛋白质的纯度要求达到
A 95%
B 96%
C 97%
D 98%
E 99%
B 6.人类基因组计划是哪年开始实施的
A 1985
B 1990
C 1995
D 1997
E 2003
B 7.胰蛋白酶专一性位点是由下列哪种氨基酸年形成的肽键
A 甲硫氨酸
B 赖氨酸
C 苯丙氨酸
D 亮氨酸
E 苏氨酸
B 8.最早构建的质粒载体是
A pUC
B pBR322
C pUR278
D pGPD-2
E 柯斯质粒
C 9.转基因动物制备时，能使目的基因表达不影响邻近基因表达的元件是
A 启动子
B 增强子
C 绝缘子
D 沉默子
E Kozak序列
A 10. PCR引物设计时，按经验，引物自身存在的连续互补序列一般不超过
A 3bp
B 5bp
C 7bp
D 9bp
E 10bp
A 11.双脱氧合成终止法测DNA序列时，加A体系中所得到的DNA片段都是以哪个核苷
酸结尾
A A
B
C C G
D T
E U
C 12.原核细胞mRNA与核糖体特异结合的序列称为
A Kozak序列
B 启动子
C SD序列
D 起始密码
E 帽子结构
C 13.与分泌表达相关的元件是
A 启动子
B 核糖体识别位点
C 信号肽序列
D 报告基因
E 加尾信号
B 14.能检测不同细胞表达区别的PCR技术是
A 彩色PCR
B 差异显示PCR
C 原位PCR
D 不对称PCR
E 定量PCR D 15.蛋白质组成分析时，酸水解的主要缺点是破坏了下列哪种氨基酸
A 丝氨酸
B 脯氨酸
C 组氨酸
D 色氨酸
E 酪氨酸
E 16. 人类基因组计划是哪年完成的
A 1985
B 1990
C 1995
D 1997
E 2003
C 17. 胃蛋白酶专一性位点是由下列哪种氨基酸年形成的肽键
A 甲硫氨酸
B 赖氨酸
C 苯丙氨酸
D 亮氨酸
E 苏氨酸
D 18.植物基因工程中使用的基因载体是
A 质粒
B 粘粒
C 穿梭质粒
D Ti质粒
E F质粒
C 19.KOZAK序列作用是
A 启动子
B 核糖体结合位点
C 帽子结构
D 起始密码
E 绝缘子
C 20. PCR引物设计时，与非扩增区的同源性不能超过
A 50%
B 60%
C 70%
D 80%
E 90%
B 21.合成终止法测DNA序列时，不用的DNA聚合酶是
A DNA聚合酶I
B DNA聚合酶II
C TaqDNA聚合酶
D Klenow片段
E 测序酶
A 22.衰减子一般位于启动子与第几个结构基因之间
A 1
B 2
C 3
D 4
E 5
E 23.与氯霉素筛选相关的基因是
A 新霉素基因
B DAD基因
C 博莱霉素抗性基因
D HPH基因
E CAT基因
B 24.能检测目的基因片段缺失的PCR方式为
A 筑巢PCR
B 多重PCR
C 原位PCR
D 不对称PCR
E 反向PCR
A 25. 蛋白质组成分析时，碱水解的主要优点是破坏了下列哪种氨基酸
A 丝氨酸
B 脯氨酸
C 组氨酸
D 色氨酸
E 酪氨酸
A 26. 在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率高于多少时可称为一个多态性位点
A 1%
B 5%
C 10%
D 15%
E 20%
B 27.蛋白质氨基端测定时最灵敏的方法是
A 2，4－二硝基氟苯法
B 丹磺酰氯法
C Edman法
D 氨肽酶法
E 硼氢化锂法
E 28.基因工程中容量最大的载体是
A 质粒
B 噬菌体
C 病毒
D 粘粒
E 酵母人工染色体
C 29. 按Kozak规则，AUG－3、－6、－9位偏好的碱基是
A A
B
C C G
D U
E T
D 30.PCR引物设计时，其长度应在多少个碱基对范围内
A 5~15
B 10~20
C 15~20
D 15~30
E 20~30
A 31.Sanger建立的DNA测序技术是
A 合成终止法
B 化学断裂法
C 杂交法
D PCR法
E 基因芯片法
B 32.分泌表达时，在目的蛋白的N端融合一段
A 细胞内源蛋白
B 信号肽
C 序列标签
D 分子伴侣
E 内含子
A 33.与G－418筛选的相应基因是
A 新霉素基因
B DAD基因
C 博莱霉素抗性基因
D HPH基因
E CAT基因
B 34.可以产生大量单链DNA的PCR技术称作
A 共享引物PCR
B 不对称PCR
C 彩色PCR D定量PCR E 差异显示PCR
D 35.蛋白质组成分析时，碱水解的主要优点是保留了下列哪种氨基酸
A 丝氨酸
B 脯氨酸
C 组氨酸
D 色氨酸
E 酪氨酸
C 36.人类基因组计划是由哪位科学家发起的
A Williams
B Wilkins
C Dulbacco
D Kerr
E Venter
A 37. 蛋白质部分水解时，溴化氰特异性断裂的位点是
A 甲硫氨酸
B 赖氨酸
C 苯丙氨酸
D 亮氨酸
E 苏氨酸
A 38.基因工程中使用最广泛的基因载体是
A 质粒
B 噬菌体
C 病毒
D 穿梭质粒
E 粘粒
C 39.按Kozak规则，AUG+4位偏好的碱基是
A A
B
C C G
D U
E T
E 40. PCR引物设计时，G+C的含量应在
A 10~20%
B 15~25%
C 30~50%
D 40~50%
E 40~60%
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部