抗体的纯化
第一节硫酸铵沉淀法
基本原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
试剂及仪器
·组织培养上清液、血清样品或腹水等
·硫酸铵（NH4）SO4
·饱和硫酸铵溶液（SAS）
·蒸馏水
· PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一)
·透析袋
·超速离心机
· pH计
·磁力搅拌器
实验步骤
以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。
一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS）
将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）；
其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；
二、沉淀
1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片；
2、保留上清液并测量体积；
3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）；
4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。
三、透析
1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀；
2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；
3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。
应用提示
一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。
1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)；
2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；
3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液；
4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；
5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的；
二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；
三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。
参考文献
1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma
12, 135.
2、T.G.库珀着，徐晓利主译《生物化学工具》人民卫生出版社出版（1980），353。（夏泉）
表1.室温下硫酸氨饱和度由起始浓度（S1）提高到终浓度（S2）时需加硫酸氨的量（g/L）
0%
10%
20%
25%
30%
33%
35%
40%
45%
50%
55%
60%
65%
70%
75%
80%
90%
56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767
57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 649
29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 619
30 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 583
19 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 546
12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522
31 63 94 129 164 200 238 278 319 411 506
31 63 97 132 168 205 245 285 375 469
32 65 99 134 171 210 250 339 431
33 66 101 137 176 214 302 392
33 67 103 141 179 264 353
34 69 105 143 227 314
34 70 107 190 275
35 72 153 237
36 115 198
77 157
79
第二节DEAE离子交换层析法
基本原理
离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。
DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE 吸
附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可选择pH值大于待纯化抗体等电
点的缓冲液，此时抗体带负电荷可以通过电价键吸附于DEAE离子交换剂上，然后用增加盐浓度
的方法将抗体洗脱。可以用连续梯度法洗脱，也可以用不连续梯度（分段洗脱）法洗脱。本文以
腹水中mAb的纯化为例来介绍此方法。
试剂及仪器
·抗体样品（小鼠腹水或经硫酸氨沉淀的抗体）
· DEAE离子交换剂（阴离子交换剂）
·层析柱（2.5cm? ′ 20 cm）
·缓冲液A：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl
·缓冲液B：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl
·缓冲液C：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +500 mmol /L NaCl
·缓冲液D：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8
· PBS (见附录一)
·透析袋(MW CO 10 000)
·磁力搅拌器
·蠕动泵和部分收集器
·紫外检测仪
·梯度发生器
·电导仪
· pH计
·离心机
实验步骤
整个层析过程最好在4°C 进行,可在冷室操作；
1、抗体样品对缓冲液B 透析过夜（4°C）；
2、按说明处理DEAE离子交换剂。然后用缓冲液A 平衡。用20倍体积缓冲液A洗交换剂，可用过滤或离心法反复洗到流出液的电导率等于缓冲液A；
3、将处理好的DEAE离子交换剂悬浮在缓冲液A 中，装入层析柱。
4、用等体积的缓冲液D 稀释透析过的抗体样品，使之与缓冲液A 的离子强度一致；
5、稀释后的样品10 000′g 离心10 min（4°C），除去沉淀变性的蛋白质；
6、层析柱与蠕动泵、部分收集器及紫外检测仪连接；
7、抗体样品以1ml/min 流速上柱，然后用缓冲液A 洗柱1ml/min，将未吸附的蛋白质洗出。直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05；
8、吸附的蛋白质，用连续增加NaCl的浓度来洗脱。用线性梯度缓冲液（35-500 mmol/L NaCl）或分段缓冲液（35、70、140、280、500 mmol/L NaCl）洗脱。流速1ml/min ，分部收集洗脱液2ml / 管（图2-4-1）；
9、椐紫外检测结果，将抗体峰部分合并。装入透析袋对PBS(含0.2g/L叠氮钠)4°C 透析或冷冻（视抗体的稳定性而定）；
10、DEAE离子交换剂可按照商品说明再生使用。
图2-4-1 DEAE离子交换柱层析纯化小鼠IgG
流速：1ml/min 样品：0.5ml腹水
检测方法
1、大部分小鼠的单克隆抗体IgG可在50—200mmol/L NaCl浓度之间洗脱。
2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体存在及效价。实验要点及说明
1、要得到满意的分离结果，每ml DEAE 离子交换剂所加样品中蛋白质总量最好不超过10mg。
2、用经硫酸铵沉淀初步纯化的抗体代替小鼠腹水作为样品，可得到更好的纯化结果。
3、如抗体与DEAE离子交换剂不能有效的结合，可将起始缓冲液的pH提高0.1个单位,直到可以有效结合为止。
4、如果没有合用的蠕动泵和部分收集器，可用手工上样和收集。洗脱液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度计测定各管280nm波长的吸光度值。
5、该方法可按比例扩大。用适合于高流速的大柱和相应的交换剂来纯化大量的蛋白质样品。参考文献
1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography J. Immunol. Meth . 66, 75-79.
2、张保真编译西安医科大学出版（1986）《免疫组织化学理论与技术》69-71。
（夏泉）
第三节羟磷灰石层析纯化抗体
基本原理
羟磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]吸附蛋白质的机理，通常认为与其晶体表面的Ca2+ 和PO43- 两种基团相关。因为带电基团紧密排列于晶体表面，可能通过偶极子之间的相互作用来吸附蛋白质。样品被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液（较高浓度的盐溶液）冲洗，可使之解析。解析下来的物质在流经层析柱的过程中向前移动，遇到前面新的吸附剂可再被吸附。在反复的吸附—解析—再吸附—再解析的过程中，由于待分离物质与吸附剂之间的吸附能力不同，它们沿洗脱液流动方向移动的速度也不相同，所以在洗脱过程中各组分便会由于移动速度不同而被分离。抗体与其它蛋白质一样可以用羟磷灰石吸附柱层析进行纯化。
试剂及仪器
·抗体样品（腹水或培养上清液）
·羟磷灰石（Hydroxylapatite 有售）
·层析柱（2.5cm? ′ 20 cm）
·吸附缓冲液：20mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl
·洗脱缓冲液：500mmol/L 磷酸钾缓冲液pH6.8 含30mmol /L NaCl
· PBS (见附录1)
·透析袋(MW CO 10 000)
·磁力搅拌器
·蠕动泵和部分收集器
·紫外检测仪
·梯度发生器
·离心机
实验步骤
1、羟磷灰石柱的准备：将羟磷灰石悬浮于吸附缓冲液中，使之充分水合后装柱。用10′ 柱体积的吸附缓冲液洗柱；
2、样品的预处理：含抗体的样品先在4°C对吸附缓冲液透析过夜或用该缓冲液10倍稀释，再将透析或稀释后的样品4 000′g 离心15min（4°C）；
3、仪器安装：将蠕动泵、紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接；
4、上样：将样品上清液以1ml/min的流速加到柱上，然后用20′ 柱体积的吸附缓冲液洗柱；
5、抗体的洗脱：提高磷酸盐的浓度可以将抗体洗脱。常用的方法有两种：一种是用梯度发生器进行线性浓度梯度洗脱，浓度为20—500 mmol/L的磷酸钾缓冲液；另一种方法是用不连续浓度梯度洗脱，例如可以用35、70、140、280和500 mmol/L的磷酸钾缓冲液依次分段洗脱。收集洗脱液2ml / 管（图2-4-2）；
6、合并洗脱液中含抗体的部分（见下面检测）对PBS透析。根据抗体的稳定性4°C或冷冻
防腐（0.2g/L 叠氮钠）保存；
图2-4-2 羟磷灰石柱层析纯化单克隆抗体IgG
流速：1ml/min 样品：腹水1ml
检测方法
1、单克隆抗体IgG通常在200—400mmol/L磷酸钾浓度之间洗脱。
2、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA），检测各部分洗脱液的抗体。
应用提示
1、每100ml 羟磷灰石可吸附大约500 ml细胞培养上清液或3 ml 的腹水或血清中所含的抗体。
2、使用羟磷灰石柱较适合的柱长/直径可以在5/1—15/1之间（典型尺寸：2.5cm ?′20 cm 柱长）。
3、在吸附过程中应避免有对钙的亲和力大于磷酸盐的物质（如EDTA和柠檬酸等）的存在，以免减少羟磷灰石的吸附容量。
4、用过的羟磷灰石柱可以用吸附缓冲液平衡再生后重复使用。或加入甲苯（0.03%，v/v)或叠氮钠（0.2g/L）储存。
5、如果没有合适的蠕动泵和部分收集器，可手工加样和收集洗脱液2ml / 管，并用分光光度计
测定各管在280nm 波长的吸光度。
6、与本方法类似的吸附和洗脱过程也可用来纯化其它蛋白质。
参考文献
Bukovsky, J. and Kennett, R.H. (1987) Simple and rapid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydroxylapatite chromatography on analytical and preparative scales. Hybridoma 6 ,219-228.
（夏泉）
第四节抗体的辛酸纯化法
基本原理
在人、羊或兔血清或含有IgG的培养上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可与其中大部分蛋白质形成沉淀，而对IgG的性质没有影响，因此是纯化IgG的有效途径。沉淀后经离心即可获得IgG。辛酸沉淀法与硫酸铵沉淀法比较其主要优点为可减少聚合物的形成，但与其相同，所得的抗体纯度不够，还需用其它方法以进一步提高其纯度。
试剂及仪器
s 腹水或细胞培养上清
s 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）（见附录1）
s 1N HCl
s 辛酸（正-八碳酸，n-octanoic acid）
s 1N NaOH
s PBS（见附录）
s 透析袋（MWCO 10,000）
s 电磁搅拌器
s 离心机
操作步骤
1．用烧杯加20ml 0.06 mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.0）到10ml腹水或细胞培养上清中；2．用1N HCl调节pH到4.8，后滴加辛酸同时用力搅拌，具体用量参见表1；
3．在室温下继续搅拌30分；
4．5，000 ×g 室温离心30分，保留上清；
5．用1N NaOH 调节pH到5.7；
6．含有IgG的上清对PBS透析，然后分装、置-20℃保存。
表1 沉淀不同来源IgG的辛酸参考用量
IgG来源辛酸用量（每10ml腹水或上清）
小鼠400μl
人700μl
羊700μl
兔750μl
质量检察
上清中IgG的纯度可用SDS-PAGE分析及合适的酶标免疫测试法测定其免疫活性来确定。
上清中可能存在少量杂质，可通过DEAE离子交换层析除去。
参考文献
1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purification of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipitation. J. Immunol. Meth. 65,269-271
2. Steianbuch,M. and Audran,R. (1969) The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Arch.Biochem.Biophys. 134, 279-284
（朱正美）
第五节Sephadex凝胶过滤纯化抗体
基本原理
凝胶过滤又称分子筛层析。是一种借助分子筛效应将分子大小不同的混合物进行分离的方法。交联葡聚糖凝胶Sephadex是常用的层析介质。它是一种含有许多网眼的球形小颗粒，网眼大小分布均一。当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时，其中较大的分子不能进入凝胶网眼，将毫无阻力或阻力很小地随洗脱液流出，而小分子物则能扩散进入网眼，被阻滞在层析柱上，分子量越小，扩散出来所耗时间就越长。因此分子大小不同的MoAb可以借助分子筛效应进行分离提纯。本文以IgM的纯化为例介绍此方法。IgM因分子特别大（900 kd）而不能进入凝胶颗粒的网孔，可首先被洗脱达到初步纯化的目的。
试剂和器材
· Sephadex G 100 或G 200
·粗制IgM-MoAb培养物或抗血清，腹水等
·洗脱缓冲液：0.01mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl
·层析柱（1.0 cm? ′ 30 cm或1.5cm? ′ 40 cm）
·透析袋(MW CO 10 000)
·磁力搅拌器
·部分收集器
·紫外检测仪
·离心机
步骤
1、样品处理：将腹水、抗血清或培养上清液离心4000′g 20分钟，以除去细胞碎片。较稠的腹水和血清需适当稀释；
2、装柱：根据样品量选择合适的层析柱，将0.01mol/L pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl的Tris-HCl 缓冲液加到柱长的1/4处，然后将漂洗溶涨的Sephadex G 100 或G 200 倾入柱中，自然沉降30分钟，再用同样的缓冲液平衡柱1小时，流速0.5ml/min；
3、仪器连接：将紫外检测仪和部分收集器与层析柱连接；
4、上样和洗脱：待柱上平衡缓冲溶液接近凝胶上表面时，缓慢加入样品溶液0.5ml/min。当样品液面接近凝胶上表面时，加少量缓冲液清洗柱壁，然后接上缓冲液洗脱并收集1-2 ml/管。280nm 检测的第一蛋白峰即为IgM-MoAb。
5、浓缩与保存：将280nm检测的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力搅拌器上4°C对PBS 流动透析过夜。透析后的溶液可经聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥浓缩后，分装封管，-20°C 保存备用。
检测
1、可用SDS-PAGE 或定量免疫学方法（RIA、ELISA）检测各部分洗脱液的抗体。
2、IgM-MoAb一般在外水体积洗脱。
应用提示
1、凝胶过滤不变换洗脱液，一次装柱后可反复使用多次。操作简单，快速经济。
2、实验可重复性高，样品回收几乎可达100%，且方法温和，不易引起生物样品变性失活，可进行大量样品的分离纯化。
3、用于小分子物（如无机盐）从大分子物（MW>20 000）分离的层析柱，柱体积应大于样品体积4-10倍，其高与直径的比例应为5:1-15:1；用于大分子物之间的分离（如免疫球蛋白之间的分离），则柱体积应大于样品体积25-100倍，高与直径的比例应为20:1-100:1。
4、Sephadex凝胶装柱时，应灌制均匀无断层和气泡。在整个操作过程中，凝胶应始终保持在液面以下。
5、提取的IgM浓度过低或反复冻融会引起变性，应分装后在-70°C或-20°C冻存，或者加0.2g/L叠氮钠在4°C可保存数月。
6、如无合用的部分收集器，可手工收集1-2ml/管，用分光光度计测定各管吸光度值。
参考文献
1、周本正编着《层析技术及其应用》湖北科学技术出版社（1992）28-30
2、M.Z.阿塔西, C.J.范奥斯, D.R.阿勃索洛姆主编郑昌学,吴安然等译《分子免疫学》科学出版社(1988) 212-214
第六节免疫球蛋白G的亲和层析纯化法（蛋白A或蛋白G法）
基本原理
蛋白A是金黄色葡萄球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G组链球菌的细胞壁(cell wall)(cell wall)成分。这两种蛋白质分子可通过免疫球蛋白的FC区和大多数哺乳动物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的IgG结合(见表1)。利用基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技术，将蛋白A和蛋白G分子中与Fc区结合的结构域部分的基因融合，所产生的融合蛋白，则具有更广泛的IgG结合特异性。蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G与免疫球蛋白Fc段的结合性能使它成为可用于IgG分离的、天然的亲和配基。将这些配基蛋白结合到固体支持物上，提供了应用亲和层析纯化抗体的一步法的基础。
试剂及仪器
l 含IgG的样品
l PBS(见附录)
l 装有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型层析柱(有商品供应)
l 透析袋(MWCO 10,000)
l 结合缓冲液：0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 + 0.15mol/L NaCl
l 分步收集器(可按需要选用)
l 洗脱缓冲液:0.1mol/L Gly-HCl pH2.8+0.15mol/L NaCl
l 中和缓冲液：1mol/L Tris-HCl pH 8.0
l 蠕动泵(可按需要选用)
l UV监测器
l pH计
操作步骤
* 样品(可为血清、腹水、含有IgG的单克隆和多克隆抗体的细胞上清液)。
1．样品在4℃,对结合缓冲液透析过夜，或将其与至少1：1稀释的结合缓冲液混合；2．如果条件充许，将层析柱与蠕动泵、分步收集器和UV监测器相连；
3．至少用10ml结合缓冲液, 以1ml/min速度, 洗涤柱中的2ml亲和层析介质；
4．上样；
5．一旦样品进入凝胶，用结合缓冲液洗柱（至少10个柱体积），直至A280nm 小于0.03；6．用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG,分布收集2ml/管；
7．收集过程中,每管立即加入0.1ml中和缓冲液，以中和洗脱所得的IgG液。
8．含IgG的各管对PBS透析,其后根据抗体的稳定性,加入防腐剂(0.020g/L叠氮钠)，置4℃或冷冻保存。
实验要点及说明
通常可通过SDS-PAGE分析或通过适当的免疫方法 (如Western blot, ELISA等)，对洗脱组分进行纯度鉴定和免疫活性测定。
1. 上样量由层析柱的对特定免疫球蛋白的容量确定，2ml柱对于小鼠IgG 的容量约10mg，对于人IgG的容量约为18mg；
2. 柱上结合的抗体被洗脱的速度很快, 通常在第一洗脱流份中；
3. 下列缓冲液也可用为结合缓冲液：含0.15mol/L NaCl的50mmol/L硼酸钠pH8.0,或含0.15mol/L NaCl的0.1 mol/L 磷酸盐液pH7.5。高盐结合缓冲液（>1 mol/L NaCl）可能增加总的柱结合容量约50%；
4. 应用pH8.0-9.5的缓冲液作为结合缓冲液，通常能增加蛋白A对小鼠IgG的结合力；
5. 对于蛋白G的层析柱，可用低pH的结合缓冲液,如pH5.0含0.15 mol/L NaCl的50mmol/L 醋酸缓冲液；
6. 对pH敏感的抗体,需用比较温和的洗脱液, 如:含0.2mol/L NaCl的0.1mol/LTris-醋酸pH
7.7或3mol/L KCl或5.0mol/L KI或3.5mol/L MgCl2；
7. 蛋白G也能与IgG的CH1区结合,所以不能用于F(ab’)2与Fc的分离；
8. 如果无蠕动泵和部分收集器可用,也可利用重力进行上样及洗脱,手动收集2ml / 管,用分光光度计测定280nm的吸光度。
参考文献
1. Bjorck,L, And Kronvall,G. (1984) Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG binding reagent. J. Immunol. 133,969-974
2. Eliasson,M.,Olsson,A.,Palmcramtz,E.,Wiberg,k.,Inganas,M.,Guss,B.,Lindberg,M., and Ulldh,M.(1988)Chimeric IgG-binding receptor engineered from staphylococcal protin A and streptococcal protein G.J.Biol.Chem.263,4323-4327.
（张文利、朱正美）
第七节应用酶解从IgG 制备F( ab’)2的方法
基本原理
本文介绍应用胃蛋白酶及菠萝蛋白酶从IgG 制备F( ab’)2的方法。这两种酶均在免疫球蛋白的绞链区双硫键的下方分解IgG（见图1），裂解产物为三个片段，即两个相同的Fab段和一个Fc段，Fab段即抗原结合片段，含有一条完整的轻链和半条重链，分子量约50000。首选的酶是胃蛋白酶，它在IgG的绞链区二硫键的近C末端切断重链，生成大、小两个片段，大片段为Fab双体，称为F( ab’) 2，其功能与Fab相同。胃蛋白酶可用于大多数的小鼠的IgG１及IgG２a以及大鼠、人和兔的IgG抗体制备F( ab’)2，但不能用于小鼠的IgG２b 抗体。应用本法，可通过HPLC测定组分的大小来判定水解的程度。F( ab’) 2组分在分子量100000部分洗脱，而IgG则在分子量150000的流分中。
由于小鼠IgG１抗体抗胃蛋白酶，或使酶水解为较小的肽段，因此可采用菠萝蛋白酶，或经
过预试来选择确定合适的蛋白酶。
图2-7-1 IgG不同蛋白酶水解部位示意图
试剂及仪器
l 0.2mol/L TE8: 0.2mol/L Tris-HCl pH8.0 + 10mmol/L EDTA，按要求稀释到20mmol/L TE8
l 2mol/L 醋酸, pH3.7：103ml冰醋酸+ 17.2 克醋酸钠用蒸馏水配至1L
l 70mmol/L 醋酸/ NaCl ，pH4.0：70m mol/L ,50m mol/L ,pH4.0 (22ml 冰醋酸, 1.15克醋酸钠，2.29克NaCl，用蒸馏水配至1L
l 胃蛋白酶：10mg/ml 胃蛋白酶溶于70m mol/L 醋酸/ NaCl液pH4.0，现用现配
l 1 mol/L Tris pH9.2 (121克Tris碱溶于1L蒸馏水，以HCl 调至pH9.2)
l 50m mol/L TE7：50m mol/L Tris-HCl pH7.0 + 2 mol/L EDTA
l 2-巯基乙醇
l 碘乙酰胺储存液：50 mmol / L碘乙酰胺液
l 50m mol/L TE7碘乙酰胺应用液：（加1%体积的碘乙酰胺储存液到50m mol/L TE7中，现用现配
l 菠萝蛋白酶：10mg/ml 的50m mol/L TE7液，在临水解前配制。加入2-巯基乙醇至终浓度为0.5μmol/L ，在37℃保温15分钟，以使酶活化
l 10，000 MWCO滤膜的浓缩装置
l 分级范围10000-250000的分子排阻层析HPLC 系统
l 可分离150000蛋白质的凝胶过滤（分子排阻）柱。可用两根直径2.5cm、凝胶床高80cm 的柱子***，以30ml/小时的流速，来分离10-100mg的IgG
l 水浴
l 透析带（10000 MWCO）。用前在含0.1mmol/L EDTA的蒸馏水中煮沸、清洗
操作步骤
（一）酶解IgG样品的用量
通常酶解50-200mg IgG ，可生成20-100mg F(ab’)2。对于新抗体，可先用5-15 mg 试做，以确定所用酶对抗体的水解能力；
（二）IgG的浓度及予处理
将IgG浓缩到10-15 mg/ml ，为进行胃蛋白酶水解，IgG要先对0.02 mol/L TE8 透析，为进行菠萝蛋白酶水解，IgG要先对50mmol/LTE7 透析；
（三）胃蛋白酶水解法
1．用2 mol/L醋酸（pH 3.7）将抗体液的pH 调到4.0-4.2，将胃蛋白酶终浓度稀释到30g/L （W/W）;
2．在37℃水浴中保温酶解。每次取样10μl 通过HPLC测定水解组分的分子大小。在水解过程中，HPLC测定的洗脱峰应从IgG的单峰变成两个峰，分子量小的组分是F(ab’) 2。水解通常需要6-12小时；
3．当水解到IgG浓度〈100g/L，或F(ab’) 2峰的大小不再增加时，加入1 mol/L Tris （pH 9.0），调节反应液到pH 8.0，以终止反应。
（四）菠萝蛋白酶水解法
1．向抗体溶液中加入已活化的菠萝蛋白酶液，达到需要的浓度。对不同抗体，所需的酶浓度要先用预实验来确定，一般的酶浓度在5-40g/L (W/W)之间；
2．反应过程中，同胃蛋白酶水解法一样，用HPLC来监测水解的程度；
3．当水解到IgG浓度〈100g/L ，或F(ab’)峰的大小不再增加时，加入碘乙酸至终浓度0.5m mol/L ，终止反应。
（五）产物F(ab’) 2的分离
1．用经过0.2 mol/L TE8 平衡的凝胶过滤柱，按分子量大小来分离水解组分;
2．分离后，将分子量100000的F(ab’) 2 峰合并、浓缩.
图2-7-2 产物F(ab’) 2 与IgG的分离
实验要点及说明
1．胃蛋白酶的活性对pH高度敏感，在最适pH范围外，pH下降其活性会明显增加，pH 上升，其活性则会明显下降；
2．大多数的IgG1的水解需6-12小时。也可将水解液置4℃水解过夜。小鼠IgG3 很难被
酶解消化成F(ab’) 2；
3．当需要完全不含IgG 或Fc段的F(ab’) 2时，水解产物还需通过抗- Fcγ免疫吸附柱纯化（请参阅参考文献1），或通过蛋白A-琼脂糖柱纯化；
4．水解的程度也可通过非还原性的７.５％SDS-PAGE与考马氏蓝染色来测定。
参考文献
１．Glennie, MJ., Tutt, AL. And Greenman, J. (1993) Preparation of multispecific F(ab’)2 and F(ab’)3 antibody derivatives. In Tumor Immuology. A Pratical Approch (eds. Gallagher, G., Rees, RC. And Reynolds, CW.). pp.225-244. Oxoford University Press.
2. Lamoyi, E. And Nisonoff, A. (1983) Preparation of F(ab’)2 fragments
From mouse IgG of various subclasses. J. Immunol. Meth. 56, 235-243.
（朱正美）
第八节从F(ab’)2制备Fab’
基本原理
在F(ab’)2绞链区的双硫键可用巯基乙醇使之还原，得到具有游离SH基的Fab’，随后可用碘乙酸使Fab的游离SH基烷基化，从而防止其再氧化生成F(ab’)2。
试剂与设备
l 0.2 mol/L TE8: 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 + 10m mol/L EDTA
l 2-ME 还原溶液：220mmol/L 2-巯基乙醇＋１mmol/L EDTA （在通风橱中配置此溶液）
l 250mmol/L 碘乙酸: 250mmol/L 碘乙酸储存液
l HPLC系统及凝胶过滤柱（同前）
l 透析袋。经过在含0.1mmol/L EDTA水中煮沸及冲洗
操作步骤
1. F(ab’)2的浓缩：将所得的F(ab’)2液浓缩到0.5-15mg/ml 范围；
2. 还原：
（1）向F(ab’)2液中加入1/10 体积的2-巯基乙醇还原液（终浓度为20m mol/L 2-巯基乙醇）；
（2）在25℃水浴中保温30分钟；
（3）加入1/10 体积的250m mol/L 碘乙酸，以封闭游离的SH基；
（4）在25℃水浴中保温10分钟；
（5）用HPLC分析法，通过比较F(ab’)2原液与还原生成的Fab’的量，来检测还原度。Fab’在F(ab’)2之后被洗脱，使得洗脱的峰形改变（见图1）。Fab’的分子量为50000；
（6）在大多数的情况下，大于950g/L的F(ab’)2被还原为Fab’。
3. Fab’产物的分离：
（1）如果在制备液中仅存在少量的未还原的F(ab’)2，是符合实验需要的，残余的2-巯基乙醇和碘乙酸可通过对缓冲液透析以除去；
（2）如果还原不够充分，或需要Fab’完全与未还原的F(ab’)2分离，则可在0.2 mol/L TE8液中通过凝胶过滤法进行分离，合并、浓缩分子量为50000的Fab’峰。
图2-7-4 Fab’产物与F(ab’)2的分离（图240）
实验要点及说明
1. 上述操作也会使IgG的部分重链双硫键还原，但因非共价相互作用还可维持重链与轻链的连系，故不影响Fab段与重链的结合性能。然而，在非还原性SDS-PAGE分析图谱中，则可看到完整的Fab’（分子量大约50000Da）及轻链（大约25000Da）两条条带；
2. 可用100g/L的非还原性SDS-PAGE，来检测反应液中F(ab’)2的还原程度。F(ab’)2条带约分子量100000Da，Fab’在50000 Da，而已还原的重链及轻链分子量为25000 Da ，条带容易分辨。
参考读物
Glennie, MJ., McBride, HW,. Worth, AT. And Stevenson, GT. (1987) Preparation and performance of bispecific F(ab’γ)2 antibody contain ing thioether-linked Fab’ fragments. J. Immunol. 139, 2367-2375.
第九节免疫球蛋白A 纯化
基本原理
免疫球蛋白A（IgA）可由多种组织和器官产生，如粘膜，骨髓，淋巴结等。血中IgA以单
体或聚合体形式存在，含量约为210±80mg，骨髓瘤病人血清中IgA水平增加。IgA分IgA1和IgA2两种亚型，其中IgA1亚型占总IgA的90%以上，并在铰链区结合有特征性的O—连接寡糖链。（见第六篇，第二章）。实验中常需对总IgA及IgA1亚型进行分离、纯化和鉴定。IgA纯品价格昂贵，如能自己制备，则可节省资金。
一、IgA的抗体亲和层析分离
原理
利用IgA抗体对IgA抗原的特异结合特性。溴化氰活化的Sepharose-4B凝胶与多克隆抗IgA 抗体，或抗IgA1亚型单抗共价交联制备亲和层析柱。经亲和柱分离，即可得到总IgA或IgA1亚型纯品。
试剂和仪器
l 多克隆抗IgA抗体，或抗IgA1亚型单抗
l 抗体—Sepharose-4B偶联胶：制备过程参见（第二篇，第一章），或购买成品胶
l 0.22μM微孔滤膜
l 层析柱
l 0.01mol/L硼酸钠，pH 8.0
l 0.25mol/L甘氨酸—盐酸缓冲液，pH 2.7
l Tris-HCl缓冲液，pH 8.0
l PBS缓冲液
l 保存液：含0.02% NaN3 的0.01mol/L硼酸钠，pH 8.0
l 试管
l 紫外分光光度仪
l 离心机
操作步骤
1. 收集5ml血清，27,000g，4℃离心30min。上清经0.22μM微孔滤膜过滤，-20℃保存，或直接应用。
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法： 基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白； 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐； 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱； 5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度； 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa 基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体； 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节； 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂； 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液； 5.用PBS透析；
抗体ProteinA纯化 一．P roteinA柱子的制备 1.配制溶液； 结合／洗涤缓冲液：NaCl，0.5M ；Na2HPO4，20mM ；PH8.0。 配制500ml的方法： 称取NaCl 4.383g，Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。 2. 制备空柱子 （1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。 （2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。 （3）在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。 （4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。 （5）加入5ml的ProteinA到柱子中。 （6） （7） （8） 二．纯化步骤 1.样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。 2.平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 3.上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 4.洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。 5.收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中不含蛋白。 测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。（注意：收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活） 6.柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。 7.PBS透析收集的抗体。 三．试剂的制备 1. 结合缓冲液1000ml 500ml 甘氨酸112.6g 56.3g 氯化钠175.2g 87.6g 氢氧化钠调PH至9.0 2. 洗脱缓冲液500ml
一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤： （1）新柱子先用DDW 5ml过柱； （2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上； （4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （5）5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性； （6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （7）5倍柱体积20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱； （8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方： DDW：超纯水 Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠61ml B液，0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤： （1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5 （2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积； b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀； c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解； d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋 白充分沉淀； e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解； （3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方： PBS缓冲液（1L pH 7.0）：氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g
生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ·技术与方法· ２００８年第３期 收稿日期：２００７－１１－１９ 基金项目：内蒙古自治区自然科学基金重大项目（编号２００４０８０２０４０２）作者简介：侯越（１９８２－），男，硕士研究生，研究方向：动物学生物技术通讯作者：吴应积，教授 引言 抗体是一种特殊的蛋白质分子，被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等，在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析结果的灵敏度、 特异性起着至关重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新基因产物的研究中，是否拥有相应的抗体以检测与鉴定新基因的产物蛋白质，是整个研究工作能否深入开展的关键。 抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面，广泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗体———血清多克隆抗体开始，它就在疾病治疗和体外诊断中发挥了很大的作用。由于免疫动物制备血 清抗体的免疫原性和非均质性，给抗体研究和应用造成了困难［１］，激发了人们对抗体进行深入研究的热情。１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ通过杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗体—— —单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭｃＡｂ），是均质的异源抗体［２］。单克隆抗体具有高度均质性、高度特异性，促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性，是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的出现，引起了生物学理论的革命，生物学技术的广泛应用提供了重要的工具［３］。２０世纪８０年代采用基因工程的手段研制抗体，并对抗体的基因进行改造和重组等，制备出第三代抗体——— 基因工程抗体（ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙＧＥＡｂ）。基因工程抗体主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造，并 抗体分离纯化技术的研究进展 侯越 罗奋华吴应积 （内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特０１００２１） 摘 要： 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础，抗体质量的高低，将直接影响试验的成败。抗体 的制备有两个途径：一是一般通用的方法，以纯化的抗原免疫动物，获得多克隆抗体；二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。 关键词： 抗体 分离 纯化 ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ＨｏｕＹｕｅＬｕｏＦｅｎｈｕａＷｕＹｉｎｇｊｉ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＣｈｉｎａｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｉｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｓｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｅｐａｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｈａｓｔｗｏｗａｙｓ：ｏｎｅｉｓｃｏｍｍｏｎｌｙｃｕｒｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄ，ｔｏｂｅｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｖｉａｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇａｎｉｍａｌｓｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｇｅｎ；ｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｕｓｉｎｇｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｗｈａｔｅｖｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｕｓｅｄ，ｔｈｅｐｒｅｐａｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｎｅｅｄｓｔｏｂｅｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｃｈｏｏｓｅｔｈｅｐｒｏｐｅｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｏｕｒｃｅｏｆｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｉｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＩｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为～，间隔３～５周再同样注射一次，
１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原～，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。 B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。 2、免疫动物； 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/ c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。 大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。 免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。 正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生×107~×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。 B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。 3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； 脾细胞制备 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。 (2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；
二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma
用 户园地Q & A 30 鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相 互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析 即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体 纯化提供很好的解决方案。然而要得到高质量高纯度的抗 体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法 上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。 1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品， 有哪些样品处理的方法？ 在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白，酚红，小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然 并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质 上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如 硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到 合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。 2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG 还是ProteinA？ 首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的 IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料，结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。 若实验室有AKTA系统，那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。 若没有AKTA系统，MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利，试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱，结合，洗脱和中和的缓冲液，一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。 Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱，和标准的小离心机一起使用，仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。 ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。 3，面对ProteinA如此多的配基形式，它们有何区别 和应用？ 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他 杂蛋白流穿，具有极高的选择性，通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。 ProteinA sepharoseCL-4B，是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上，可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。 nproteinA sepharose4FF，nprteinA即为天然 (Native Protein A)，表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。 rproteinA sepharose4FF，重组的蛋白A (rProtein A)， 经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。 rmpProteinA，多位点附着的技术，保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。 2005年我们推出了新一代的MabSelect ，是第一个使 用高流速琼脂糖凝胶 ( High ?ow Agarose) 作为骨架的新型 蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计。相比传统 抗体纯化常见问题回答
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抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；
二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
抗体的纯化：盐析法 发布时间：2009-02-18 新闻来源： 精制抗体的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 1、试剂 （1）正常人混合血清；灭菌生理盐水。 （2）饱和硫酸铵溶液的配制 称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。 （3）萘氏试剂配制 称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。 （4）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制： 贮存液 A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液：0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。 （5）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制 将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。 （6）20%磺基水杨酸。
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料就是腹水与细胞培养上清,而通常经过免疫制备 : 抗体非还原型PAGE/kDa 还原型PAGE/kDa IgG 150 50,25 IgM 900 65,25 IgM单体180 65,25 硫酸铵沉淀法: 基本原理:高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜,降低球蛋白的溶解性,就是分离免疫球蛋白的常用方法,而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别,一般用来分离抗体的硫酸铵饱与度在33~50%。 适用于:鼠抗所有亚类、其她种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作: 1、过滤、离心腹水或者培养上清得上清; 2、加入饱与硫酸铵至终浓度45%,静置沉淀蛋白; 3、沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解,用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐; 4、过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱,PBS或硼酸盐(含0、02%叠氮钠)缓冲液洗脱; 5、电泳检测分子量大小,分光光度法测定抗体浓度; 6、抗体保存浓度在0、1-30 mg/mL适宜,-20 ℃保存不超过一个月,避免反复冻融。 亲与层析法 基本原理:基因工程改造的protein A与protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段,将protein A与protein G结合到柱料上,通过亲与层析的方式,可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍:protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁,分子量42 kDa,由spa基因编码,具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域,每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图： 单克隆抗体制备（免疫2-3月，总周期4-6月） 准备抗原 动物免疫选择免疫动物 Elisa测抗血清 细胞融合（融合剂:PEJ） HAT培养基筛选杂交瘤细胞 筛选阳性细胞 （三天内做完流式） 阳性克隆并扩大培养细胞冻存 扩大培养收集上清 单克隆抗体纯化保存 （一）抗原提纯与动物免疫 对抗原的要求是纯度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如为细胞抗原，可取1×107个细胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐剂并经充分乳化，如为聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原，可将抗原所在的电泳条带切下，研磨后直接用以动物免疫。选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在8～12周，雌雄不限。为避免小鼠反应而不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同，因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得高效价抗体为最终目的。免疫间隔一般2～3周。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如抗体的浓度和亲和力）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离脾细胞融合。（二）骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾
细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。 融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于 95％）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻 果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细 胞作为饲养细胞的。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。 （三）细胞融合 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入 PEG（融合剂）使细胞彼此融合。其后把培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。 ②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液； 间隔2 min滴加5 ml培养液，尔后加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 （四）有限稀释法 筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。 细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。
1.兔抗人IgG抗体的初步纯化 ( 硫酸铵沉淀法） 一、基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯 化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。 盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二、试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫 酸铵(NH4)2SO4 3. 饱和硫酸铵溶液4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。 （一）配制饱和硫酸铵溶液 1.将 767g (NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为100% 的硫酸铵溶液(SAS)（4.1 mol/L, 25 ° C ）. （二）沉淀 1.样品（如腹水）20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的
SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 。4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。 （三）透析 1.蛋白质溶液10 000 ′ g 离心 30 min （4 ° C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 四，应用提示 （一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1. 边搅拌边慢慢加SAS 到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或过夜 （ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ），保 留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到 沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清 液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀 溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 5.杂蛋白与欲纯化蛋 白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是 非常有效 （二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 纯化产物的鉴定： （1）效价测定 : 采用间接ELISA法 (3 mg / L抗原包被 , 1∶ 1