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单克隆抗体纯化工艺中Protein A层析介质的选择

单克隆抗体纯化工艺中Protein A层析介质的选择
单克隆抗体纯化工艺中Protein A层析介质的选择

单克隆抗体纯化工艺中Protein A层析介质的选择

1.单抗分离纯化中的亲和层析介质

亲和层析具有专一、高效的特性。一般使用亲和层析纯化后,抗体的纯度一般大于95%以上,收率在95%以上;所以在抗体纯化工艺中一般使用亲和层析作为单抗纯化工艺

的捕获步骤。在单抗分离纯化中使用的亲和层析主要是有:

a.嵌合抗体,人源化,全抗体一般使用Protein A 或Protein G层析介质为捕获步骤;

b. FC融蛋白一般使用Protein A层析介质做捕获步骤;

c. Fab片段,或scFv 单链抗体一般使用Protein L层析介质捕获, Protein L (Capto L) 对轻链kappa片段有特异吸附。如果轻链的种类是Lambda,可以选择Lambda Select 特异的捕获。

d.单区域抗体sdAb一般有V H区域,也可以使用protein A,如MabSelect 作为捕获步骤。

1.1Protein A 的性质

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A,SPA)是一种从金黄色葡萄球菌

细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区域结合。天然的protein A SPA是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸,所以无二硫键。

紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65,等电点为pH5.1。SPA十分稳定,用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件,以及加热煮沸均不影响其活性。分子量:全长的SPA 54KD,去掉与细胞壁结合部分的SPA 42KD。SPA与IgG结合的亚类主

要是IgG1、IgG2和IgG4。

近几年来基因工程的SPA出现,解决了天然protein A的耐碱性问题,MabSelect Sure是

基因工程的SPA,去掉了天然SPA的DACE 区域,对于B区域进行了修饰,将不耐受NaOH的氨基酸去掉。使修饰后的SPA可以耐受0.1-0.5M的NaOH;这就很好的解决了层

析介质CIP的问题,同时修饰后的SPA也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对SPA的

作用,使洗脱收集液中SPA的脱落更低。

Protein A 层析介质的发展历史(GE Healthcare 公司Protein A的发展史):

1958 年 Protein A 蛋白发现

1975年杂交瘤细胞技术

1978年 Protein A Sepharose TM CL-4B ?

1988年 Protein A Sepharose Fast Flow ?

1994年 nProtein A Sepharose Fast Flow ?

1996年 rProtein A Sepharose Fast Flow ?

1999年 rmpProtein A Sepharose FastFlow ?

2001年 MabSelect TM ?

2005年 MabSelect Xtra TM ?

2005年 MabSelect Sure TM?

2011年 MabSelect Sure TM LX ?

注:

?天然Protein A, 使用CNBr方法与琼脂糖偶联

?重组protein A, 大肠杆菌表达,无动物成分来源,通过CNBr方法与琼脂糖偶联

?重组protein A, 大肠杆菌表达,通过稳定的硫醚键与琼脂糖偶联

?重组protein A, 大肠杆菌表达,无动物成分来源,通过还原的氨基与琼脂糖偶联,可以多点与IgG结合,吸附两个IgG分子

?重组protein A, 大肠杆菌表达,无动物成分来源,通过环氧键与高流速琼脂糖偶联。

?重组基因工程protein A, 大肠杆菌表达,无动物成分来源。耐碱Protein A。通过环氧键与高流速琼脂糖偶联。LX为高载量。

2.用于捕获抗体的Protein A层析介质的选择

在Protein A捕获步骤中主要去除的杂质:大部分HCP,DNA;由于 Protein A层析介质对聚体没有去除作用,所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略,例如:提高洗脱pH,加入添加剂等;在此捕获步骤中会有Protein A(配基)的脱落。在Protein A 捕获过程中,培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基Protein A,以及Protein A与介质骨架的偶联方式,这些都是protein A的脱落原因。所以选择Protein A脱落较低的层析介质是非常必要的。

现在商业化ProteinA的介质较多,对于不同的项目如何选择:

a.Fc融合蛋白:一般Fc融合蛋白的DBC低于单抗。这是Fc融合蛋白的空间位阻效应大于单抗。对于Fc融合蛋白MabSelect Xtra高动态载量的重组protein A介质

是比较好的选择。

b.FC融合蛋白:如果Fc融合蛋白的稳定性差,尤其是在低pH缓冲液中,可以选择MabSelect Sure。由于只有FC区域的结合,所以洗脱时的所用的pH较抗体高。

c.表达量高,剂量大的项目可以选择Mabselect Sure LX。

d.不同可变区的抗体在Protein A的DBC也不同,一般V H3 > V H 1>V H2 >V H4

e.修饰后的Protein A 如:Mabselect Sure 对Fab没有亲和作用。

2.1Protein A层析介质选择的策略

A.耐碱性

药物GMP生产最基本的要求是无菌、无热源。NaOH 是最好的除菌、出热源的试剂。同时NaOH也是公认的CIP试剂,使用NaOH 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质,以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命;幵且NaoH的成本低。

NaOH是公认的CIP试剂,实验表明,NaOH的清洗效果高于其他试剂。如图,NaOH清洗Protein A层析介质的效果。

图用不同CIP试剂清洗后凝胶颗粒上的残留蛋白。SDS-PAGE(Deep Purple?染色)用于评估CIP试剂的清洗效率。NaOH是一种非常高效的清洗试剂,适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架(CPG)填料的清洗结果表明,盐酸胍比磷酸更为有效。CPG填料在高pH下不稳定,不适合用NaOH清洗。28-9500-94 GE poster

传统的protein A的清洗试剂,如:尿素,盐酸胍等的清洗试剂效果不理想,幵且在配置时浓度较高,这对生产是一个瓶颈。

MabSelect Sure 系列是通过基因工程修饰的Protein A介质,去除了不耐受NaOH的氨基酸,提高了层析介质耐受NaOH的能力。同时 MabSelect Sure LX是最新的Protein A层析介质,结合了耐碱和高载量的性质。另外, Mabselect Sure和Mabselect

Sure LX介质在NaoH清洗后寿命可以在300次以上。见图。

展,培养条件改善以及表达量的大幅度提高(生产规模已经到达3-5g/L),杂质

的量(HCP)也随之提高。如果不能将介质清洗干净,这会影响工艺以及产品的质

量。在这种情冴下使用高浓度的NaOH (0.5M)的非常必要的(参考GE用于文献

28987296)。

B.动态载量与保留时间:

一般Protein A层析介质的理论载量为80g/L左右。高载量可以减少层析柱的体积。保留时间是指样品在层析柱内的停留时间或样品与层析介质的接触时间。较低的保留时间

可以使用较快的流速,从而提高生产效率。

在抗体纯化工艺开发时,对于动态载量以及保留时间是一个平衡的过程,单纯追求

高动态载量,可能保留时间会较长,使得上样时间延长,这样培养基中的蛋白酶就有时间

分解样品,以及上样时蛋白酶降解Protein A,使Protein A的脱落增加。另外一些高载量

的protein A 层析介质,是通过提高配基密度(Protein A)增加动态载量的。但是配基密

度提高过程中,如果配基与的层析基质(骨架)的偶联不稳定,就会增加protein A的脱落。此类Protein A介质在初期动态载量较高,经过一段时间的使用,随着配基的脱落,

载量很快降低。

单纯追求高流速,可能会使层析介质的柱压升高,提高了纯化过程中对生产设备(层析柱

以及层析系统)的要求,从而增加层析柱以及层析系统的采购成本。随着上样次数的增多(生产循环次数的增加)层析介质的反压增加,从而减少层析介质的寿命。另外,有文献

报道,以硅胶基质或CPG的在重复装柱的过程中易破碎,从而增加运行的压力以及影响介质的寿命。

现代的Protein A 的动态载量一般在35-60g/L之间,保留时间一般在3-5min左右(20cm

柱床高度,线性流速在250-400cm/h )。

随着细胞培养条件的改善,抗体的表达量的提高(由原来的1-2g/L提高到5g/L以上),对于Protein A层析介质的关注从上样的速度转到关注上样的载量(DBC),关注

的是DBC与上样的速度的平衡。JOB 848 (2007)28-39.

C.低配基脱落

配基脱落在单抗药物中有严格的规定,在最终的药物中protein A 的残留<10ppm。所以Protein A捕获步骤中,选择低protein A的脱落的层析介质对抗体药物质量控制以

及工艺的风险控制是非常关键的。

Mabselect 系列层析介质的protein A残留在20ppm以下。采用环氧键与高流速琼脂糖偶联,增加了偶联稳定性,从而降低了Protein A的脱落。而其他商用Protein A介质的Protein A为重组,对于酶的耐受性,以及与骨架偶联的方式与Mabselect sure 不同,所以在纯化中配基脱离量较高,在100-200ppm 以上。

图,传统的Protein A与Mabselect Sure 配基在细胞培养

液中,其中培养液中蛋白酶对配基的降解作用。传统的

protein A在培养液中16h后有大量的降解带,参考G

E应用文献11001159AD

D. 低非特异杂质吸附

Protein A捕获的样品是细胞培养的上清液。宿主蛋白是捕获步骤的主要杂质。虽然Protein A对抗体的Fc有特异性、专一性,但是层析介质的基质(骨架)有时会对杂质有非特异吸附。有文献报道以聚合物为基质的Protein A层析介质非特异吸附较高,洗脱时宿主蛋白会与抗体共同洗脱。从而HCP的残留量较高。

以琼脂糖为基质Protein A层析介质非特异吸附较低,一般的洗脱收集的样品中HCP的残留在100-200ppm 之间。而以聚合物或CPG的骨架的protein A层析介质的HCP残留是琼脂糖骨架的10倍以上。

E.层析介质压力/流速特性:

在生产中层析介质的装柱是必不可少的一项工作。这与小规模实验室层析柱的使用是完全不同的。生产中使用的层析柱一般直径在300mm以上;有些剂量大的项目,生产中需要使用直径1-1.4m的层析柱。生产规模层析柱的使用关键是:操作简便,装好的层析柱稳定(经过多次生产循环后,柱效、柱压、流速等关键操作参数稳定)。生产规模层析柱的装柱不只是层析柱的设计,层析介质的装柱方法是否适用,以及在装柱过程中层析介质是否易破碎时关键的因素。

商业规模的层析介质主要分为两种:层析介质的压力/流速曲线在放大过程中

例如:CPG为骨架的层析介质在装柱中需要不断震荡,以及装柱过程易碎。这可能会造成生产的潜在风险。CPG 或多聚物骨架的层析介质较硬,他的压力/流速曲线为:线性,即随着流速的加大而升高。所以在生产中由于层析柱(3-4bar)以及层析仪器(6bar)的限制。所以高流速耐压的性能不能实现;同时,在样品污染后,有不能使用苛刻清洗试剂清洗(例如:NaOH)所以在使用后期(一般几十的上样后,压力会超过层析柱的限定压力),是生产中断。

在层析介质的拆装过程中对于较硬的CPG骨架的介质容易破碎,从而进一步增加使用中的压力。

以琼脂糖为骨架的层析介质,有一定的弹性。加之可以很好的清洗,所以在生产中可以保持很好的压力/流速曲线。幵且GE Healthcare有丰富的层析柱的装柱经验,可以使层析柱在生产中更加稳定。

综上所述:在单克隆抗体的纯化工艺中Protein A的捕获步骤是十分重要的,选择:耐碱的、适合的载量、较低的配基脱落、较低的HCP残留、以及合适的压力/流速曲线的层析介质,可以延长层析介质寿命,减少生产成本,以及减少生产工艺的风险。

另外:2013年经过Oxford Analytica 公司认证,Mabselect系列层析介质在抗体工艺的研发以及生产中可以减少15% 的成本,提高15%的生产效率。

蛋白质的纯化方法

蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多,主要有: (一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二)蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化

GST亲和层析介质使用说明书

GST亲和层析介质使用说明书 一、简介 GST亲和层析介质(GST Agarose)是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质,一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白,纯化条件温和,可以保证蛋白的活性。 本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶,具有优良的物理和化学稳定性,使用寿命长,操作方便,批次重复性好,易于放大,是研发与生产的理想选择。 二、性能参数 三、适用范围 分离谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。 四、操作说明 1. 缓冲液配制 缓冲液A(平衡缓冲液):10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,调节pH值至8.0。 缓冲液B(洗脱缓冲液):10mM Glutathione(还原型),50mM Tris-HCl,调节pH值至8.0。因Glutathione易氧化,需现用现配。 (注:各种溶液配制完毕后,最好进行脱气处理,0.45 μm滤膜过滤备用)。 2. 样品预处理:

按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体;600w功率,每循环超声3s,冷却3s,循环99×3次,破碎菌体;4℃、15000rpm离心15m,收集上清液,或用0.45μm滤膜过滤。 3. 装柱: 聚苯乙烯层析柱 1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上,封闭层析柱下端出口,向柱内充入纯水,排开层析柱内空气,先将垫片完全浸没于水面下方,在保持水平的状态下,小心推向底部,避免垫片下方滞留气泡。 2) 打开层析柱下端出口,排出柱中纯水;在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。 3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免垫片与介质接触面滞留气泡(如对实验结果要求不严,也可不放入上垫片,以提高流速)。 4) 在使用一段时间后,如果层析柱流速减慢,可先用小镊子沿边缘将垫片推翻,夹出垫片,倒出介质,清洗或更换新的垫片后,按2)、3)所述 玻璃层析柱 1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上;向柱中加入蒸馏水,排开柱子中的空气,在蒸馏水排尽以前,关闭柱子出口,在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。 2) 先将介质混匀,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。 3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。 4) 在使用一段时间后,如果流速减慢,可先卸下上转换杆,将介质倒出,再取出下转换接头中滤网,清洗或更换后重新装柱。 4. 过柱: 1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱,平衡介质;

蛋白质纯化的一般原则及方法选择

随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸

镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明

镍离子金属鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)说明书 一、简介 金属螯合亲和层析介质,又称固定金属离子亲和色谱,其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+,Zn2+,Ni2+,Co2+,Fe3+发生特殊的相互作用,能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质,从而达到分离纯化的目的。因此,偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合,但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。 镍NTA亲和层析介质(Ni-NTA )具有特异性好、流速快的优点,颗粒粒度均匀,粒径小,并且螯合镍更稳定,能耐受更高的还原剂,物理和化学稳定性好,批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子,使用更方便。 二、性能参数: 特点基团密度高,载量大,分辨率高,使用方便 基质6%的交联琼脂糖凝胶 配体 Ni2+ 配体密度20-40μmol /ml 吸附载量15mg蛋白/ml 介质颗粒大小45-165μm 最大流速600cm/h pH范围3-10,在位清洗时pH范围可到2-11 保存温度+4-8℃ 保存液体20%乙醇 三、适用范围 分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。四、应用实例 实验名称:Ni-NTA 分离带His标签的重组蛋白 实验步骤: 1、Ni-NTA 装柱,1.6×20cm,柱床体积为10ml; 2、用缓冲液1平衡2~5个床体积,流速为2ml/min; 3、将20ml细胞破碎液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤,上样,流速为 1ml/min;

Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol 蛋白质纯化方法(镍柱) 柱前操作 1.IPTG诱导后,收菌,8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer(BB)溶解(每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min(工作:5s,停止:5s),1500r/m离心10min,去除杂质; 3.取上清,12000r/m离心20min, 得包涵体; 4.用含2M尿素的BB洗包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳);??? 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体,12000r/m离心20min,(上清做电泳); 6.对照电泳结果,将上清或包涵体溶解液上柱; 平衡柱子(柱体积:V) 7. 3V(3倍柱体积)ddH2O(洗乙醇); 8. 5V Charge Buffer(CB); ??? 9. 3V BB; 柱层析 10.上样; 11. 10V Washing Buffer(WB); 12. 6V Elute Buffer(EB); 13.分管收集,每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑),pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素:60.06×6=360.36g

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败,因为后者要求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2.1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低,蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果,在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2.2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来,毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想办法脱盐,可用的方法有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液,并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达到平衡,若增加对蛋白溶液的压力,还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱,柱内的填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流出,从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失,缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上,剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2.3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用,通过选择不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成,氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH(pH6~8)下带负电荷,需用阴离子交换柱纯化,极端的pH下蛋白会变性失活.应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同,与树脂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值,因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制,所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比,离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,还需要其他的纯化步骤。

亲和层析柱使用说明

亲和层析柱使用说明货号 名称规格说明DS0101 亲和层析柱1ml 含1个空管柱,上下盖和2个筛板(亲水性,孔径50um) DS0103 亲和层析柱3ml DS0106 亲和层析柱6ml DS0110 亲和层析柱10ml DS0130 亲和层析柱30ml DS0150 亲和层析柱50ml 一、产品说明 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。它是利用生物分子间 存在很多特异性的相互作用(如抗原和抗体、酶 和底物或抑制剂、激素和受体等),通过将具有 亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质 上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对另 一个分子进行分离纯化。 提供的亲和层析柱工具可应用于如下方面: ①纯化重组蛋白;②纯化抗原和抗体;③纯化多 肽;④纯化DNA;⑤糖蛋白的纯化;⑥纯化磷酸 化蛋白和肽;⑦DNA 结合蛋白的纯化;⑧去除内毒素,等。 亲和层析柱空柱管的材质为医疗级的聚丙烯,这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒,不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWM-PE(超高分子量聚乙烯)为原料,经独特的工艺加工而成,具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端,以阻挡昂贵的基质渗出。亲水性筛板采用了领先的亲水性UHWM-PE 生产技术,该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时,该筛板和其它同类产品相比,不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外,该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡,气泡会使流速降低,液体通过基质不均匀。

二、产品应用 1,抗体纯化 纯化抗体一般用Protein A作为纯化的配体,也可以用Protein G或Protein L或异源性抗体作为配体。 2,小分子物质提取(以提取黄曲霉毒素M1为例) 试样通过免疫亲和柱时,黄曲霉毒素M1被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上,当样品通过亲和柱时,抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合,形成抗体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1,收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。 3,重组蛋白纯化 近年来,随着生物技术,特别是基因工程技术的迅猛发展,重组蛋白表达和纯化越来越容易。常用的重组蛋白表达策略是把蛋白与亲和标签融合表达,利用亲和标签一步纯化出目标蛋白。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性,就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合,从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于,无需针对不同的蛋白质开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件,可一步亲和层析从粗提物中纯化出重组蛋白,纯度可达90%以上。 亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。亲和标签系统一般具有以下特征:(a)一步的吸附纯化;(b)对三级结构和生物活性影响小;(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质;(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确;(e)适用于大量的不同蛋白质。但是没有哪个标签是完美的,只能根据实际需要去自己筛选,下表是分的标签以及纯化的方案。

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程

Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程(编号:066)1、目的及适用范围 利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的包涵体重组蛋白。 2、主要仪器 超声破碎仪、冷冻离心机、Ni柱、垂直混匀仪 3、主要试剂 3.1 裂解Buffer:50mM Tris,5mM EDTA,0.8%NaCl,pH8.5 3.2 变性剂:6M盐酸胍,2mM EDTA, 50mM Tris,10mM DTT,pH8.5 3.3 Buffer B:8M尿素,0.1M NaH2PO4,10mM Tris,pH8.0 3.4 Buffer C:8M尿素,0.1M NaH2PO4,10mM Tris,pH6.3 3.5 Buffer D:8M尿素,0.1M NaH2PO4,10mM Tris,pH5.9 3.6 Buffer E:8M尿素,0.1M NaH2PO4,10mM Tris,pH 4.5 4、相关的预处理 Ni柱的预处理: 4.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子; 4.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子,使柱子挂Ni; 4.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子,除去多余的Ni; 4.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子(使柱子变得疏松); 4.5用5个柱体积的Buffer B平衡柱子。 5、操作步骤 5.1蛋白的纯化 5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白; 5.1.2 4500rpm,离心10-15min,收集菌体; 5.1.3用裂解buffer重悬菌体,8000rpm离心10min,弃上清,收集菌体; 5.1.4 将菌体用裂解buffer重悬,超声破碎菌体; 5.1.5 4℃,12000rpm离心15min,弃上清; 5.1.6 将沉淀用PBST洗涤,4℃,12000rpm离心10min,重复1次; 135

分离纯化蛋白质的方法及原理

(二)利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有:1、溶液的pH;2、离子强度;3、介电常数;4、温度。但在同一的特定外部条件下,不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀:原理:蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时,他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时,蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥,阻止了单个分子聚集成沉淀,因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理,可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来,那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象,能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出,这就是因为透析除去了盐类离子,使蛋白质分子之间的相互吸引增加,引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时,蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象,能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳,在水中的溶解度很高,而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法:与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性,如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下,然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂,以防局部浓度过高,那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此控制有机溶剂浓度也可以分

蛋白质纯化方法总结

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 1.前处理:分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态(如果做不到呢?比如蛋白以包涵体形式存在),不丢失生物活性。为此,动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染,油料种子最好先用低沸点(为什么呢)的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况,选择适当的方法,将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁,一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦,因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子,非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。 如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可利用差速离心的方法将它们分开,收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当介质提取。 2. 粗分级分离:当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既能除去大量杂质,又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大,又不适于用沉淀或盐析法浓缩,则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 3.细分级分离:样品经粗分级分离以后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质分离纯化的方法: 一、根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度离心 3、凝胶过滤 二、利用溶解度差别的纯化方法 1、等电点沉淀和pH控制 2、蛋白质的盐析和盐溶 3、有机溶剂分级分离法 4、温度对蛋白质浓度的影响 三、根据电荷不同的纯化方法

蛋白质纯化方法

含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂:1M IPTG 1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接,构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板,37℃培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落,接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中,37℃通气培养过夜。 3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中(各 10份),适当的温度(20-37℃)震荡培养4小时,至对数中期(A550 =0.1-1.0)。 4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中,剩余培养物 中加入IPTG至终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5, 5.0mM相同的温度继续通气培养。 5.在诱导的1,2,3,4,5个小时取1ml样品于Ep管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种菌量,诱 导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加 重细菌合成系统的负担,导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大 肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑 制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过 试验确定最佳的培养条件是很必要的。 6.将所有样本室温最高速度离心1分钟,弃上清,沉淀重悬于100微升 1×SDS蛋白上样缓冲液中,100℃加热5分钟,室温最高速度离心1 分钟,取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶,用SDS-PAGE 观察表达产物条带,从而确定优化的培养条件。 二.大量表达靶蛋白 1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的 LB培养液中,在100毫升锥形瓶中,300rpm,37℃通气过夜培养。

(推荐)蛋白纯化-Ni亲和层析柱法

Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白 纯化设备: 纯化仪:?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Ni亲和层析柱:HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden) 试剂: 所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。 Binding Buffer:20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer:20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑 Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 20%乙醇:200 mL无水乙醇,加蒸馏水定容至1L 0.1M NiSO4: 称取2.6284g NiSO4·6H2O,加蒸馏水溶解,定容至100 mL 操作步骤: 1 样品前处理 取诱导后菌液50 mL,4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体,以25 mL Binding Buffer 重悬菌体,冰浴下超声波破碎至澄清,4℃、12000 rpmin离心25 min,取上清,经0.2 μM 孔径过滤器过滤后待用。 2 Ni柱前处理 上样前,使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。 3 上样 经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上,收集穿透液,可反复上样以提高样品的挂柱效率。 4 平衡上样后的Ni柱 将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA pur ifier上,用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。 5 梯度洗脱 以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同,可经预实验确定),流速为5 mL/min,并监测OD280值,收集蛋白吸收峰对应的洗脱液

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理 (一)利用分子大小 1、透析:原理:利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法:将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题: 如何加快透析过程 (1)加大浓度差,及时更换透析液 (2)利用磁力搅拌器 常用的半透膜:玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤:原理:利用压力和离心力,强行使其他小分子和水通过半透膜,而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析:原理:当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构,排阻在凝胶珠以外,在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内,这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果:大分子先被洗脱下来,小分子后被洗脱下来 (二)利用溶解度差别 4、等电点沉淀:原理:不同蛋白质具有不同的等电点,当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶:原理:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加,足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析

(三)根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理:通过加热和SDS可以使蛋白质变性,多亚基的蛋白质也解离为单亚基,处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的,分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析:原理:氨基酸分离常用阳离子交换树脂,树脂被处理成钠型,将混合氨基酸上柱,氨基酸主要以阳离子形式存在,在树脂上与钠离子发生交换,而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力,决定亲和力的因素有:(1)主要是静电吸引力(2)氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是: 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是: 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法

蛋白质纯化试题整理

名词解释 1. 截留分子量(molecular weight cut-off, MWCO):不能通过膜的最小分子量 2. 超滤:选择合适孔径的超滤膜,在离心力或较高压力下,使水分子和其他小分子物质通过超滤膜,而目标蛋白样品分子被截留不能通过超滤膜,从而增加蛋白样品浓度,达到浓缩效果的方法 3、陶南效应:离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳IE表面的微环境中,H+被吸引而OH-被排斥,交换剂表面pH比周围低1个pH单位;而阴IE表面的微环境中,H+被排斥,交换剂表面pH比周围高1个pH单位 4、离子交换剂的有效(实际)交换容量:指在一定的实验条件下,每克干介质或每毫升湿胶吸附蛋白质的实际容量 5. 聚沉(coagulation)是指在聚沉剂的作用下,溶液中的蛋白质相互聚集为较大在聚沉物(>1mm)的过程 ?常见的聚沉剂:无机盐类(如氯化锌、氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸铝),聚合无机盐(聚合铝、聚合铁等) ?聚沉条件:-20℃以下,pH3~6,较高离子强度,高多价金属离子(Fe3+、Al3+) 6. 絮凝(flocculation)是指在絮凝剂的作用下,通过吸附、交联、网捕,把蛋白质聚结为大絮体沉降的过程 ?常见的絮凝剂:淀粉、树脂、单宁、离子交换树脂及纤维素衍生物 ?絮凝作用一般在聚沉作用之后使用;絮凝剂的选择应根据成本、毒性等具体情况考虑;应通过试验筛选获得最适合的絮凝剂类型、用量及作用条件 7、盐溶:蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随着盐浓度的增高而上升 8、盐析:但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出 9、透析:利用小分子能通过,而大分子不能透过半透膜的原理,把不同性质的物质彼此分开的一种方法。对于蛋白质样品,透析过程中因蛋白质分子体积很大,不能透过半透膜,而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中,因此不断更换透析用水即可将蛋白质与无机盐小分子物质完全分开。蛋白的分离纯化过程中常用此法脱去无机盐(如硫酸铵) 10、排阻极限:指不能进入凝胶颗粒内部网孔的最小蛋白的分子量 11、凝胶颗粒的分级范围:指能进入凝胶颗粒内部网孔的最大分子和最小分子的分子量范围 12、过滤:利用多孔介质(滤纸、滤膜等)阻截大的颗粒物质,而使小于孔隙的物质通过的一种的分离方法。主要用于悬浮液的分离,最简单、最常用 13、离子交换剂的电荷密度:指IE介质颗粒单位表面积的功能基团数量,它决定着离子交换剂的总交换容量 14、离子交换剂膨胀度(吸水值):指干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成的体积膨胀程度。用每克干离子交换剂吸水膨胀后的体积表示(ml/g) 15、梯度洗脱:进行梯度洗脱时,洗脱缓冲液的pH或离子强度是连续发生变化的,洗脱剂的洗脱能力也是连续增加的 16、阶段洗脱:指在一个时间段内用一固定pH或I的条件进行洗脱,而在下一个时间段内用另一固定pH或I的条件进行洗脱的分段式洗脱方式 也分为pH阶段洗脱和I阶段洗脱 17、亲和层析:利用蛋白质与其专一性配体之间的特异性生物学亲和力作用,对蛋白质进行分离纯化的层析技术。 18、等电聚焦电泳:利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在pH梯度中相互分离的一

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