(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析)
精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使
用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法
取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法
分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。
表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件
物种 pH 沉淀条件 IgG产量
酒精浓度（%）离子强度
人 5.1 15. 0.01 65
山羊 5.2 0 0.01 65
家兔 5.2 10 0.01 70
大鼠 5.0 15 0.01 50
豚鼠 5.1 15 0.01 70
三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白
原理：DEAE-Sephadex A-50（二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50）为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85～7.5），其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.
（一）操作步骤
1．DEAE-Sephadex
A-50预处理称DEAE-SephadexA-50（下称A-50）5g，悬于500ml 蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/LNaOH 15ml 的比例，将A-50浸泡于0.5mol/LNaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/LHCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/LNaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/LpH7.4PB中过夜。2．装柱
（1）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
（2）将0.1mol/L,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连
续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。
（3）关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3．平衡
启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。
4．加样及洗脱
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。
5．收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。
6．测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD280nm, 与OD260nm,按公式计算各管蛋白含量。并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横
座标，绘制洗脱曲线。
7．合并、浓缩
将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG （MW6000）浓缩至所需体积，加入0.02%NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。
8．A-50凝胶的再生
在柱上先以2mol/LNaCl洗脱蛋白至流出液的OD280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。
（二）注意事项
（1）柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
（2）纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。
（3）所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。（4）洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。
（5）上样的体积要小，浓度不宜过高。
（6）加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。
四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化
IgG及IgG亚类
（一）原理
葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B 柱上的IgG或不同的IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
（二）操作步骤
用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤）。
↓
装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。
↓
加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/LpH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。
↓
用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/LpH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/LpH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。
↓
用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。
↓
收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
（三）试剂器材
（1）SPA-Sepharose L-4B （pharmacia）
（2）磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3
（3）枸橼酸缓冲液0.1mol/LpH6.0 0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN30.1mol/LpH3.0
（4）1mol/L pH9.0 Tris溶液
（5）再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。
（四）注意事项
（1）SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。
(2)SPA-Sepharose CL-4B亲合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋
白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
（3）狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A，SPA）可与IC中IgG的Fc段结合。将待测血清用低浓度PEG沉淀后加至SPA包被的固相载体上，再以酶标记的SPA与之反应，即可检测样本中有无IC。
1、试剂
（1）5%与2.5%PEG用0.02mol/LpH7.4PBS配制；
（2）牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：用0.05mol/L pH 7.4PBS配制。含0.01mol/L EDT A、0.1%硫柳汞、0.05%Tween 20及4%BSA；
（3）HRP-SPA用改良过碘酸钠法将SPA与辣根过氧化物酶（HRP）制成结合物，最适工作浓度以方阵法滴定；
（4）热聚合人IgG：人IgG 10mg/ml，63℃加热20min制成。
2、操作步骤
（1）用PBS稀释SPA成5Ps/ml，包被聚苯乙烯反应板微孔，每孔0.1ml（对照孔不包被），置4℃过夜后洗涤3次备用；
（2）待测血清0.05ml加PBS0.15ml和5%PEG0.2ml混匀，4℃过夜后1600r/min离心2 0min，弃上清，沉淀用2.5%PEG洗2次，加入PBS0.2ml和BSA缓冲液0.2ml，混匀，置37℃水浴30min，摇动，使完全溶解；
（3）将已溶解的待测血清沉淀物加至上述包被孔和对照孔中，置37℃60min，洗3次；各孔加底物溶液（OPD—H202）0.1ml，37℃20min使呈色。每孔加2mol/LH2S041滴终止反应。置酶标仪492nm测各孔吸光值；
（4）标准曲线制备：取正常人血清0.2ml，加热聚合人IsC（120ug/ml）0.2ml，再加PBS 0.4ml和5%PEG0.8ml，置4℃过夜。同时做不加热聚合人耽的正常血清对照，以排除血清中干扰因素。沉淀清洗同标本操作。用稀释的BSA缓冲液（加等量0.01mol/LpH7.4PBS）1.6ml溶解并稀释成120、60、30、15、7.5ug/ml，与待测血清同法操作，制成工作标准曲线；
（5）结果判断：从待测血清吸光度值查标准曲线，即可换算成相当于热聚合人IgG的CIC 含量（ug/ml）。以高于正常对照X+2S，即大于28.4ug/ml为阳性。
3、注意事项
（1）热聚合人IgC应分装贮存于-20℃，不宜反复冻融，否则易解聚；
（2）PEG的浓度影响CIC沉淀量，须严格配制。
五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。
（一）原理
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗
脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
（二）操作步骤
腹水离心10000 g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵
↓搅拌20～30min
离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A（pH8.5, 20mmol/L Tris缓冲液）透析除盐
↓4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK
DEAE SPW离子交换层析柱
↓
洗脱流速1ml/min
0～1min ：0→5%缓冲液B（20nmol/L
Tris, Ph 8.5,含2.0
mol/L醋酸钠）
1～2 min( 线性梯度洗脱)：5→20%缓冲液B
20～22min：20→0%缓冲液B
↓
洗脱液用紫外280nm进行监测
↓
收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定
（三）试剂和器材
（1）TSK
DEAE SPW离子交换层析柱（75mm×7.5mm,Bio
Rad）
（2）高效液相色谱仪（包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统）
（3）PBS，缓冲液A和B。
（四）注意事项
（1）所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。
（2）在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb
的存留时间（retention
time）有所差异。
【附录】
制备单克隆抗体常用的试剂
1．RPMT-1640培养液其中含2mmol/L 谷氨酰胺，25
mmol/L Hepes,5×10-5mol/L
2-巯基乙醇2.
RPMT-1640完全培养液上述溶液加10%～20%灭活小牛血清3．HT母液×100
次黄嘌呤（H）
1.0×10-2mol/L
136.1mg
胸腺嘧淀核苷(T) 1.6×10-3mol/L 38.8mg
蒸馏水100ml 4. A母液×100
氨基喋呤(A) 4×10-3mol/L
1.76mg
蒸馏水90.0ml 1mol/LNaOH 0.5ml
溶解后,加1mol/L
HCl 0.5ml,再补加蒸馏水至100ml 。
5．HAT选择培养液
RPMI-1640培养液
80ml
灭活小牛血清20ml
HT母液×100
1ml
A母液×100
1ml
用5%NaOH调节pH至7.4左右。
6．HT培养液
RPMI-1640培养液
80ml
灭活小牛血清
20ml
HT母×100
1ml
用5%NaOH调节pH至7.4左右。
Protein A Purification of Antibody
1. Reagents
(1) Affi-gel Protein-A Agarose (BioRad #153-6153)
(2) MAPS II Binding Buffer (BioRad # 153-6161)
(3) 0.314 g/ml diH2O
(4) MAPS II Elution Buffer (BioRad #153-6162)
(5) 0.023 g/ml diH2O
(6) MAPS II Regeneration Buffer (BioRad #153-6166
(7) 1M Tris, pH 9-11
(8) PBS
2. Procedure
(1) Dilute Ab 1:5 with Binding Buffer. Filter through a 0.22 m filter.
(2) Equilibrate column with at least 2 bed volumes of Binding Buffer
(3) Apply Sample.
Wash column with 5-6 bed volumes of Binding Buffer. Collect 1 ml fractions until b ase line is achieved.
Elute Ab with 5 bed volumes of Elution Buffer. Collect 1 ml fractions into 50 ml 1 M Tris, until base line is achieved.
Take 50 ml aliquots of each fraction for ELISA.
Pool fractions containing Ab. Dialyze against 2 x 4L PBS, overnight, 2-8℃.
Re-equilibrate column with Binding Buffer. Store column at 2-8℃.
Determine protein concentration of Ab, aliquot, and store at -20℃.
3. Note
Extinction Coefficient for IgG = 1.4 and for IgM = 1.2
抗体纯化的方法有哪些？ 抗体制备出来之后，需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗，既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清，而通常经过免疫制备的 硫酸铵沉淀法： 基本原理：高浓度的硫酸铵通过与球蛋白竞争水分子破坏蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分离免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白适宜的硫酸铵浓度也稍有差别，一般用来分离抗体的硫酸铵饱和度在33~50%。 适用于：鼠抗所有亚类、其他种属抗体、任何种属的IgM、IgG、IgA 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.加入饱和硫酸铵至终浓度45%，静置沉淀蛋白； 3.沉淀蛋白用最小体积PBS或硼酸盐缓冲液溶解，用PBS或硼酸盐缓冲液透析除盐； 4.过聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱，PBS或硼酸盐（含0.02%叠氮钠）缓冲液洗脱； 5.电泳检测分子量大小，分光光度法测定抗体浓度； 6.抗体保存浓度在0.1-30 mg/mL适宜，-20℃保存不超过一个月，避免反复冻融。 亲和层析法 基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特异性结合哺乳动物IgG的Fc区段，将protein A和protein G结合到柱料上，通过亲和层析的方式，可将IgG及其亚类与片段纯化出来。 成员介绍：protein A分离自Staphylococcus aureus的细胞壁，分子量42 kDa，由spa 基因编码，具有五个同型的免疫球蛋白结合结构域，每个结构域由三个α螺旋构成。 protein A的B结构域
protein A的各个结构域 protein A可结合多数免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，猕猴，鼠类IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大肠杆菌作为表达宿主，表达产物仍含有五个Fc结合结构域。对其结构上的改造主要是为了增加与多孔性材料的偶联性能，也有的改造protein A含有四个或六个同型Fc结合结构域，另外结构域数目较少的protein A能得到更好的抗体纯化效果。 protein G分离自G Streptococcus的细胞壁，分子量65 kDa，由spg基因编码，可结合抗体的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了与白蛋白的结合位点仅仅保留Fc结合结构域，其结合力较protein A更强。 protein G的B结构域 protein G的各个结构域 还有一种protein A/G蛋白，是基因工程改造产物，是将protein A的4个Fc结合结构域与protein G的2个Fc结合结构域融合表达得到的。protein A/G结合了二者的特性，能结合人和鼠的IgG所有亚型，不结合鼠的IgA、IgM。 ①proteinA亲和层析 适用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、猪的抗体； 基本操作： 1.过滤、离心腹水或者培养上清得上清； 2.调节pH到8.0：腹水以10倍体积pH8.0 PBS稀释、培养上清用pH8.0 PBS透析或强氧化钠调节； 3.过proteinA琼脂糖凝胶柱，pH8.0 PBS洗杂； 4.柠檬酸缓冲液洗脱抗体（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管内需加入Tris缓冲液中和滴下的抗体溶液； 5.用PBS透析；
抗体ProteinA纯化 一．P roteinA柱子的制备 1.配制溶液； 结合／洗涤缓冲液：NaCl，0.5M ；Na2HPO4，20mM ；PH8.0。 配制500ml的方法： 称取NaCl 4.383g，Na2HPO43.5814g溶解于450ml的双蒸水中。调节PH为8.0,补加双蒸水至总体积500ml。 2. 制备空柱子 （1）先打开用过的PD-10上盖，拿掉上面的盖膜。盖上盖子，摇晃，倒去里面的填料，用PBS清洗3次。 （2）用胶带固定好PD-10空柱子，要求垂直放置。 （3）在PD-10空柱子里加入2ml的Binding Wash buffer.结合缓冲液。 （4）ProteinA填料混匀，（10ml包装一小瓶）。 （5）加入5ml的ProteinA到柱子中。 （6） （7） （8） 二．纯化步骤 1.样品准备；将兔血清与结合缓冲液1：1混合，过滤（防止堵塞柱子）。 2.平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过Protein A柱。 3.上样：将准备好的血清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。 4.洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。 5.收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液（约3-4ml/管），直至漏出液中不含蛋白。 测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。（注意：收集管中需事先加入约150ul的1M PH9.0 Tris-HCl缓冲液，防止抗体在过酸的环境下失活） 6.柱子再生：用5-10倍体积的再生液再生柱子。 7.PBS透析收集的抗体。 三．试剂的制备 1. 结合缓冲液1000ml 500ml 甘氨酸112.6g 56.3g 氯化钠175.2g 87.6g 氢氧化钠调PH至9.0 2. 洗脱缓冲液500ml
单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针
对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
一、抗体纯化部分 1、腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM 亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。 1.1 Protein G 抗体纯化步骤： （1）新柱子先用DDW 5ml过柱； （2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上； （4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （5）5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH 9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性； （6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱； （7）5倍柱体积20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱； （8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。 其中所用试剂配方： DDW：超纯水 Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠61ml B液，0.2M磷酸二氢钠39ml 磷酸氢二钠4.37g 磷酸二氢钠1.22g 甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7 Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0 1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤： （1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5 （2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积； b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀； c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解； d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋 白充分沉淀； e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解； （3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。 其中所用试剂配方： PBS缓冲液（1L pH 7.0）：氯化钾0.2g 磷酸二氢钾0.2g 磷酸氢二钠3.35g 氯化钠8g
生物技术通报 ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ·技术与方法· ２００８年第３期 收稿日期：２００７－１１－１９ 基金项目：内蒙古自治区自然科学基金重大项目（编号２００４０８０２０４０２）作者简介：侯越（１９８２－），男，硕士研究生，研究方向：动物学生物技术通讯作者：吴应积，教授 引言 抗体是一种特殊的蛋白质分子，被作为体外诊断的试剂、治疗疾病的药物、免疫亲和层析的配基等，在生命科学研究、生物技术及医学领域中有着广泛的应用。尤其是抗体作为各种免疫分析的核心试剂，对免疫分析结果的灵敏度、 特异性起着至关重要的作用。在对一些与生命体功能关系密切的新基因产物的研究中，是否拥有相应的抗体以检测与鉴定新基因的产物蛋白质，是整个研究工作能否深入开展的关键。 抗体技术是免疫学领域中的一个重要方面，广泛应用于生命科学和医学各学科。从第一代抗体———血清多克隆抗体开始，它就在疾病治疗和体外诊断中发挥了很大的作用。由于免疫动物制备血 清抗体的免疫原性和非均质性，给抗体研究和应用造成了困难［１］，激发了人们对抗体进行深入研究的热情。１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ通过杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体即第二代抗体—— —单克隆抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭｃＡｂ），是均质的异源抗体［２］。单克隆抗体具有高度均质性、高度特异性，促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性，是目前应用最广泛的抗体。单克隆抗体的出现，引起了生物学理论的革命，生物学技术的广泛应用提供了重要的工具［３］。２０世纪８０年代采用基因工程的手段研制抗体，并对抗体的基因进行改造和重组等，制备出第三代抗体——— 基因工程抗体（ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙＧＥＡｂ）。基因工程抗体主要对现有的鼠源性单克隆抗体进行人工改造，并 抗体分离纯化技术的研究进展 侯越 罗奋华吴应积 （内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特０１００２１） 摘 要： 制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础，抗体质量的高低，将直接影响试验的成败。抗体 的制备有两个途径：一是一般通用的方法，以纯化的抗原免疫动物，获得多克隆抗体；二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。但不论用何种技术制备的抗体都需要进行纯化。重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法。对当前的纯化方法进行了一个简要的综述。 关键词： 抗体 分离 纯化 ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ＨｏｕＹｕｅＬｕｏＦｅｎｈｕａＷｕＹｉｎｇｊｉ （ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＣｈｉｎａｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，Ｈｏｈｈｏｔ０１００２１） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄａｆｆｉｎｉｔｙｉｓｔｈｅｂａｓｅｏｆｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｄｅｐｅｎｄｓｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｐｒｅｐａｒｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｈａｓｔｗｏｗａｙｓ：ｏｎｅｉｓｃｏｍｍｏｎｌｙｃｕｒｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄ，ｔｏｂｅｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｖｉａｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇａｎｉｍａｌｓｗｉｔｈｐｕｒｉｆｉｅｄａｎｔｉｇｅｎ；ｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｕｓｉｎｇｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｗｈａｔｅｖｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｕｓｅｄ，ｔｈｅｐｒｅｐａｒｅｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｎｅｅｄｓｔｏｂｅｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｉｔｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｃｈｏｏｓｅｔｈｅｐｒｏｐｅｒｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｓｏｕｒｃｅｏｆｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｉｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＩｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫
单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为～，间隔３～５周再同样注射一次，
１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原～，３～４天后，杀死小鼠取脾做融合用。 B. 颗粒性抗原如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以１％浓度每只皮下注射０.２ml，每周２次，共免疫５～８次，取脾前３天，再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大，大到近于免疫耐受的程度更好。 2、免疫动物； 目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/ c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。 大白鼠也可，能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上，发展了小鼠－大鼠，小鼠－人以及人－人杂交瘤技术。 免疫程序、剂量和方法是关系到是否能得到所需要的单克隆抗体的关键之一。 正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生×107~×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。 B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤也有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合，而免疫以后7~8天，虽然是抗体产生的高峰时期，但形成有活力的杂交瘤细胞的可能反而减少。故一般认为加强免疫后的第三天应杀鼠取脾做细胞融合。 3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； 脾细胞制备 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。 (2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。
实验九 多克隆抗体的制备，纯化及免疫电泳 【实验目的】 ⒈ 加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。 ⒊ 了解免疫电泳的基本过程和实验依据。 一、多克隆抗体的制备 【实验原理】 当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。 将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。 免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。 【实验材料】 ⒈ 实验动物 初次抗原注射后的周次 0 1 2 3 4 5 6 7 初次免疫 二次免疫 血 清 中 抗 体 的 水 平
成年兔。 ⒉实验器材 特制兔盒；刀片；25G针头；1ml注射器；20 ml 血液收集管；药铲；离心机以及塑料离心管；加样器及加样管；烧杯。 ⒊实验试剂 ⑴抗原；乙醇；20mM 磷酸缓冲溶液pH7.2。 ⑵福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂： 【实验方法】 ⒈抗原的制备 抗原制备的主要目的在于在免疫动物体内产生最强、最适当的抗体。由于纯化的抗原适合产生抗体，因此在注射前通常采用一些经典的方法，比如柱层析、分级萃取、亚细胞分离等进行抗原的分离和纯化。如果多肽抗原在SDS/PAGE中为可见的单一带，抗原从凝胶中的抽提可作为纯化的最后一个步骤。 ⒉预放血 轻轻的将兔子放在特制兔盒中，处于放松状态的兔子采血会较容易。按压兔子耳根部直至血管突出,然后将针头插入耳部血管的中上部，观察到进针后小心推出活塞收集血液1ml -5ml。结束收集后，退出针头并按压伤处以制止血流，再用乙醇消毒。取收集的血液在37°C 恒温箱中放置30分钟以防止激活补体系统，再将试管在4°C放置过夜使血液凝固。用药铲将血凝块从管壁上拨落，将血液转移至塑料离心管中，4°C，10,000g离心10分钟，收集上清液在4°C保存。 ⒊注射抗原 ⑴准备两只成年兔，将100μg抗原/兔溶入1ml磷酸缓冲溶液中待用。在1ml福氏不完全佐剂中加入分枝杆菌制成完全佐剂，并加入1ml抗原溶液，剧烈震荡使之充分乳化，用3ml注射器抽取该乳化液，接上25G针头，排除注射器中的气泡。从笼中取出兔子放在平坦处，在4个不同的部位进行皮下注射，两处在后背，两处在大腿处。抚去注射处的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮肤。捏出皮肤，将针头以相对皮肤15度的角度进针，进针深度为1cm-2cm，小心不要刺入肌肉中，在4个不同部位分别各注射约500μl抗原溶液。注射结束后，将针在注射处放置几秒钟后再轻轻拔出，并用乙醇在注射处消毒。在4个部位重复上述操作。用相同方法免疫另一只家兔。 ⑵每4-6周注射抗原，并在注射后的7天-10天按照步骤2收集血液。将收集的血液与注射前收集的血液进行比较，检查是否有抗体产生。待确定产生抗体后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。 ⒋收集血液 ⑴将家兔轻轻放入固定架上,二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片倾斜45°在该处切出0.23cm-0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在结束之前出现凝固可用温水轻擦切口处，再继续收集。收集适量血液后可用消毒后的纱布轻擦患处，轻按患处10秒-20秒确定血流停止后方可结束。
单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合
单克隆抗体的制备、纯化及鉴定 一、实验目的： 单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑，它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。 二、实验原理： 骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。 三、试剂与器材： 细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2培养箱、倒置显微镜等。 四、操作方法： 1、抗原制备； 一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。 A．可溶性抗原（蛋白质）以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml～0.6ml，间隔３～５周再同样注射一次，１０天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。
抗体的纯化 第一节硫酸铵沉淀法 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 试剂及仪器 ·组织培养上清液、血清样品或腹水等 ·硫酸铵（NH4）SO4 ·饱和硫酸铵溶液（SAS） ·蒸馏水 · PBS(含0.2g/L叠氮钠) (见附录一) ·透析袋 ·超速离心机 · pH计 ·磁力搅拌器 实验步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。 一、配制饱和硫酸铵溶液（SAS） 将767g（NH4）2SO4 边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1 mol/L, 25°C）； 其它不同饱和度硫酸铵溶液的配制见表1；
二、沉淀 1、样品（如腹水）20 000′g 离心30 min，除去细胞碎片； 2、保留上清液并测量体积； 3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）； 4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。 三、透析 1、蛋白质溶液10 000′g 离心30 min（4°C）。弃上清保留沉淀； 2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L 叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 应用提示 一、先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v)； 2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）； 3、3000′g 离心30 min（4°C），保留上清液； 4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨； 5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效的； 二、为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）； 三、硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。 参考文献 1、Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from murine ascites using a DEAE – disk. Hybridoma
用 户园地Q & A 30 鉴于亲和层析技术的发展,抗原抗体之间的特异性相 互作用，使得抗体的纯化相对来说比较简单,一步亲和层析 即可达到90%以上的纯度, 这为科研和实验室使用的抗体 纯化提供很好的解决方案。然而要得到高质量高纯度的抗 体，需要我们从样品处理，纯化介质的选择以及纯化方法 上悉心考虑，这里我们就这些大家常见的问题来讨论。 1，对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品， 有哪些样品处理的方法？ 在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高 纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿 命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂 蛋白，酚红，小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂 类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是 在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋 白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值 依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球 蛋白。很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释 腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然 并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质 上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如 硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，把样品换到 合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分 子。更多详细的方法可以参考《抗体纯化手册》。 2，实验室需要纯化小鼠的IgG1，我是选择ProteinG 还是ProteinA？ 首先我们要根据不同的种属亚型参考“相对结合强 度”表（图1）来获取选择哪种配基的指导，针对小鼠的 IgG1， ProteinA结合相对弱，可以选择ProteinG配基的介 质。但由于Protein G结合力较强，因此有时需要pH低于2.0 才能有效洗脱，容易导致某些对酸敏感的抗体聚集沉淀。 此时可以考虑结合力相对较弱的protein A填料，结合缓冲 液中需要加入0.5~3M 的氯化钠以增加结合能力，目标抗体 在pH4.5左右就可以被温和的洗脱。 若实验室有AKTA系统，那么Hitrap ProteinG HP是高分 辨率方便快捷的首选。 若没有AKTA系统，MabTrap抗体纯化试剂盒可以给你 带来最大的快捷和便利，试剂盒含有一个Hitrap ProteinG HP1ml的预装柱，结合，洗脱和中和的缓冲液，一个具有 接头的注射器、以及经过优化的纯化操作规程。 Ab Spin Trap是预装了100ulProteinGHP填料的离心 柱，和标准的小离心机一起使用，仅用20分钟就可以完成 一次小规模的抗体纯化。 ProteinG HP MultiTrap96孔板适用于高通量的筛选。 3，面对ProteinA如此多的配基形式，它们有何区别 和应用？ 蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他 杂蛋白流穿，具有极高的选择性，通常一步亲和层析就可 达到超过95%的纯度。 ProteinA sepharoseCL-4B，是将从金黄色葡萄球菌表 达纯化出蛋白A通过CNBr的方法偶联在sepharose CL-4B的 介质上，可以纯化体液或细胞培养液中的免疫球蛋白。 nproteinA sepharose4FF，nprteinA即为天然 (Native Protein A)，表示其在生产过程中没有引入任何动物来源的组分。 rproteinA sepharose4FF，重组的蛋白A (rProtein A)， 经基因工程改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位 点定向偶联于琼脂糖骨架上，有效降低空间位阻，增加了 与IgG 的结合能力。同时配基在发酵和纯化过程中没有引 用人源的IgG，避免了人源IgG的污染风险。 rmpProteinA，多位点附着的技术，保证更低的配体 的脱落。一步高度纯化单抗和多抗。 2005年我们推出了新一代的MabSelect ，是第一个使 用高流速琼脂糖凝胶 ( High ?ow Agarose) 作为骨架的新型 蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计。相比传统 抗体纯化常见问题回答
单克隆抗体分离纯化中的离子交换层析介质 离子交换层析介质在生物技术制药中应用广泛。可以设计层析工艺中的各个步骤中使用，如：捕获，中度纯化、精细纯化等步骤。在抗体纯化工艺中广泛使用的三步法：protein A捕获-阳离子交换-阴离子交换。 2.1.阳离子交换CEX层析介质 在抗体纯化工艺中，CEX一般使用吸附模式（Bind-and-Elute BE）。阳离子交换可以去除HCP、脱落的Protein A以及部分高分子量的聚体等杂质。Protein A 的PI在5.1；而单克隆抗体的PI一般在4-9，大部分在PI超过6.0。更改上样的pH 可以使脱落的Protein A的或Protein A的降解片段在流穿中去除，也可在上样后 的中间清洗步骤中去除。文献报道阳离子交换的载量（Protein A捕获洗脱样品） 在几十mg/ml 以上。并且收率较高均>98%. Sp Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重要的。这些介质的常规线流速是100至400cm/h。 2.2.阴离子交换AEX层析介质 阴离子交换在抗体纯化工艺中可以去除DNA、病毒、Protein A脱落、内毒素、部分聚体以及酸性的HCP。 在抗体工艺中AEX层析一般采用流穿模式（Flow-through FT），既上样过 程中抗体在穿透峰，杂质吸附在层析介质上。对于PI比较高的抗体分子，pH在7-8.0左右时，抗体流穿。而DNA、内毒素以及病毒等可以吸附在层析介质上。文献报道，阴离子交换的载量在140mg/ml 以上。根据抗体的性质，选择适当的pH，在低电导下，抗体流穿。典型的结果：收率99%，DNA<10pg，protein A<10ppm. Q Sepharose FF 是在生物制药中使用非常广泛的一类阳离子交换介质。琼脂糖为生物兼容性层析介质，这类介质是纯化工艺中初步分离粗的混合物的首选。此时良好的分辨率与高流速的结合是非常重要的。这些介质的常规线流速是100至 400cm/h。
单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HAT培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都
抗体的纯化：盐析法 发布时间：2009-02-18 新闻来源： 精制抗体的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。 一、原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 1、试剂 （1）正常人混合血清；灭菌生理盐水。 （2）饱和硫酸铵溶液的配制 称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15N NH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。 （3）萘氏试剂配制 称HgI 11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH 50ml。 （4）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline PBS）配制： 贮存液 A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml； B液：0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H2O 3.12克，加蒸馏水至1000ml； 应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。 （5）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer P配制 将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。 （6）20%磺基水杨酸。