综述溶菌酶的制备及其性质
Abstract：Lysozyme is a kind of glucoside hydrolytic enzyme，and its molecular weight is about 14000—15000Da．Lysozyme can hydrolyze the glucoside bond β -1，4 between N-acetyl muramic acid，so that it can dissolve the cell wail of gram-positive bacteria and bacteriolyze．It can be applied in many areas，for example，in food and drink fields as antiseptic substance and in medical domain as germicide.
【实验要求】：
通过探索和学习相关内容的理论和技术，熟悉并进一步掌握酶的提取，分离，纯化，检测溶菌酶的生物学性质和理化性质。
【实验原理】 :
溶菌酶：是一种有效的抗菌剂，又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
来源：自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的鼻涕、唾液、眼泪、尿、血浆、乳汁、淋巴液及鼻黏膜、肠道、腮腺、白细胞、肺、肝、脾、肾的细胞中，以及植物界中的卷心菜、萝卜、无花果、术瓜、大麦中，但以蛋清中含量最丰富。
理化性质：分子量14700；溶于水，不溶于乙醚和丙酮，等电点为10.8，最适pH值6.5。最适温度50℃；稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质，其中：卵白蛋白75%，卵类粘蛋白15%，卵粘蛋白7%，伴白蛋白3%。卵白蛋白分子量45000，pl4.7；卵类粘蛋白鸡卵粘蛋白分子量28000，pl3.9-4.5；伴白蛋白分子量77000，pl3.9。
实验方法：
a．热变性法：溶菌酶在酸性条件下耐热性好，耐热89°C以上，100°C加热仍然保持活性，而杂蛋白卵蛋白等变性温度低。可用热变性法来去除杂蛋白。
b．等电点沉淀法：蛋清中其他蛋白等电点较低，为3到5左右（见上一步蛋清成分分析），溶菌酶pl为10.8，可用调pH来去除卵蛋白，来提高溶菌酶浓度。
c．D152树脂柱层析法：离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间进行交换的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，可采用阳离子交换树脂。
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。树脂对离子亲合
力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在
低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。对于在
弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为：Ag+＞Cs+＞Rb+
＞K+＞NH4+＞Na+＞H+>Li+。根据弱酸性阳离子交换树脂的亲和力顺序，相同条
件下弱酸性阳离子交换树脂对H+的亲和力比对Na+的亲和力要大，可采用D152，D201，D903型大孔树脂进行交换。蛋白质中溶菌酶含量一定，由于树脂对H+
的亲和力比对Na+的亲和力要大，而使得溶菌酶与Na型树脂交换得更彻底，故
本实验采用Na型树脂。
d．Sephadex- G-50分子筛柱层析：葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而
在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全
被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间
流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的
网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。Sephadex-G-50为
每克凝胶膨胀时吸水5.0克，SephadexG-50 葡聚糖凝胶 G-50 分离范围
1500-30000 适用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。
e．SDS-PAGE：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素，通过迁移率不同经过跑柱和染色后可以得到不
同蛋白质的分离带，来鉴定蛋白质的种类。本实验用来验证只有一条带（溶菌
酶），来鉴定纯度（可能只有溶菌酶）。
f．Folin-酚试剂法测定蛋白质含量：此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白
质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中
的肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白
质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在
一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。
g．微球菌和溶菌酶作用测定酶活力：由于溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm
波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。
h.超滤法提纯蛋清溶菌酶：超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大
分子物质留在膜内不透过，从而实现对酶的浓缩精制。超滤法的优点有不易引起酶
变性失活，而且操作比较方便，因而近年米在酶制剂生产中得到了研究和应用。但
存在膜容易堵塞，操作时间长等缺点。本文通过对超滤法提纯蛋清溶菌酶的研究，
对提纯到的酶的收率和活性与酸性条件下热处理法、离子交换树脂法进行比较。
i.
【实验步骤简述（具体操作流程见书）】：
鸡蛋清的制备(pH<=8) 鸡蛋清粗提取（去除较大的杂质）
D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析（洗脱杂蛋白，根据分子量以及酸碱性）
Sephadex-G-50分子筛柱层析（根据分子量大小进一步进行提纯溶菌酶）
溶菌酶活力测定（根据产物在450nm处特定吸收光密度下降来测定活力）
蛋白质分子量测定（福林酚法）蛋白质纯度测定（SDS-PAGE显示一条带来表示纯度很高）理化常数和激活抑制剂的测定
【实验方法讨论】：
1.溶菌酶的提纯方法：
由于我国的溶菌酶生产存在收率低、活性低等缺点，所以目前溶菌酶的市场人部分依赖进口。本研究通过对热处理法、离子交换树脂法和超滤法提纯溶菌酶效果的研究，目的就是寻找一种操作简单、成本较低、适合产业化生产的方法，井尽可能提高溶菌酶的活性和收率，满足国内市场的需求。
2.酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：
在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在接下来的实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热以及调等电点来除卵蛋白的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。加入磷酸盐缓冲液后经热处理和调pH值到卵蛋自等电点，沉淀中不再含有溶菌酶，实验证明加入磷酸盐缓冲液可以去除溶菌酶和卵蛋向之间的静电作用力。研究得出去除卵蛋白效果最好的时候是在pH=7.5的磷酸盐缓冲液的条件下，100°C下热处理2min，上清中溶菌酶纯度可达到67.17%，远高于其它条件的磷酸盐缓冲液以及碳酸氢钠缓冲液条件下的处理效果。该方法虽然简单成本低但是也造成蛋清余液无法重复利用，加人了实际生产成本。
3.离子交换法提纯溶菌酶
离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间的离子交换而进行的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，常采用刚离子交换树脂。本实验选用了一种弱酸性阳离子交换树脂进行溶菌酶的提取，并探索了不同条件对溶菌酶活性及收率的影响。溶菌酶的提
纯纯度、收率和活性除了受到离子交换树脂类型的影响外，洗脱液的类型和浓度、蛋清的pH 值、提纯温度、均质条件、稀释倍数等也对其影响很大。
通过对离子交换法提纯溶菌酶的纯度和活性研究表明，温度对溶菌酶纯化有一定影响，随着温度的升高，酶和树脂的吸收速率也随之加快：而蛋清液的pH值对提取到的溶菌酶活性和收率的影响是最大的，这是因为溶菌酶是碱性蛋白质，在偏酸性条件下比较稳定，碱性条下容易出现分解；蛋清得稀释倍数和均质条件对溶菌酶纯化也有一定影响，但稀释倍数超过4倍的时候树脂与溶菌酶的专一性吸附受到破坏，洗脱液中含有大量的卵蛋白，这是因为为稀释造成了溶菌酶和树脂之间的专一性吸附受到影响的原因，而均质则是通过破坏溶菌酶的物理结构破坏其活性。
实验得到的溶菌酶的收率、纯度和活性都很理想，同时由于离子交换法原料来源简单、易丁再生、操作时间短、易于一体化生产．而且吸附后的蛋清能再利用的特点，成为大批量生产溶菌酶的理想方法。
4．超滤法提纯溶菌酶
超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大分子物质留在膜内不能透过，从而实现对酶的浓缩精制。超滤法的优点有不易引起酶变性失活．而且操作比较方便。溶菌酶分子量14000-15000Da，相对卵清蛋白分子量45000Da是一类分子量较小的物质。因此本实验用截留量的膜提取溶菌酶获得了较好的效果，但是超滤法在实际操作过程中超滤时间过长，超滤膜易堵塞，这限制了它进行溶菌酶工业化生产的利用。因此，有必要对超滤条件进一步进行研究。
5.溶菌酶的磁性亲和分离
很多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合，这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。磁性介质被广泛用于分离细胞、核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。磁性亲和分离技术是将亲和吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。
6.酶纯度的测定分析
蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学方法，如：电泳、HPLC等。其中常用的电泳分析方法
有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等。纯的蛋白质在一系列条件下进行电泳时，都将以单一的速度泳动，它的非变性电泳图谱应只呈现一条染色带。HPLC常用于多肽、蛋白质纯度鉴定，纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一
的对称峰。
电泳结果分析：
1.根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。
2.根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率，计算目的蛋白的分子量（以lgM 对迁移率R作图，其中M为蛋白质分子量）。
7.酶活力的测定
酶活力的测定采取溶菌酶能水解溶壁微球菌，使得底物悬浮液的浊度（可用450nm 波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性的经典方法。然后计算酶活力的单位：
酶的活力单位数=△A
nm/t×0.001
450
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
8.酶含量的测定
除福林酚法外，又一方法：
蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G-250法分析溶液中可溶性蛋白的含量。取50uL的样品液加进2.5mL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5min后，在595nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出蛋白含量。（由标准曲线求得的回回方程为：酶样蛋白含量：b(mg/mL)=1.674×A595nm-0.0354）
【影响因素】：
1.对酸性条件下通过热变性利等电点变性的方法去除卵蛋白提取溶菌酶的效果研究发现．溶菌酶和卵蛋白之间存在相互结合作用，在加热以及调等电点的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。加入磷酸盐缓冲液可以破坏溶菌酶和卵蛋白之间的结合作用，可以有效的提取溶菌酶。
2.比较pH值7.5的磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠缓冲液的处理效果，结果发明，碳酸氢钠缓冲液条件下100°C下处理2min时可得到纯度40.8%的溶菌酶，而pH值7.5的磷酸盐缓冲液处理得到的溶菌酶纯度好于碳酸氢钠缓冲液可达到67.2%。
3.离子交换法提纯溶菌酶的纯度和活性的研究表明，用D152型阳离子离子交换树脂提取溶菌酶时，洗脱溶菌酶的最佳洗脱液浓度为0.28mol/L；阳离子交换树脂和蛋清的饱和吸附比例为1:6.18；饱和吸附时间为80min；常温（20—30°C）的条件有利于溶菌酶的交换吸附。溶菌酶的得率为86.6%，活性为20000U/mg。
4.利用分子量截留值为30000的超滤膜对经均质后的鸡蛋清进行超滤．超滤压为0.1M 可得到活性为18500/mg，得率为73.1%的溶菌酶。
5.溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制性实验结果得未经热处理的溶菌酶溶液和pH值
6.0并在80°C下．加热30min得到的热处理溶菌酶溶液对这两种菌的抑菌能力无显著性差异，而1组、2组的溶菌酶溶液和3组之间对这两种菌的抑菌能力存在显著性影响。从上述数据我们可以看出大肠杆菌对溶菌酶的敏感度远高于金黄色葡萄球菌，而酸性条件下溶菌酶的热稳定性较好。
韩山师院化学系化学专业物理化学实验课实验报告 实验六胶体溶液的制备与性质 实验目的： 了解水溶胶的制备方法及胶体溶液的一些性质。 实验原理： 分散相的粒子直径在10-9~10-7m之间的分散物系叫做胶体。胶体物系的制备方法有两种：一种是分散法，使粒子较大的物质分散成胶体物系；另一种是凝聚法，使溶质分子原子或者离子自行结合成胶粒大小而形成溶胶。本实验利用凝聚法制备Fe(OH)3溶胶和MnO2溶胶。 通常溶胶都具有比较稳定性质，如可以在密闭条件下保持比较长的时间而不会产生沉淀，原因在于胶粒具有一定的ζ电位和溶剂化膜，故当加入一定的电解质时，胶粒电性相反的溶胶或其它物质使ζ电位降低，溶剂化膜变薄时，胶体变得不稳定并发生聚沉。本实验研究正溶胶Fe(OH)3和负溶胶MnO2的这些性质及渗析作用。 实验用品：仪器：酸式滴定管（50mL）、试管15支、烧杯（25mL×2，100mL×1）、量筒（100mL×1，50mL×1,10mL×1）丁达尔现象观察筒、试管架、锥形瓶（250mL×6）、移液管（25mL×1，2mL×2，1mL×4）玻璃棒、吸量管（10mL×1、2mL×2，1mL×1）、酒精灯、三脚架。试剂：1mol/L盐酸、0.1mol/L KMnO4溶液、2.5mol/L KCl溶液、5% 氨水、0.01mol/L K2CrO4溶液、10% FeCl3溶液、1% H2O2溶液、0.001mol/L K3[Fe（CN）6]溶液、1mol/L Na2S2O3溶液 实验内容及其现象记录：
问题与讨论： 1、用量筒量取190mL蒸馏水进行加热一定要沸腾后才能逐滴加入10mL10% FeCl3溶液。 2、在制取MnO2溶胶时，滴加H2O2时一定要慢慢滴加，充分搅拌，否则会产生沉淀，当 用玻棒醮取该溶液点于滤纸时把滤纸染为粉红色，应注意要求外围的一小圈为粉红色，中间大部分是黄褐色，否则还得继续滴加1% H2O2溶液。 3、在做KCl 、K2CrO 4、K3[Fe（CN）6]溶液对Fe(OH)3溶胶的聚沉作用的实验中要求每次 混浊程度应一样，可用一瓶不加电解质的原始溶液来比较，以后的各瓶就可以这一瓶作为参照来得到满意的实验结果。
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告 学院：生物科学与工程学院 班级： 姓名： 学号： 组别：第七组 组员：
一、实验内容： 溶菌酶的提取和系列性质测定 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。 本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。 二、实验原理： 1蛋白质提取分离技术 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代
生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 2.柱层析技术 柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。 根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
内容 1：溶菌酶简介 1.1 溶菌酶 溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。 溶菌酶存在 在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。 从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。 溶菌酶生理作用 在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用 2：溶菌酶的种类 溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。 根据来源不同，将溶菌酶分为三类 （1）动物源溶菌酶 ?动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。 ?鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子 量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH 在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍 有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。 鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。 人溶菌酶分子量为14600，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。 （2）植物源溶菌酶 目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000～29000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 （3）微生物源溶菌酶 上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
溶菌酶的研究及应用简介 摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。 关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展 溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。但以脾、肾含量较高。在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。 1 溶菌酶的发现 1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。1909年https://www.doczj.com/doc/90291110.html,schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus
lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。 2 溶菌酶的理化性质、空间结构 2.1溶菌酶的理化性质 溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强。当pH值为1.2～11.3围剧烈变化时，但其结构几乎维持不变。当pH值为4～7，96℃热处理15 min仍能保持87%的酶活性；当pH值为3 时能耐100℃加热处理45min；但碱很容易破坏酶活性，当处于碱性pH 值围时，溶菌酶的热稳定性就很差[4]。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜。易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。其分子结构如下: 2.2 空间结构 溶菌酶是第一个结构弄清楚的酶，在很长一段时间中,其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究。这些进展都是利用溶菌酶获得的溶菌酶一直
溶菌酶 2010级基地班马冬珂10104109 一：溶菌酶的性质： １９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。（1） 溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的８—１，４键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解。是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。 二：提取原材料和提取方法: 溶菌酶广泛存在于家禽的蛋清、哺乳动物组织的分泌液中，一些植物（如卷心菜、木瓜等）的汁液中也有强力的溶菌酶活性。目前一般从蛋清和蛋壳中提取溶菌酶。 提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质， (2) 提取方法： １.蛋清中溶茵酶的提取：蛋清中的溶菌酶可用吸附法提取，过程如下：蛋清过滤（９０目１００目），加入７２４型树脂吸附（每公斤蛋清加１５ｇ）一倾去蛋清一冲洗并控干树脂。用质量分数１０％硫酸铵洗脱一洗胶液中加入晶体硫酸铵（３０ｇ／１００ｍＬ）沉淀溶菌酶，沉淀晾干即得到溶菌酶粗制品。蛋清中的溶菌酶也可用直接结晶法制取，即在蛋清中加入食盐（ＮａＣＩ）。使其质量分数达到５％，并调节溶液ｐＨ值至１０．０左右，加入少许溶菌酶晶体为晶种，于-４摄氏度冰箱冷却静置７ｄ一１４ｄ即可获得溶菌酶的结晶品。这种工艺方法可获得较高纯度的溶菌酶，收率也比较高。可广泛用于从蛋清提取溶菌酶的工业化生产。 ２.蛋壳中溶茵酶的提取：蛋壳中（实际上是蛋壳膜）溶菌酶含量虽然较低，但从变废为宝的角度考虑，仍是提取溶菌酶的重要原料。具体工艺流程如下：蛋壳一质量分数１％ＮａＣＩ抽提滤液加热去除杂蛋白，加聚丙酸凝聚（富集），溶解凝聚物，加氯化钙沉淀上清液结晶。 三：制备（重点）： 1..酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热
国内的溶菌酶的应用与发展 溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年 Flem ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶 [1] 。1965年,英国的菲利普等用 X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构 [ 2 ]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,但可以预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制结构特点与复杂性 大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白 ,相对分子量在14000 ～18000。其等电点可达 10 7,存在 4 个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50 ℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜 ,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强 ,在 pH4 ～7 时,100℃下处理1m in 酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理 45m in 仍能保持活性{3}。溶菌酶在水溶液中6215 ℃下,维持30min则完全失活,在2015%
的乙醇中,在 6215 ℃下维持 20m in而不失活[4]。王玮等[5]研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成 ,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现 ,当酶浓度较低时,017mol/L 的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外 , 溶菌酶和其它酶具有相似的性质 , Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β- 环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80% 。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为 210mol /L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。 溶菌酶的抗菌作用机制 目前已知的几种溶菌酶有:内- N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N -乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β 1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以内 - N - 乙酰己糖胺酶为例,内- N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分
胶体的制备与性质 第一节 胶体的制备和净化 胶粒：1—100 nm ，原则上可由原子、分子凝聚成胶体（凝聚法），也可由大块物质分散成胶体（分散法）。 一、胶体制备的一般条件 1. 分散相在介质中的溶解度必须极小，浓度低 OH H C S 52+——真溶液）溶胶（溶解度极小，滴入水中O H S 2/???→? 低溶解度是形成溶胶的必要条件之一，同时还需要反应物的浓度很稀，生成的难溶物晶粒很小而又无长大条件时才能得到胶体。若反应物浓度很大，细小的难溶物颗粒突然生成很多，易形成半固体状的凝胶。 2. 必须有稳定剂存在 分散胶体体系中存在巨大的界面积，属热力学不稳定体系，胶体需要稳定剂作用才能稳定存在。 二、胶体的制备方法 1. 分散法：机械分散、电分散、超声分散和胶溶法 通过不同的能量或作用方式分散大块物体→胶粒 胶溶法是某些新生成的沉淀中加入适量的电解质或置于某一温度下使胶体重新分散成溶胶。 如正电胶MMH （moled metal hydroxide ）或MMLHC ：mixed metal layered hydroxide compound 在一定比例的AlCl 3·MgCl 2 混合溶液中，加入稀氨水，形成混合金属氢氧化物沉淀（半透明凝胶状），经多次洗涤后（目的在于控制其中的氯离子浓度），置该沉淀于80℃下恒温，凝胶逐渐形成带正电的溶胶。MMH 用途很广——钻井液添加剂、聚沉剂、防沉剂等。 胶溶法：新形成的洗涤过的溶液沉淀加入少量33)(FeCl OH Fe →搅拌→沉淀转化为红棕色的3)(OH Fe 溶胶→机械粉碎——球磨机、振动磨、冲击式粉碎机、胶体磨、离心磨。 研磨过程中，增大增大，S A G S ，颗粒有聚集倾向（颗粒间有吸引力；颗粒增大，S G 减小）。分散?聚集平衡，颗粒不再磨细。要提高研磨效率，防聚可采取溶剂冲稀或加入稳定剂吸附表面——工业SAA ，油漆工业，研磨色料（SAA 保护） 电分散：电弧使金属气化，分散于溶剂中，得到溶胶。 超声波分散：对被分散的物质产生很大的撕碎力。 2. 凝聚法：用物理或化学方法使分子或离子聚集成胶粒。 （1） 还原法——金属溶胶
溶菌酶的提纯结晶和活力测定 姓名：学号： 班级：指导老师： 一、实验前言 1.实验背景 溶菌酶（lysozyme）是一种能够水解细胞壁成分中N- 乙酰胞壁酸与N- 乙酰葡萄糖胺之间的β- 1，4 糖苷键的酶，被广泛应用于医药、食品工业、生物工程等方面，现从鸡蛋蛋清中提取溶菌酶已达到工业化生产水平。蛋清中的溶菌酶含量越高，酶活力越强，越有利于鸡蛋的保存，因此测定鸡蛋蛋清中的溶菌酶对我国溶菌酶生产、禽蛋产品加工有重要的指导作用，也为蛋品质评定提供了一个重要参数。 活力测定的基本原理是用一种细菌悬液作为基质,加入待测标本后保持一定时间,如样 品中含有溶菌酶则细菌被溶解,即其细胞壁不溶性多糖变成可溶性粘肤。测定方法很多:如平皿测定法、光电比浊法、粘度测定法、分解产物测定法(因为底物往往过量,通常不用底物)、化学滴定法、分光光度法及同位素技术,其中以平皿测定法和比浊法最为常用。 溶菌酶分布很广,而且不是单独存在的,往往是和许多因子共同作用、相互协调。同时,可以直接或间接地通过酶的分解产物而起作用。在这里许多问题正处于摸索阶段,有些方面通过特定的实验,预测其应用。而这些特定的实验往往对某种或某一个动物而言,还有其局限性。未定论的问题很多,许多应用尚未大面积使于临床,但是溶菌酶必将越来越引起人们的重视,特别是其广布于人体,在医药、科研方面的作用尤为重要. (l)抗菌 溶菌酶不但作用于革兰氏阳性细菌,而且它作为一种非特异性免疫,即对所有的病原微 生物都有一定程度的抵抗力,没有特殊的选择性,对身体的自然防御起很大作用.如鼻粘膜,口
腔中含有一些溶菌酶,临床用于治疗副鼻窦炎和龋齿;眼泪和白血球中溶菌酶含量最高,因此在干燥综合症诊断上,认为泪液溶菌酶值的下降可以提供敏感可靠的指标,并能反映泪腺受损程度;在白血病患者的尿中,含有大量溶菌酶,临床上可有效地诊断白血病。白血球中的溶菌酶在脱颗粒过程中被排列到噬菌体内,噬菌体感染宿主(抗原)后,诱导产生溶菌酶(抗体),这种溶菌酶是噬菌体染色体组,通过细胞壁分解酶和膜多糖分解酶的作用而表现,其主要功能一是使噬菌体产生吸附作用,二是使噬菌体向宿主菌体内注入DNA,溶菌酶在噬菌体侵入宿主菌细胞和溶菌的整个过程中都起着重要作用,此溶菌酶(抗体)和补体共同作用,使某些微生物敏感,因此,溶菌酶可能和噬菌体内其他抗微生物系统有协同作用,主要作用是消化细菌,而不是杀死细菌。普遍认为,这种白细胞具有抗肿瘤作用和治疗由细菌、病毒引起的炎症。以上这种抗原—抗体反应也可以在体外进行溶菌反应,即血清学反应,可解析细菌表层结构和作为研究分子生物学的材料,通过它寻找新酶类,也可用做病毒性传染病的诊断。 (2)抗病毒 一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。 (3)提高抗菌素疗效 因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。 (4)组织修复
实验一溶菌酶的溶菌作用 实验目的： 1、掌握溶菌酶对革兰氏阳性菌溶解的原理及应用。 2、证实体液中溶菌酶的存在观察溶菌酶的溶菌现象。基本原理： 正常情况下，机体的唾液、泪液、痰、鼻腔分泌物以及白细胞和血清等均含有丰富 的溶菌酶。测定分泌物和体液中的溶菌酶含量及其变动情况，可作为评价机体非特异性免疫功能的指标之一。 溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的B - 1,4 糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对 象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构， 故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。实验材料： 1、葡萄球菌：本菌是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。 2、标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用蒸馏水配制为1000ug/ml 原液， 并稀释为100、50、10 ug/ml 标准液，用前保存在冰箱中。 3、唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。（于饭后两小时，清水漱口3 次，10 分钟后，收集唾液于清洁烧杯中）； 4、其它：无菌打孔器（孔径2mm ），无菌毛细吸管、毫米尺等。实验方法： 1、制备含葡萄球菌的琼脂平板加热融化3%琼脂，冷至60C ~70C时， 加入1ml 葡萄球菌菌液，混合均匀，倾注于无菌平皿内。 2、用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，孔径2mm 左右，孔距5- 20mm 。用针头挑出孔内琼脂， 3、用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加满唾液,同时加标准溶菌酶作阳性对照。 4、置24-28 °C下12-18h观察结果。观察各孔周围溶菌情况，测量溶菌环直径。实验结果： 用毫米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对
二氧化碳的性质及制取 【知识梳理】 知识点1 二氧化碳的性质（重点） 1．物理性质 通常状况下，二氧化碳是一种无色无味的气体，能溶于水密度比空气大，固态二氧化碳俗称“干冰”。 2．化学性质 （1）一般情况下，二氧化碳不能燃烧，也不能支持燃烧，也不能供给呼吸。 （2）二氧化碳与水反应。 二氧化碳与水反应生成碳酸（H2CO3），H2CO3是一种弱酸，可使紫色的石蕊试液变红，且H2CO3不稳定，常温或加热条件下，易分解为H2O和CO2。因此二氧化碳通入紫色的石蕊试液中时，由于石蕊遇到生成的碳酸而变红；加热时，由于碳酸的分解，红色试液又恢复紫色。化学方程式如下：CO2+ H2O === H2CO3H2CO3 === CO2+ H2O （3）二氧化碳可以与碱溶液反应（比如，氢氧化钙溶液，这也是二氧化碳气体的检验方法）。 CO2+ Ca(OH)2 == CaCO3↓+ H2O 二氧化碳的检验方法：把气体通入澄清石灰水中，如果澄清的石灰水变浑浊，说明气体就是二氧化碳气体。 知识点2 二氧化碳的实验室制法（难点） 1．反应原理： ⑴药品：石灰石或大理石（主要成分都是碳酸钙）与稀盐酸。（固液不加热型） ⑵制取原理： CaCO3 + 2 HCl === CaCl2 + H2O + CO2 ⑶实验室制取二氧化碳的药品选用，还要注意以下几个问题： ①不能用浓盐酸。浓盐酸易挥发，使生成的二氧化碳气体中混有氯化氢气体，导致CO2不纯。 ②不能用硫酸。虽然硫酸也能跟碳酸钙反应生成二氧化碳：H2SO4+CaCO3 === CaSO4+H2O+CO2↑；但由于产物硫酸钙微溶于水，形成的沉淀会附着在块状大理石或石灰石的表面，阻碍反应继续进行，所以实验室用大理石（或石灰石）制取二氧化碳时，一般都选用稀盐酸。 ③不用粉末状碳酸钙或碳酸钠固体，虽然Na2CO3+2HCl ==== 2NaCl+H2O+CO2↑，但此反应激烈，不便于控制。 2．实验装置： 任何实验装置的设计都是由反应物的状态、反应时所需的条件、反应过程和生成物的性质等方面的因素决定的。 说明：上述装置中锥形瓶也可用大试管、广口瓶、烧瓶等来代替，长颈漏斗也可用分液漏斗代替，也可不用长颈漏斗。 【方法探究】⑴长颈漏斗的下端应插入液面以下形成液封，防止生成的气体从长颈漏斗中逸出； ⑵反应器内的导管稍露出胶塞即可，不宜太长，否则不利于气体导出； ⑶集气瓶内的导管应伸入到接近集气瓶底部，以便于排净空气。
溶菌酶晶体培养实验 获得质量较好的晶体是开展X-射线衍射技术的前提。溶菌酶结晶实验就是要让学生亲自动手实验来获得实实在在的晶体。溶菌酶易于结晶，结晶条件简单，通常被选来作为蛋白晶体入门教学。 原理和方法： 溶菌酶（lysozyme）是由129个氨基酸组成的，分子量为14307Da的较稳定的无毒的碱性球蛋白。 蛋白质结晶通常是利用气相扩散（Vapor Diffusion）的原理来完成：也就是将含有高浓度的蛋白质（5-50mg/ml）溶液加入合适的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沉淀状态时，蛋白质分子将整齐的堆积形成晶体，包含纯化蛋白、缓冲液和沉淀剂的小液滴，与大样品池中相似缓冲液和更高浓度的沉淀剂之间形成平衡。起初，蛋白质溶液中的小液滴包含了低浓度的沉淀剂，随着水分的蒸发并转移到大样品池中，沉淀剂浓度也增大到最合适蛋白结晶的水平。当系统处于平衡状态，这种最佳条件就继续维持直至晶体产生。 利用气相扩散原理获得晶体的实验操作方法有两种，分别是：悬滴法和座滴法。此次实验采用的是悬滴法。 下面是模式图：
这次实验所用的为5mg/ml,10mg/ml,20mg/m,30mg/ml的溶菌酶溶液（已经在实验前准备好了）。 池液：A液0%(M/V)的NaCl溶液，pH=4.8 B液30%(M/V)的NaCl溶液，pH=4.8 实验步骤： 1.将16孔板向下轻磕几下，将孔内可能存在的杂物磕出来，并用洗耳球吹几次。 2.向针管中装填真空脂。 3.用针管在16孔板的边缘涂真空脂，确保均匀。 4.向16孔板中的每个孔按照一定的比例加入A液和B液，总体积为300微升， 接着用移液枪将池液吹打混合均和。下附参考的池液混合比例表（也可自行安 排混合比例，标准的生长溶菌酶的条件：20mg/ml的溶菌酶溶液和10%的 NaCl溶液。过高浓度可能会发生沉降，过低浓度可能会生长的晶体太小，但 是作为探究性试验，可以在标准的附近拉一下梯度。） 5.取出一个硅化好的玻璃片，确保光滑面朝上，用洗耳球吹干净其表面。
溶菌酶活性的测定 方法一 1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h， 2000r/min离心10min，取上层血清备用； 2.用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)配制成一定浓度的菌悬液（O.D.570=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）； 3.取3.0 mL该悬液于离心管中，再加入50μl血清混匀，570nm下测初始光密 度值（A0）； 4.然后将试液移于37℃水浴30 min； 5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）； 6.计算。 公式： U=(A0-A)/A U：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值 方法二 1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h， 2000r/min离心10min，取上层血清备用； 2.用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)配制成0.2mg/ml的菌悬液； 3. 3.0 mL该悬液于离心管中，再加入40μl血清混匀，540nm下测初始光密度 值（A0）； 4.然后将试液移于28℃水浴30 min； 5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）； 6.计算。 公式： U=(A0-A)/A
U：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值 方法三 准确称取溶菌酶标准品，用pH 6.4，1/15 mol/L PBS配成1ug/mL，，临用时用PBS稀释成500，100，50，25，10 ug/mL标准液，用以制成标准曲线。以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物，用1/15 mol/L，pH 6.4磷酸缓冲液配成一定浓度的悬浊液（用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度为透光率达30％-40％）。O.D.530=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）。 取0.1 mL血清于小试管中，置28℃水浴锅中预热5 min，然后加入1.8 mL 已预热的菌液，立即计时，至2 min时加入2滴5 mol/LKOH溶液以终止反应，立即用0.5 cm比色杯于640 nm波长测其透光率T1％。取同样血清0.1 mL于1滴5 mol/L的KOH溶液中摇匀，28℃预热5 min后加入1.8 mL已预热的菌液，在同样温度下至2 min时同法测定其透光率T0％。T1％－T0％为透光率差值，即溶菌酶所致透光率的变化。再从标准曲线上可查血清中溶菌酶含量。 附： A所需器材 离心管温箱移液枪枪头血凝板冰离心架722分光光度计水浴锅剪刀 B所需试剂 灭菌生理盐水:0.65% 0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)： 甲液：KH2PO49.08g/L 乙液：Na2HPO49.47g/L或Na2HPO42H2O 11.88 g/L 或Na2HPO47H2O 17.87g/L或Na2HPO4 12H2O 23.88 g/L pH6.4的PBS为：甲液73.5mL 乙液26.5ml
制备氢氧化铁胶体 【实验目的】：制备氢氧化铁胶体，比较其与氯化铁的区别。 【实验要求】：保证安全，尽量不损坏仪器。成功制备氢氧化铁。【实验原理】：FeCl3+6H2O=加热=Fe(OH)3（胶体）+3HCl 【实验设备及环境要求】：铁架台、石棉网、酒精灯、小烧杯、量筒。 要求环境干净整洁，没有极易燃物。 【实验步骤】：准备实验（护目镜等）→组装仪器（由下至上，由左至右）→量取25mL蒸馏水，倒入小烧杯中→点燃酒精灯→将蒸馏水加热至沸腾，滴入饱和氯化铁溶液5-6滴，继续煮沸至溶液呈红褐色→熄灭酒精灯，停止加热→取下小烧杯，观察其与氯化铁外观差异→试验其丁达尔效应→在两只烧杯中分别加入相同量的含有悬浮颗粒物的浑浊污水→向其中的一只烧杯中加入10mL氢氧化铁胶体→静置，比较两只烧杯中液体的澄清程度→拆除清洗所有仪器，结束实验。【实验结果】：(1)氯化铁溶液呈棕色，氢氧化铁胶体呈红褐色。 (2)制备得到的氢氧化铁胶体具有丁达尔效应。 (3)加入了氢氧化铁的颜色深于另一烧杯中液体，但更 澄清。 【讨论和分析】：成功制备出氢氧化铁胶体。 (1)氯化铁的水解反应 FeCl3+6H2O=加热=Fe(OH)3+3HCl。为什么产生的盐酸与氢氧化铁不反应呢？原因大致有二。 一、是因为高温反应时，盐酸挥发成气体，不接触无法反应。
二、是因为氢氧化铁和盐酸反应主要是因为氢氧根负离子和氢正离子结合，但制备的氢氧化铁胶体为带正电的粒子，氢离子也带正电，不反应。 (2)氢氧化铁胶体会出现聚沉现象。因为煮沸时间过长温度高，加剧了胶体粒子的热运动，碰撞几率增大，更容易结合成大粒子聚沉。(3)做净水剂。胶体粒子表面积大，能够吸附更多的悬浮颗粒物，沉降。高铁酸钾是含有FeO42-的一种化合物，其中心原子Fe以六价存在，因此，高铁酸钾具有极强的氧化性，可以对水进行氧化、消毒、杀菌处理。因此，高铁酸钾在饮用水的处理过程中，集氧化、吸附、絮凝、沉淀、灭菌、消毒、脱色、除臭等八大特点为一体的综合性能，被称为多功能水处理剂。 【实验过程反思】 氢氧化铁胶体的制备过程中，反应总体成功，但学生在做实验时没注意观察液体变为红褐色后就停止加热，有的学生制备胶体出现了聚沉现象。因此在今后的实验中注意加热时间不宜过长。
溶菌酶的提取工艺路线 1前言： 1.1溶菌酶性质 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。 稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。 抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。0 1.2溶菌酶来源 该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 1.2溶菌酶应用
1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。 2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。 3．溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。0 2提取方法： 1.亲和层析法 亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一亲和力而设计的色谱技术。酶-底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。使用的吸附剂为几丁质及其衍生物：如几丁质粉，羧甲基几丁质，几丁质包埋纤维素等 其中磁性亲和分离法，磁性介质已被广泛用于分离细胞及核酸，蛋白质等生物大分子，∑激素等小分子生物活性物质。0 优点：通过外磁场的作用可快速地实现固液分离及磁性介质与其它固态杂质的分离，当待分离的液体样本含有固形物或较为粘稠时更具优越性。蛋壳上残留有大量的蛋清，是准备溶菌酶的潜在资源，单蛋壳清洗液中常含有泥沙，蛋壳等杂质，且黏度较大，用一般的亲和层析时易造成层析柱的堵塞 缺点：在原有亲和层析介质的基础上进一步制备了具有磁性的几丁质凝胶亲和介质，这种吸附最终导致了部分活力回收的丧失。亲和柱造价高制作困难0 2.阳离子交换法
溶菌酶溶液 简介： 华越洋溶菌酶溶液是浓度分别为10mg/ml的蛋清型溶菌酶溶液，可以用于下列分子生物学实验： 1.核酸纯化 2.包涵体蛋白纯化 3.质粒DNA纯化 4.几丁质的水解 5.细胞壁的水解 运输及保存： 低温运输，-20℃保存，有效期一年。 ============================================================= 溶菌酶存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
用途用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。 生产 以蛋清为原料，在pH6.5条件下用弱酸性阳离子交换树脂732吸附后，再用硫酸铵洗脱，经透析后冷冻干燥得产品。 制备 溶菌酶是采用生物工程技术进行克隆、提取而制取,它是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性。该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 优点 1．溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；2．溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；3．溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；4．溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐；5．溶菌酶生产成本较低；6．溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G 菌也有抑制效果；7．溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。 应用 医学应用 可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。副作用偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药. 食品应用 可作为防腐剂，它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用，其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。
期 引言 英国细菌学家弗莱明最早在人体的唾 液、眼泪等分泌物中发现了溶菌酶，因为它 能溶解细菌，故称为溶菌酶，它的作用机制 是破坏细菌细胞壁肽聚糖层的N-乙酰胞 壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4 糖苷键，使细胞壁破裂，使细菌溶解。溶菌 酶作为安全的抑菌剂已被应用于食品加 工、疾病治疗等方面，需求量大，所以利用 生物技术大量生产迫在眉睫。此外，关于 “淀粉样纤维”形成基于溶菌酶的研究较为 热门，因此本文将从这两方面进行叙述。 1溶菌酶的结构及其与病理学相关 的研究 溶菌酶是蛋白质，具有高级结构，依靠 疏水作用、氢键等次级键折叠形成一定的 构象，发挥特殊功能。目前，人类最了解的 溶菌酶是鸡蛋清溶菌酶(HEWL)，它包含一 条肽链，129个氨基酸。4对半胱氨酸残基 间形成4个二硫键，具有大量的α螺旋结 构。HEWL在体外一定条件的诱导下可以 形成“淀粉样纤维”，研究人员发现PH值较 低时，蛋白质逐渐去折叠，随着去折叠蛋白 质浓度的增大，蛋白质之间的疏水作用加 大，逐渐出现“淀粉样纤维”，具有成核效 应。另外在蛋白质变性剂的存在下，溶菌酶 的二级结构发生变化，可能出现“淀粉样纤 维”，但是不同浓度的变性剂对“淀粉样纤 维”的作用也不同，研究还有待深入。陕西 理工大学白瑜博士利用溶菌酶与朊蛋白结 构上的相似性来研究淀粉样纤维的形成机 制，为神经退行性疾病的研究带来福音[1]。 溶菌酶是一种小分子碱性蛋白，材料 易取，一直被作为一种模型体系，用于研究 蛋白质的空间构象、酶动力学及其与分子 进化、分子免疫间的关系。为优化食品加工 过程、提高食品质量提供理论指导，并为神 经系统等疾病建立了相关蛋白质模型。 目前有研究人员利用溶菌酶为模型 研究盐浓度对蛋白质聚集的影响，对人类 疾病的研究具有重要意义。 2基因工程载体表达溶菌酶的新进展 溶菌酶的用处广泛，但直接从生物体 内提纯效率低，所以其基因的重组和表达 也成为研究热点。鸡溶菌酶的外显子及内 含子序列已经确定，人的溶菌酶基因也逐 渐被解析清楚，为重组表达载体的构建和 优化提供契机。溶菌酶的外源表达包括原 核表达和真核表达，王赞等人通过PCR获 得美洲大鲵i型溶菌酶的基因，并通过构建 原核表达栽体pET28a-pal，诱导表达了美 洲大鲵i型溶菌酶pal蛋白，并通过West- ern-blot和ELISA进行了验证，出现了特异 性条带和免疫反应[2]。李云龙等通过人工合 成奶牛LYZ基因的CDS序列，由于序列较 短，合成片段容易，且保真度较高，所以避 免了RT-PCR中可能会出现的问题，构建 重组表达载体pET32T，PCR克隆筛选出了 阳性菌株，并利用酶切验证成功地构建了 表达载体，SDS-PAGE实验分析重组蛋白 证明已成功实现了溶菌酶大肠杆菌的原核 表达。重组蛋白的表达形式以包涵体的形 式存在，避免了对大肠杆菌的毒性[3]。 考虑到原核表达系统缺少了翻译后修 饰等过程，重组蛋白表达形式为包涵体，其 变性和复性的过程较麻烦，且容易影响蛋 白质的功能，所以目前多使用真核表达系 统，溶菌酶的真核表达体系局限于酵母表 达系统，付世新等人做了牛乳溶菌酶在毕 赤酵母表达方面的分析，他实验已经涉及 了对溶菌酶的基因进行密码子优化，并且 他们进行了牛乳溶菌酶对乳房致病菌的抑 菌分析，实验证明重组牛乳溶菌酶对这些 致病菌均具有抑制作用[4]。宋增健等人利用 NCY-2型毕赤酵母发酵生产溶菌酶，以价 格低廉、营养丰富且稳定性好的麦芽汁为 发酵液，通过探究发酵温度，外加氮源以及 甲醇的添加方式等优化了毕赤酵母的发酵 条件，以期为溶菌酶的工业化生产做出贡 献[5]。黄鹏等人在前人的基础上又做了改 进，他们通过组成型启动子甘油醛三磷酸 脱氢酶（GAP）来代替诱导型醇氧化酶启动 子，获得了高纯度和高活性的rh LysG2，避 免了使用甲醇，因此可以避免碳源间的相 互转化，提高了产量和效率，其中rhLysG2 的酶学性质与普通的C型溶菌酶不同，弥 补了在高渗条件下不能发挥作用的缺陷， 其开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础[5]。 根据表达载体的密码子偏好性，以密 码子优化的方法来加强转基因动物的外源 基因表达是新的研究热点。考虑到蛋白质 分泌的“信号假说”，信号肽的翻译和切除 对蛋白的表达也有影响，已有科研人员通 过对信号肽和人溶菌酶基因的整体优化， 在溶菌酶基因的分泌量方面也有所提升。 3结果与展望 溶菌酶是一种结构清楚、化学性质稳 定、来源广泛的酶，已成为一种模式蛋白用 于研究生理条件的变化对于蛋白质结构功 能的影响，并逐渐应用于人类疾病的研究 上。基于基因工程的溶菌酶的生产目前已 有很多报道，通过将强启动子或者增强子 等调控原件与溶菌酶重组，构建新的表达 载体，或利用乳腺等生物反应器的方法来 扩大溶菌酶的生产有待进一步深入研究。 参考文献： [1]本刊编辑部.蛋清溶菌酶作为朊蛋 白错误折叠和淀粉样纤维形成机制的蛋 白模型研究[J].陕 [2]王赟等.美洲大蠊i型溶菌酶的原 核表达及多克隆抗体制备[J].生物技术通 报,2016,32(01):138~143. [3]李云龙等.奶牛溶菌酶基因的构建、 表达及活性研究[J].家畜生态学报,2018,39. [4]付世新等.牛乳溶菌酶在毕赤酵母 中的分泌表达及活性分析[J].中国预防兽 医学报,2010,32(06):428~431+454. [5]宋增健等.基因重组毕赤酵母产蛋 清溶菌酶发酵工艺及表达条件的优化[J].中 国酿造,2018,37(10):20~24. [6]黄鹏等.利用GAP启动子在毕赤 酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2[J].中 国生物工程杂志,2018,38(10):55~63. 浅谈溶菌酶的研究进展 河南师范大学生命科学学院王佳雯 摘要：溶菌酶作为一种天然的抗菌剂，广泛存在于人及哺乳动物等的多种组织器官中，良好的杀菌作用使其成为医疗、食品保鲜界的宠儿，应用广泛，为了高效表达溶菌酶，有关利用基因工程技术构建其基因表达载体的研究较多；鸡卵清溶菌酶的结构研究较为清晰，所以目前将其作为一种模式蛋白研究蛋白质的变性、聚集等特性上的报道较多，具有病理学上的意义。 关键词：溶菌酶；淀粉样纤维；原核表达；真核表达 HEBEINONGJI 62 2019年第8