溶菌酶的研究及应用简介
摘要溶菌酶（lysozyme）是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶（muramidase）。人们对溶菌酶的研究始于20 世纪初，英国细菌学家Fleming在发现青霉素的前6年（1922年）发现人的唾液、眼泪中存在能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，其中鸡蛋溶菌酶的研究和应用已相当深入和广泛［1］。通过对它的结构、性质、来源的研究；溶菌酶已广泛的应用于医药、生物工程和食品工业等多个方面。
关键词溶菌酶；结构；应用；研究进展
溶菌酶（Lysozymc EC3.2.1.17）又名胞壁质酶（muramidase）、乙酞胞壁酸聚糖水解酶（N-acctylmuramide glyca-nohydrolase）,广泛地分布于自然界[2]。在病毒（如噬菌体T4）、细菌（如枯草杆菌）、植物（如番木瓜）、动物（如鼠、狗）及人体都含有。人体多数组织器官含有一定浓度的溶菌酶。但以脾、肾含量较高。在鼻及支气管分泌液、泪液、脑脊液、唾液、乳汁及血液中均含有一定量的溶菌酶。此酶自被发现以来,经科学家们不断地研究,使得它在酶学及临床医学中均占有一定的重要位置，也将其应用于医疗、食品、畜牧及生物工程中。
1 溶菌酶的发现
1907年Nicollc[2]猜测芽胞杆菌（Bacillus）及枯草杆菌中含有溶解细菌的酶。1909年https://www.doczj.com/doc/3416549632.html,schtchenko[3]第一个报道了鸡蛋清含有溶解细菌的酶。1922年Alexander Fleming[2]发现鼻粘液里有一种能溶解微球菌（micrococcus
lysodeikticus）及其他细菌的酶，他把这种酶命名为溶菌酶（lysozyme）。经过仔细的观察和研究，他发现此酶广泛地存在于生物组织及机体的某些分泌物中。之后Robert及Wolff 也从鸡蛋清里提取出溶菌酶。1937~1946年间Abraham[3]，Robinson, Alderson及Fevold等人通过实验从而分别获得了溶菌酶的结晶。
2 溶菌酶的理化性质、空间结构
2.1溶菌酶的理化性质
溶菌酶由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强。当pH值为1.2～11.3围剧烈变化时，但其结构几乎维持不变。当pH值为4～7，96℃热处理15 min仍能保持87%的酶活性；当pH值为3 时能耐100℃加热处理45min；但碱很容易破坏酶活性，当处于碱性pH 值围时，溶菌酶的热稳定性就很差[4]。在干燥条件下，溶菌酶可以长期在室温存放,其纯品为白色或微黄色。黄色的结晶体或无定形粉末，无臭，味甜。易溶于水，易遭碱破坏，不溶于丙酮和乙醚。其分子结构如下:
2.2 空间结构
溶菌酶是第一个结构弄清楚的酶，在很长一段时间中,其中有许多蛋白晶体研究及蛋白质结构与功能关系研究。这些进展都是利用溶菌酶获得的溶菌酶一直
被当作一种研究蛋白质空间构象、酶动力学及分子进化的理想模型[5]。溶菌酶的分子最较小，不同来源的溶菌酶组成一级结构的氨基酸数量是相同的，但多肽链上某些个别氨基酸有差异，因此来源于不同种属如噬菌体、番木瓜、鸟类、鸡、鼠、狗、人类的溶菌酶或同一种属不同脏器如兔的肝、脾、鼠的脾、肾的溶菌酶分子量各不相同[1][3],鸡蛋清溶菌酶的分子量为14000[8]。目前，鸡蛋清溶菌酶HEWL 的酶学性质、分子结构、催化机理乃至酶蛋白基因结构已研究清楚，并成为研究蛋白质结构与功能的一个重要模式蛋白。1963年J.Jollcs和Canfields 测定了鸡蛋清溶菌酶HEWL的一级结构。Phillips 等人1965年用x 射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，HEWL由129个氨基酸残基组成的单一多肤链，含有4对二硫，三维结构为一较紧密的椭球，大小为 4.5 nm×3.0 nm×3.0 nm，其构象复杂，α螺旋仅占25 %，在分子的一些区域有伸展着的β片层结构，研究表明溶菌酶的部几乎都为非极性的, 疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用, 其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙, 这是溶菌酶的活性部位。溶菌酶的底物为细胞壁的长链肽聚糖，当酶发挥催化效力时，肽聚糖的六个氨基糖单位正好嵌入酶的裂隙，裂隙两侧为Glu35、Asp52 及Trp62 残基是酶活性必需基团；同时Asp101、A rg114、Trp108等残基对“底物—酶复合物”的形成也起着重要作用，该酶活性受组氨酸和N-乙酰葡糖胺的抑制。
后期的研究表明，不同来源的溶菌酶虽在空间结构相似但在活性中心与功能上是有所不同。植物溶菌酶活性中心的研究比较少，木瓜溶菌酶中Trp残基不参与底物的结合，活性中心除包括—COOH (Asp / Glu)外，还必需一个Cys。而且，该酶受组胺抑制基本上不受N-乙酰葡糖胺抑制，这些与HEWL 有所不同。
赖晓芳[6]等采用化学修饰等方法，对萝卜溶菌酶活性中心进行了初步研究，
他们采用脱氨再生几丁质凝胶亲和层析从萝卜叶中获得了PAGE均一的溶菌酶，并通过微量蒸发扩散法获得其结晶。用pH 动力学研究方法和化学修饰法对酶的活性中心进行了初步研究。实验结果表明: —COOH ( Glu/A sp)基团、Trp 及His残基可能为酶活性所必需。对Tyr、Cys、Ser/ Thr残基修饰后，酶活性基本上不受影响。同时，酶活性受到组胺和N-乙酰葡糖胺抑制。并且对萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶的活性中心的相互差异进行了讨论。现有情况表明萝卜溶菌酶活性中心与HEWL 可能不同，HEWL 的活性中心只包括—COOH (Asp/Glu)和Trp残基；亦与木瓜溶菌酶的不同，其活性中心除含—COOH (Glu/Asp)基团外，还含有—SH基团。用IAA 和DTNB 对萝卜溶菌酶进行化学修饰，酶活性基本不变，用EIIman试剂法也测不出酶分子含有游离—SH基团，只测得酶分子中含有2.11mol—SH蛋白质的二硫键存在，所以萝卜溶菌酶活性中心可能不含游离巯基。另外，HEWL，受组胺和N-乙酰葡糖胺显著抑制；而萝卜溶菌酶也受组胺显著抑制，但基本上不受N-乙酰葡糖胺抑制；木瓜溶菌酶不仅受组胺显著抑制，而且受N-乙酰葡糖胺抑制也较强。这些差异可能反应了萝卜溶菌酶与鸡蛋清溶菌酶和木瓜溶菌酶在功能上的分化。
3 溶菌酶的种类及作用机理
溶菌酶根据其作用的微生物不同可以分为两大类：细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。胞壁溶菌酶又细分为两种：一种是作用于β-1, 4糖苷键的细胞壁溶解酶。另一种是作用于肽链“尾”端和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶[7]。溶菌酶来源广泛，可以从动物、植物及微生物生物体中提取，其作用机制也有所不同。
3.1 动物源溶菌酶
动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖, 作用位点是N-乙酰胞壁酸(NAM) 的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺(NAG) 的4位碳原子间的β- 1, 4糖苷键。细胞壁肽聚糖主要由NAM、NAG 和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成, NAM与NAG 通过β-1, 4糖苷键相连，肽尾则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构, 作为细胞壁的骨架。
人溶菌酶分子量为14600 单位, 对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异, 但三级结构有相似性, 其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶, 目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶, 其化学性质与人溶菌酶相似, 但结构尚不清楚, 其溶菌活性远低于人溶菌酶。
3.2 植物源溶菌酶
目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果，大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000～29000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10 倍。
3.3 微生物源溶菌酶
微生物产生的溶菌酶可分为7 类：（1）蛋白酶与肽酶；（2）酰胺酶(主要作用于细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰胞壁酸(NAM)与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L- 丙氨酸键) ；（3）N-乙酰已糖胺酶(类似于鸡蛋清溶菌酶，主要破坏细菌细胞壁
肽聚糖中的β-1, 4 糖苷键) ；（4）β-1, 3、β-1, 6-葡聚糖酶、甘露糖酶(主要用于分解酵母细胞的细胞壁) ；（5）壳聚糖酶(分解霉菌细胞壁的一种溶菌酶)；（6）磷酸甘露糖酶；（7）脱乙酰壳多糖酶[9]。
3.4 噬菌体产生的溶菌酶
该酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞上不存在该酶。
4 溶菌酶的应用
4.1 在生物工程研究中的应用
随着生物科学的发展，溶菌酶已成为基因工程及酶工程中必不可少的工具酶，用以制造和提取菌体的活性物质如核酸、酶及活性多肽等，利用其专一性水解细胞壁的特点，有助于人们对细胞壁细微结构的认识，为我们深入研究细胞壁的构造打下了坚实的基础，同时作为是一种重要的破壁酶，在原生质体的制备方面提供了新的方法，因此溶菌酶被广泛应用于生物技术、生物工程中。
4.2在食品工业中的应用
溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质,又具有溶菌作用,因此可用作食品防腐剂。目前已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐，溶菌酶属于冷杀菌，在杀菌防腐过程中不需加热，因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用，尤其对热敏感的物质更具有重要意义[8] 。还可以添加到乳粉中,使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味品。
4.2.1溶菌酶在乳制品中的应用
溶菌酶作为一种非特异性免疫因子，对肠道中腐败性微生物有特殊杀灭作用。溶菌酶是双歧杆菌增长因子，有防止肠炎和变态反应的作用，对婴幼儿肠道菌群有平衡作用；溶菌酶还能够强化血清灭菌蛋白、γ-球蛋白等体防御因子，加强机体对感染的抵抗力；在干酪生产中添加溶菌酶可代替硝酸盐等抑制丁酸菌的污染，防止干酪产气!并对干酪的感官质量有明显改善作用。溶菌酶还可以用于巴氏杀菌奶防腐剂，现在商品中应用方法，一般是在装包前加入使浓度达到300~600ppm；另外，牛乳中溶菌酶含量远远低于人乳，现在实验表明，将溶菌酶添加到牛乳及其制品中，可使牛乳人乳化，满足婴幼儿对乳制品要求。
4.2.2溶菌酶在低度酒类和饮料中的应用
试验表明，在低度酒中每公斤添加20%的溶菌酶替代水酸作防腐剂，对酒的风味无不良影响，且受酒类澄清剂的影响很小!并可以去除水酸的毒性，是低度酒类较好的防腐剂，日本成功把溶菌酶用于清酒的防腐剂；此外，溶菌酶还可用于pH6.0~7.5的饮料和果汁的防腐[12]。
4.2.3溶菌酶在水产品和肉类制品中的应用
针对溶菌酶无毒、无害的特性，同时对G+细胞壁的分解作用，应用于水产品和肉类制品中，在保证食品原有营养成分不受损失的前提下，可以对水产品和肉类制品起到保鲜和防腐作用；利用溶菌酶与氯化钠和亚硝酸盐联合应用，可以延长肉制品的保质期，其防腐效果比单独使用时效果更好；试验用0.05%的溶菌酶与植酸聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，作为防腐剂和保鲜剂可以对海产品和水产品延长储存期[13]。
4.2.4 溶菌酶在其他食品中的应用
奶油蛋糕是容易腐败变质的食品之一，在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物
引起的腐败变质现象发生；将溶菌酶应用于食物的保鲜中，其效果也极为明显；同时根据溶菌酶无毒、无害且有保健作用，有抗感染和增强抗生素的效力，以及促进血液凝固及止血和组织再生作用，现在有人尝试在食品中作为添加剂增强食物的保健功效[13]。
4.3 在医疗中的应用
溶菌酶在抗菌消炎、增强免疫力方面的应用溶菌酶对G+细菌、枯草杆菌等有很好的杀灭作用,对大肠杆菌、普通变球菌等G-细菌也具有一定程度溶解。此外，溶菌酶与抗菌素合用效果更佳，因而，溶菌酶广泛应用于医药行业，如利用溶菌酶治疗各种五官科炎症，尤其对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。
溶菌酶在多种疾病诊断方面的应用戴清源等[10]报道，正常情况下，人体尿液中一般只存在少量溶菌酶，因此测量尿中溶菌酶含量，有助于检测肾小管功能障碍性疾病。同时，烧伤病人分泌的溶菌酶比常人多出几倍，也可在尿液中检出，有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。此外，血清中溶菌酶含量高低对白血病的诊断起辅助作用。
5 有关溶菌酶的最新研究进展
5.1 溶菌酶可以固定于一些包装纸上，如湿墙纸和玻璃纸上，应用于医院手术室及食品包装。如用提取的蛋清溶菌酶配制( 2%～3% )的酶液，喷洒于包装纸上或将包装纸浸入酶液(2～3h)，取出后在温度50～60℃条件下烘干(酶活力基本不损失)，用溶菌酶处理过的包装纸包装煮熟的大豆和新蒸的馒头，结果在贮存近一周的时间不变味;而用普通纸包装的这些食品贮存一天就会变味(常温
下)发黏[11] 。
5.2 采用固定化技术将溶菌酶固定在HEPA (空气过滤器)上，作为空调的空气净化系统，使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时，先滤集捕捉尘粒和细菌，然后将捕捉到的细菌杀灭[14]。
5.3 用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖，使其成为能被人体吸收的、低分子量的、有独特的生理活性和功能性质的低聚壳聚糖[15]。
6 讨论
溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠作用于营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体残留, 是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。在倡导绿色食品的今天，溶菌酶的应用前景是相当广阔的，特别在作为潜在的抗生素替代品添加剂。目前，国对溶菌酶的研究虽然也取得了一些成果，但由于起步较晚与发达之间仍有很大差距。溶菌酶的高端产品主要被美国、日本、加拿大等国公司垄断，我国的溶菌酶只能作为粗品原料出口，而且高端产品还要依赖进口，这些事实严重阻碍了我国溶菌酶产业的发展。为了打破上述局面，开发应用价值，具有自主知识产权的溶菌酶相关产品并实现产业国际接轨就显得尤为重要。且每一类型的溶菌酶都有其最适的反应条件，而且作用特异性强，因此，首先应充分研究掌握溶菌酶的酶学特性；其次要搞清楚水分、pH 值、离子强度等因素对酶活的影响，才能加以调控以使酶活力得到最大程度的发挥。另外，在使用溶菌酶作为防腐剂时，要弄清导致食品腐败的微生物种类以便对症下药，发挥最大效果。
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