分子生物学实验室
实验一 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验二 细菌质粒DNA 的提取 实验三 琼脂糖凝胶电泳
实验四 细菌基因组DNA 的提取与琼脂糖凝胶电泳 实验五 质粒DNA 限制性内切酶实验
实验六 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因 实验七 胶回收法纯化DNA 与琼脂糖凝胶电泳
南京工业大学制药与生命科学学院
生物工程与技术基础实验与工程实训中心
《分子生物学实验》教学大纲
英文名称： Molecular biology
学分：1 学时：32
教学对象：生物工程专业、制药工程专业、药剂学专业、食品学专业、生物技术专业
教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全面系统的掌握分子生物学的基本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解，强化动手能力。。
基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。
实验内容：
实验一.细菌质粒DNA的提取及酶切实验 （8学时）
基本要求:
通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。进一步了解限制性
内切酶的特性及酶切反应过程，掌握DNA的酶切技术。
重点:
掌握质粒DNA的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA的原理。进一步了解限制性内切酶的特性，掌握DNA的酶切技术。
难点:
掌握质粒DNA的小量制备方法及DNA的酶切技术。
实验二. 细菌基因组DNA的提取 （4学时）
基本要求:
了解细菌基因组DNA的提取的目的，原理，掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法
重点:
掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法
难点:
掌握细菌基因组DNA的提取的实验步骤及操作方法
实验三. 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验（4学时）
基本要求:
了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过程，掌握重组DNA质粒转化大肠杆菌的操作技术。
重点:
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术
难点:
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四. 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳 （8学时） 基本要求:
熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解 PCR反应条件的优化和注意事项和应用范围 掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。
重点:
掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。
难点:
聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。
实验五. 聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质 （4学时）
基本要求:
了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本原理，学会用该法测定蛋白质分子量的操作技术。
重点:
掌握聚丙烯酰氨凝胶的配制方法，了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本步骤及实验结果的判定
难点:
聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验步骤及实验结果的判定
实验一 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验目的
掌握重组DNA 质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。
实验原理
带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量
复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA ,,该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl 2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。
实验步骤
1 感受态细胞的制备： 1) 挑菌37℃培养。
2) 将过夜培养的细菌转接培养2-3小时。
3) 将菌液置冰上10分钟，4℃离心8000rpm 30秒。 4) 用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。 5) 氯化钙溶液悬浮菌体。 2 转化：
1) 取出感受态细胞,试剂A，无菌双蒸水和待转化的质粒DNA，均置冰盒内。 2) 取离心管管一支，将质粒、试剂A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴20分钟。 3) 在管内加入400ul LB 液体培养基，振荡培养10-40分钟。 4) 涂布培养。
大肠杆菌形态图
实验二 质粒DNA 的提取
实验目的
本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒pET-22b 的抽提，掌握质粒DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒DNA 的基本原理。
实验原理
载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内进行克隆与表达。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、逆转录病毒DNA 和昆虫病毒DNA 等，而质粒是最常用的载体。
实验步骤
1 收集菌泥。
2 悬浮细菌。
3 加入200μl 裂解液 (Solution 2)，充分裂解菌体。
4 加入400μl 絮凝剂(Solution 3)。
5 15000rpm 离心10分钟，无需低温离心。
6 将步骤5中的上清转移到吸附柱(3S)中， 12000rpm 离心1分钟。
7 将吸附柱放入同一支收集管中，吸取洗涤液到吸附柱，离心1分钟。 8 重复步骤7一次。
9 将吸附柱放入同一支收集管中，高速离心2分钟。
10在吸附柱(3S)膜中央加50μl 无菌双蒸水，室温高速离心1分钟。
质粒图谱1 质粒图谱
2
质粒电泳图
实验三 琼脂糖凝胶电泳
实验目的
用来检测DNA的情况，如DNA片段分子量的大小、纯度等。
实验原理
利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子量。一般800bp以上的片段用08%的琼脂糖凝胶，800bp以下的片段，用10%-20%的琼脂糖凝胶。用溴化乙锭染色，在紫外灯下可以直接确定并分析DNA片段在凝胶板中的迁移率。
实验步骤：
1 将配好的电泳缓冲液，倒入电泳槽。
2 将琼脂糖凝胶放入微波炉熔化。
3 熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中。
4 静置1小时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂直拔去梳子。
5 将琼脂糖凝胶放入电泳槽中。
6 点样,一般上样量为10×Loading Buffer 05-1μl、DNA样品（质粒）3μl混匀，点入凝胶孔内。
7 质粒电泳参数：电泳仪的电压100V，电流500mA，功率250W。电泳时间40分钟。
8 将琼脂糖凝胶取出，放入紫外与可见分析装置。
9 凝胶成像系统显像，拍照。
电泳图 凝胶成像系统
实验四 细菌基因组DNA 的提取
实验目的
本实验通过利用小量细菌基因组DNA 抽提试剂盒对大肠杆菌基因组DNA 的抽提，掌握细菌基因组DNA 的小量制备方法。
实验原理
本实验使用 溶菌酶破壁及蛋白酶K 消化以确保基因组DNA 得率。不使用苯酚/氯仿等有机试剂，无须传统的乙醇沉淀、洗涤、干燥、溶解过程，简化了操作。
实验步骤
1 细菌的消化
2 加入 400 ul DL 液和 25 ul 蛋白酶 K，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。
温浴30 分钟。离心 1 分钟后，取上清至另外一个离心管中。 3 加入 200 ul 异丙醇,离心弃去收集管中的液体。 4 加入 500 ul 洗涤液，离心 30 秒。
5 将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。离心 15 秒。
6 将吸附柱放入同一个收集管中。离心 1 分钟。
7 在吸附膜中央加入 100 ul T1 液，离心 1 分钟。将 DNA -20 ℃ 保存。 8 取纯化后基因组片段洗脱液2μl 加上样缓冲液 1μl 混匀，标准分子量DNA2-3μl，电泳检测结果。
大肠杆菌的细胞的结构
细菌基因组DNA
的结构
实验五 质粒DNA限制性内切酶实验
实验目的
通过DNA限制性内切酶实验掌握内切酶技术。
实验原理
不同酶切反应都需要不同的酶切缓冲液。多数生物技术公司的产品目录中均有关于何种限制性内切酶适合何种缓冲液的资料可供查阅。绝大多数酶的反应温度是在37℃。酶切反应时间有30分钟、60分钟，以至2小时以上甚至过夜。 本次实验要进行的是对重组质粒pET-22b进行EcoRI酶切，重组质粒上有两个EcoRI识别位点。
实验步骤
1 在离心管管中以编号次序加入以下相应试剂：
（1）ddH20 45μl
（2）10×Buffer 2μl
（3）BSA小牛血清 25μl
（4）质粒DNA 10μl
（5）EcoRⅠ 1μl
总体积 20μl
2 37℃水浴15小时后，终止酶切反应。
3 取单酶切反应液10μl和上样缓冲液2μl，混匀，标准分子量DNA 5μl，待作电泳上样液。
4 08%的琼脂糖凝胶电泳。
5 紫外灯下观察酶切琼脂糖凝胶电泳图。
琼脂糖凝胶电泳图
内切酶酶切DNA示意图内切酶酶切DNA立体示意图
实验六 重组DNA 的PCR 扩增
实验目的
学习PCR 反应的基本原理与实验技术。
实验原理
多聚酶链式反应的原理类似于DNA 的天然复制过程。在待扩增的DNA 片段两测和与其两测互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸后，DNA 可扩增一倍。
实验步骤
1 在02ml 离心管管内配制50μL 反应体系： （1）ddH2O 38μL （2）10×buffer 5μL （3）dNTP 1μL （4）Taq 酶 1μL （5）引物P1 1μL （6）引物
2 1μL （7）模板DNA 3μL 2 按下列程序进行扩增：
（1） 94℃预变性5分钟；（2） 94℃变性50秒； （3） 55℃退火50秒； （4） 72℃延伸10 秒； （5）重复步骤②-④30次； （6） 72℃彻底延伸10分钟。 3 琼脂糖凝胶电泳分析PCR
结果。
PCR 反应的原理
琼脂糖凝胶电泳图
实验七 胶回收法纯化DNA
实验目的
本实验利用胶回收纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中将目的DNA片段进行抽提纯化，从中掌握切胶技术以及回收目的DNA片段并纯化的方法。
实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，可用于分离、鉴定和纯化DNA 片段。胶回收是指目的DNA片段经由琼脂糖凝胶电泳与其它片段分离，再从琼脂糖凝胶中将目的DNA片段抽提纯化出来的过程。
实验步骤
操作流程见右图
1目的DNA电泳。
2切出含有目的DNA的凝胶。
3称量胶块重量，计算胶块体积。
4向胶块中加入胶块融化液。
5 75℃加热融化胶块。
6将溶液转移至Spin Column中离
心1分钟，弃滤液。
7用Rinse A，Rinse B冲洗Spin
Column。
8在Spin Column膜的中央处加入
25 μl的灭菌蒸馏水或Elution
Buffer12,000 rpm离心1分钟洗脱
DNA。
9 取胶回收目的基因片段洗脱液1
μl加上10×Loading Buffer 1μ
l混匀。
净
备净
备0粉
司燥
备斯
斯
斯
斯
斯培B
疗培B 疗动
器0疗验
验
验
验
像
技锅
8子锅
8子锅
8子清声浴器浴器浴器浴
器泳
器泳
器泳
泳
荡
设学
器
荡
设荡
设学
学
学
器
器
器
器
器仪器编号仪器名称型号
单价厂家
购置日期领用人存放地点
20056176标准型双人SW-CJ-IC 3490苏州净化设2005.10刘洋笃行40720056177标准型双人SW-CJ-IC 3490苏州净化设2005.10刘洋笃行407
20056127冰箱海尔BCD-212320青岛海尔2005.12刘洋
笃行40720056023超声波细胞JY92-II2D 11488宁波新芝公2005.12刘洋笃行40720010674电热鼓风干101C-33490苏州净化设2005.12
刘洋笃行40720051742电子天平BS224S 6900北京赛多利2005.13刘洋笃行40720051743电子天平BS224S 6900北京赛多利2005.14刘洋笃行40720056016电子天平BS224S 6900北京赛多利2005.15刘洋笃行40720056144电子天平BS224S 6900北京赛多利2005.12刘洋笃行40720056146电子天平BS224S 6900北京赛多利2005.12刘洋笃行407
20051786隔水式恒温PYX-DHS5002950上海跃进医2005.03
曹飞
笃行40720051787隔水式恒温PYX-DHS5002950上海跃进医2005.03曹飞
笃行40784070001精密增力电JJ-1510常州国华电2005.10刘洋笃行40720051747冷藏柜海尔SC-3291900青岛海尔2005.12刘洋笃行40720051750冷藏柜海尔SC-3291900青岛海尔2005.12刘洋笃行40720054981酶标仪BTO-Rad 6843000南京惠众医2005.12
周华笃行40720056017三温水浴锅DK-8D 1460上海精宏实2005.12刘洋笃行40720056018三温水浴锅DK-8D 1460上海精宏实2005.12刘洋笃行40720056019三温水浴锅DK-8D 1460上海精宏实2005.12刘洋笃行40720056093三温水浴锅DK-8D
1565上海精宏实2005.12刘洋笃行40720054980生物电泳图FR-98038000上海复日科2005.12周华笃行40720056031手提式灭菌YXQ.SG41.2665上海医用核2004.12谢宁昌笃行40720056032手提式灭菌YXQ.SG41.2665上海医用核2004.13谢宁昌笃行40720056033手提式灭菌YXQ.SG41.2665上海医用核2004.14谢宁昌笃行40784070002数控超声波KH2200DB 1758昆山禾创超2005.12刘洋笃行40784070003数显恒温水HH-2510常州国华电2005.10刘洋笃行40784070004数显恒温水HH-2510常州国华电2005.10刘洋笃行40784070005数显恒温水HH-2510常州国华电2005.10刘洋笃行40784070006数显恒温水HH-2510常州国华电2005.10刘洋笃行40720055991双稳定时电DDY-8C 2079北京六一仪2005.12刘洋笃行40720055993双稳定时电DDY-8C 2079北京六一仪2005.12刘洋笃行40720056091双稳定时电DYY-11B 2272北京六一2005.12刘洋笃行40720055992双稳定时电DYY-8C 2272北京六一2005.12刘洋笃行40720056050水浴恒温振DSHZ-300A 5850太仓市实验2005.12
刘洋笃行40720056089酸度计PHS-3C 1739上海精密科2005.12刘洋笃行40720056134酸度计PHS-3C
1593上海雷磁仪2005.12刘洋笃行40720056047台式低温振THZ-C-110350太仓市实验2005.12刘洋笃行40720056048台式低温振THZ-C-110350太仓市实验2005.12
刘洋笃行40720056086台式离心机TGL-16B 1825上海安亭科2005.12刘洋笃行40720056087台式离心机TGL-16B 1825上海安亭科2005.12刘洋笃行40720056088台式离心机TGL-16B 1825上海安亭科2005.12刘洋笃行40720056158台式离心机TGL-16G 2020上海安亭仪2005.12刘洋笃行40720056159台式离心机TGL-16G 2020上海安亭仪2005.12刘洋笃行40720056160台式离心机TGL-16G 2020上海安亭仪2005.12刘洋笃行40720056161台式离心机TGL-16G 2020上海安亭仪2005.12刘洋笃行40720056162
台式离心机TGL-16G
2020
上海安亭仪2005.12刘洋笃行407
器器
2005.052005.05度
析度
析业
业
器
器
器学学学学学学学学学学学学学学学学勺学学学学篓学学学学桶学学学学学学学学学20056163台式离心机TGL-16G 2020上海安亭仪2005.12
刘洋
笃行40720056164台式离心机TGL-16G 2020上海安亭仪2005.12刘洋笃行40720050920梯度PCR仪*30982.5Eprendof公司
周华笃行40720050921梯度PCR仪*30982.5Eprendof公司
周华笃行40720056094制冰机SIM-F124
31000SANYO 2005.12刘洋笃行40720058537紫外分光光UV-91003780北京瑞利分2001.04王桂兰笃行40720058538紫外分光光UV-91003780北京瑞利分2001.04
王桂兰笃行40720051810紫外透射仪WFH-201B 3980上海精科实2005.08刘洋笃行40720031731紫外透射仪ZF-1765上海精科实2005.12谢宁昌笃行40720056024紫外透射仪ZF-13100上海康华仪2005.12刘洋笃行40720056025紫外透射仪ZF-13100上海康华仪2005.12刘洋笃行40720051794紫外透射仪ZF-5013100上海康华仪2005.12刘洋笃行407
分子生物学耗材
低型烧杯耗材500ml 5.25分子生物26耗材1000ml 9.88分子生物78.4定性滤纸
耗材12.5cm 8.662分子生物17.2称量纸
耗材75*757.51分子生物7.5药勺
耗材57分子生物35敷料镊
耗材14 5.12分子生物10.2耗材16 5.72分子生物11.4耗材207.22分子生物14.4方盘
耗材20*3010.816分子生物172.8塑料烧杯
耗材1000ml
810分子生物80无水乙醇
耗材820分子生物160洗衣粉
耗材 3.510分子生物35撮箕
耗材175分子生物85挂衣钩
耗材 2.820分子生物56记事本
耗材240分子生物80棉线
耗材1110分子生物110不锈钢药耗材
2.84分子生物11.2牙签
耗材120分子生物20胶带
耗材 4.510分子生物45拖把
耗材65分子生物30塑料垃圾耗材
5.510分子生物55电水壶
耗材851分子生物85肥皂盒
耗材 2.615分子生物39扫帚
耗材65分子生物30塑料垃圾耗材
16.720分子生物334低型烧杯
耗材50ml 3.1610分子生物31.6耗材250ml 3.715分子生物55.5耗材500ml 5.1515分子生物77.25耗材1000ml 9.7112分子生物116.5三角烧瓶
耗材100ml 3.420分子生物68耗材250ml 4.420分子生物88耗材500ml 6.456分子生物38.7耗材
1000ml
11
6
分子生物66
学学学学学学学学学学学学学筒学学学管学学学学学l 学学学学学学学学学管
学学学学学学塞学学学刷学学学学学学学学培养皿耗材90cm 2.6120分子生物312酒精灯耗材250 3.510分子生物35铸铁电炉耗材2000w 552分子生物110天平耗材10001172分子生物234纱布耗材500g 2810分子生物280垃圾袋耗材1120分子生物220白大口瓶
耗材125ml 35分子生物15耗材250ml 3.510分子生物35耗材500ml 4.610分子生物46棕大口瓶耗材125ml 4.51分子生物18抽纸耗材 6.52分子生物13塑料洗瓶耗材500ml 4.54分子生物18胶带
耗材2cm 1.510分子生物15塑料卷纸耗材 5.520分子生物110取液器耗材QY-2002802分子生物560肥皂盒耗材48分子生物32有机比色耗材50/12*1435分子生物215接种棒耗材1010分子生物100抹布耗材3*1
5.510分子生物55塑料盆耗材 5.810分子生物580药勺耗材 2.82分子生物 5.6取液器耗材QY-1000u 3302分子生物660耗材QY-10
2802分子生物560帆布手套耗材310分子生物30洗洁净耗材 3.510分子生物35萘酸手套耗材401310分子生物130纱手套耗材 2.510分子生物25吸咀盒耗材200ul 1030分子生物300离心管盒耗材 1.5ml 1020分子生物200吸咀盒耗材10ul 1030分子生物300塑料离心耗材0.5ml 0.0810000分子生物800耗材0.2ml 0.065000分子生物300耗材 1.5ml 0.110000分子生物1000吸咀
耗材1000ul 0.15000分子生物500耗材200ul 0.0410000分子生物400耗材10ul 0.0410000分子生物400三角烧瓶耗材250ml 8.810分子生物88试管刷耗材小0.820分子生物16耗材中
120分子生物20三角烧瓶耗材 2.510分子生物25平皿刷耗材 2.520分子生物50试管刷耗材大 1.520分子生物30吸耳球耗材中 2.84分子生物11.2洗手液耗材152分子生物30胶带耗材1CM 1.510分子生物15三角漏斗耗材75mm
2.910分子生物29双面架
耗材
1040分子生物400
学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学学0000000000000塑料漏斗耗材70ml 32分子生物6耗材90ml 3.52分子生物7塑料量杯耗材2000ml 9.52分子生物19电吹风耗材252分子生物50铝锅耗材26cm 301分子生物30称量纸耗材75*7575分子生物35订书钉耗材 2.510分子生物25药棉耗材500g
1610分子生物160保鲜袋耗材 4.52分子生物9插线板耗材204分子生物80牛皮纸耗材110分子生物10工作服耗材203分子生物60卷纸耗材116分子生物6684消毒液耗材310分子生物30保鲜膜耗材 4.52分子生物9订书机耗材13.51分子生物13.5签字笔耗材301分子生物30止水夹耗材弹 1.750分子生物85耗材螺
2.550分子生物125取液器耗材QY-50002802分子生物560取液器架耗材9520分子生物1900吸咀盒耗材10ul
1030分子生物300涂布棒耗材34分子生物12钙羧酸耗材271分子生物27纸刀耗材 3.82分子生物7.6剪刀耗材85分子生物40记号笔耗材 2.520分子生物50中性笔耗材224分子生物48抽纸耗材63分子生物18长春手套耗材L
620分子生物120白大褂耗材
207分子生物140
家具
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分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学实验文档
分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分子生物学
利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法 1 研究背景 烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。 2 材料与方法 2.1 试验材料 试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。 2.2 测定烟碱含量 烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。 2.3 RNA提取 提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。 2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化 取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。 3 预计结果 3.1 烟碱含量的测定 与对照相比打顶后烟碱含量显著上升 3.2 RNA电泳检测 总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。 3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR