丙戊酸对大鼠急性脊髓损伤后BDNF及NT [摘要] 目的探讨丙戊酸（VPA）对脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素3（NT-3）表达的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组（C组）、损伤组（SCI组）和丙戊酸保护组（VPA组）。采用改良Allen法制作脊髓损伤动物模型。VPA组术后即刻及其后每12 h皮下注射VPA 300 mg/kg；C组和SCI组在相应时间点注射等体积的生理盐水。于伤后24、48、72 h和1周取材。利用BBB评分标准进行不同时段的行为学评分。通过免疫组化法观察各组大鼠脊髓损伤后BDNF及NT-3表达的变化。结果BBB评分显示，C 组运动功能未受影响，VPA组的BBB评分均高于SCI组，在伤后48、72 h和1周两者比较，差异有统计学意义（P [关键词] 脊髓损伤；丙戊酸；脑源性神经营养因子；神经营养素3 [中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [":.gerenzongjie.co" ="" class="">文章编号] 1673-7210（2012）07（c）-0023-03 Effects of valproic acid on the expression of BDNF and NT-3 in rats after acute spinal cord injury LI Xinzhi Department of Anatomy and Histo-Embryology, Chengdu Medical College, Sichuang Province, Chengdu 610083, China [Abstract] Objective To investigate the effects of valproic acid (VPA) on the expression of BDNF and NT-3 in rats after acute spinal cord injury. Methods 60 adult rats were randomly divided into three groups: control group (C group), spinal cord injury group (SCI group) and VPA treatment group (VPA group). Spinal cord injury model was made by modified Allen technique. VPA (300 mg/kg) was administrated in rats through subcutaneous injection immediately after injury and repeated per 12h after injury, while C group and SCI group were received
大鼠骨髓间充质干细胞培养 干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。 源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。 本实验根据骨髓中间充质干细胞的贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性用贴壁法将其分离开来，此方法得率高、操作简单、无需特殊试剂，已广泛应用于科研工作中。 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。 工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、全骨髓提取 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。 用无菌PBS浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。
成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较 作者：王春婷，游思维，刘惠玲，陈秉耀，焦西英，孟晓梅，吴宗亮，鞠躬 【关键词】脊髓切断术 关键词: 脊髓切断术;神经纤维;空洞;轴突再生;大鼠 摘要:目的比较成年大鼠4种脊髓全横断方法对后肢运动功能及脊髓组织学的影响. 方法 32只成年SD大鼠分为A，B，C和D4组，每组8只，分别以4种不同方法全横切T9脊髓.A组以尖刀片自左向右横行一次性切断脊髓;B组将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入并分别向两侧缓慢细心切断脊髓;C组将一丝线穿过脊髓腹侧硬膜外腔，以长刃显微剪一次性完全横断脊髓，并将丝线由断端间隙中拉出;D组以尖刀片自脊髓背侧至腹侧分层快速划断脊髓，再抬起脊髓两断端以验证横断的完全性.术后1h肉眼观察脊髓形态变化，8wk时评估截瘫后肢自发性运动功能恢复后，处死动物，取脊髓损伤节段，行连续矢状冰冻切片，小鼠抗神经丝抗体免疫组化染色，光镜下观察有无神经纤维的残留或再生，以及空洞及瘢痕的形成. 结果 A，B两组术后脊髓肿胀、外翻，8wk时分别有50%，38%的动物出现程度不等的功能恢复，镜下可见成束残留纤维和大量空洞.C，D两组术后脊髓外观良好，8wk时无功能恢复和残留纤维，但有少量神经丝免疫反应再生纤维.与D组相比，C组断端间隙较大且空洞较多. 结论经作者创新的D组方法，横断完全、损伤较小，为简便易行、效果可靠的脊髓全横断手术
方法. Keywords:cordotomy;nerve fibers;cavities;axonal regen-eration;rat Abstract:AIM To compare the effects of four spinal cord transecting methods on spontaneous motor recovery in para-plegic hindlimbs and histological changes within the spinal cord in adult rats.METHODS Thirty-two adult male SD rats were divided into Groups A，B，C and D（n=8for each group，which received one of the four methods of spinal cord transection at T9）.In Group A，the spinal cord was tran-sected with a sharp blade along the inner wall of the vertebral channel.The blade in Group B，however，was vertically in-serted through the cord at midline and guided to slowly and carefully cut the bilateral halves of the cord separately.In Group C，the cord was cut with a pair of long-edge microscis-sors，and the completeness of the transection was verified by guiding a surgical suture through the ventral extradural space before and pulling the suture out through the gap between the2stumps of the transected cord.The cord of Group D an-imals was dissected with a sharp blade in quick gashes，and complete transection was checked by uplifting one
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分：无可见后肢运动 1分：一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分：一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分：后肢全部三个关节可轻微活动 5分：两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分：两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分：后肢全部三个关节可广泛活动 8分：非承重情况下可以爪掌面着地 9分：间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作 11分：可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分：可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分：常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分：有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分：持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移
后旋转。 17分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分：持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7 主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14 看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18 看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调 19-21 看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？
第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 2、汗腺，大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对，鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对。 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中，由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一.脊柱大鼠的脊柱由57 —61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎& 荐锥 4、尾锥27 —31块。锥式C7T13L6S4Cy27—31。骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块，全无肋骨相连，横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎13块，椎骨的长度由前向后逐渐增加（由2毫米增加到4毫米），锥管的直径平均为3.3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 3、腰椎6块，每块锥体的长度比较一致，约 6 —7毫米。锥管直径由前面的 4 毫米向后逐渐缩小至2毫米。 二、胸骨 共分为6节，最前一节为胸骨柄，第二到第五节称为胸骨体，最后一节为剑突，棒状的剑突后面接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统（省略） 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管
、口腔1、舌全长约30毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米，食管外径约2毫米。 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置：横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的0.5% ,属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃。胃大弯朝向腹后方，其边缘 有双层的口袋状大网膜。贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺。 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米。 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧。可分为降支（向右后行）、横支（水平部）、升支（向前行），它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有700—1000毫米。 位置形态：盘旋在腹腔的右方腹侧部。 3、回肠 长度：较短，约有40毫米。 位置形态：以三角形的系膜回盲褶与盲肠的末端相连，向盲肠的开口与结肠的起始部紧密相接。 二、大肠 1、盲肠 长度：是介于小肠与盲肠之间的一个大的盲囊。长约60毫米，直径约10毫米。位置：通常位于腹腔的左后部。盲肠呈锥体形，分为基部、体部和尖端。 2、结肠 长度：长约100毫米。
褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153／CHOP表 达的影响 目的探讨褪黑素（MT）对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠模型脊髓组织GADD153/CHOP表达的影响。方法选取健康SD大鼠96只，随机分为生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只。所有大鼠均以改良Allen法制备脊髓损伤模型；MT组在模型制备的基础上给予褪黑素治疗；ET组在模型制备的基础上给予5%乙醇处理；NS组在模型制备的基础上给予0.9%氯化钠溶液处理。分别于伤后3 h、1 d 、3 d、7 d时各取8只应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；Tarlov评分后处死，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和CHOP表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度（IOD）及细胞凋亡指数（AI）来表示。结果所有实验大鼠脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。MT组Tarlov评分除3 h时间点外，其他各时间点Tarlov评分明显高于ET组及NS组，且差异有统计学意义（P 0.05）。结论MT可抑制CHOP 表达，降低脊髓细胞凋亡指数，可能为其发挥急性脊髓损伤保护作用的重要机制之一。 标签：褪黑素；急性脊髓损伤；GADD153/CHOP；细胞凋亡；药物治疗 现代研究结果显示[1]，急性脊髓损伤（actue spinal cord injury，ASCI）后存在广泛细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，目前大量研究认为其对损伤后神经功能产生重要的影响[2]，是导致继发性脊髓损伤的主要原因[3]。以往认为细胞凋亡信号传导通路包括线粒体和死亡受体途径[4]。最新研究表明，内质网应激也参与了细胞凋亡，其中CHOP/GADD153（C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage inducible gene 153）是内质网应激特异的转录因子[5-6]，可由DNA生长停滞性损害诱导产生。黄怀等[7]发现内质网应激可以诱导大鼠ASCI神经细胞的凋亡，加重脊髓的损伤及神经功能障碍，该研究还发现ASCI组织CHOP表达含量的高低与ASCI的严重程度一致。CHOP又称内质网应激促凋亡蛋白，是继发性脊髓损伤发生机制的重要因素之一。褪黑素（melatonin，MT）是人体重要神经内分泌活性物之一，主要由松果体分泌，因此也称为松果体素。目前，MT对脊髓损伤的保护作用是国外研究的热点。据相关文献报道，MT对脊髓的保护作用主要通过线粒体通路或者死亡受体通路而实现，关于MT通过内质网通路发挥脊髓保护作用的文献鲜有报道。本实验旨在观察褪黑素对大鼠ASCI后脊髓组织内质网应激相关蛋白GADD153/CHOP表达的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。 1 材料与方法 1.1 动物与分组
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定 目的：对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定，观察其生长方式和分化特征。方法：运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养，对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin 表达情况。用血清诱导其分化，分化7 d后，采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulin Ⅲ、Galc的表达情况。结果：大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中，呈悬浮状态生长，形成细胞球，经免疫荧光检测，细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后，转为贴壁生长，经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性，少部分细胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc阳性。结论：采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。 脑血管病是威胁全世界人类生命健康的一类疾病，其中缺血性脑梗死作为神经系统的常见病、多发病，其发病率、病死率和致残率均很高。且随着人口结构的老龄化和吸烟人口的增加，脑血管病的发病率有进一步上升的趋势。传统的治疗方法包括药物、康复理疗和功能锻炼等，但效果均不理想。近年来，随着干细胞（Stem cells，SCs）理论的提出，不少研究者相继报道从神经组织、脂肪组织、骨髓等组织中分离并培养出了各自的干细胞，其中神经系统来源的干细胞被称之为神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）[1]。近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，部分研究者将骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成功诱导为骨髓源神经干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs）[2]。BMSCs-NSCs的开发和应用，克服了从成体脑组织中获取神经干细胞和危险性和局限性，也避免了胚胎来源干细胞移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。骨髓基质细胞源性神经干细胞的移植治疗修复中枢神经系统损害成为了研究重点，这给脑梗死的细胞移植治疗带来了新思路[1-3]。因此，本研究选用Wistar大鼠骨髓基质细胞，运用含bFGF和EGF的无血清DMEM/F12培养基对其进行诱导培养，拟培养Wistar大鼠骨髓源神经干细胞，为骨髓源神经干细胞的进一步研究打下基础，现具体报道如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物成年Wistar大鼠，雄性，体重（200±50）g，购于兰州大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002。 1.1.2 主要试剂DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶（购自Gibco公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。B27添加剂购自Invitrogen 公司。表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自Peprotech 公司，小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon 公司，小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulin Ⅲ抗体购自Abcam公司，兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG购自Molecular Probes公司。DAPI
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分： 无可见后肢运动 1分： 一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分： 一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分： 后肢全部三个关节可轻微活动 5分： 两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分： 两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分： 后肢全部三个关节可广泛活动 8分： 非承重情况下可以爪掌面着地 9分： 间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作
11分： 可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分： 可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分： 常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分： 有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分： 持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。 17分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：
步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调19-21看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养 发表时间：2015-07-24T10:18:58.373Z 来源：《医药前沿》2015年第13期供稿作者：邹瑾1 李雅2 尹进3 [导读] 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一。 邹瑾1 李雅2 尹进3 （1湖南科技职业学院湖南长沙 410014） （2湖南中医药大学湖南长沙 410004） （3湖南疾病预防控制中心湖南长沙 410007） 【摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明 CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠 【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02 Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and to cultivate Zou Jin. Hunan Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Province, Changsha 410007, China 【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle, after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation. 【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是目前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验目的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。 1.材料与方法 1.1材料 雄性SPF级SD大鼠，5～7周，体重110±20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CD11b、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。 1.2方法 1.2.1原代培养BMSCs 将经过高压灭菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱臼法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的CO2的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。 1.2.2传代、纯化BMSCs 当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用有15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里，1200转/分，离心3分钟，将上清液丢弃，放入新的培养基，吹散后按一比二的比例，进行传代培养，将P1设为其标记，之后进行日常观察细胞的生长状态，直到贴壁细胞的融合现象能够有80%左右的时候，再重复上述的操作步骤，进行反复传代。 1.2.3测定BMSCs的生长曲线选择生长良好的P1、P3、P5的细胞，消化后以1×104/mL接种在二十四孔板中，每日均选取三孔，并计算其细胞的数量，按照一孔计算三次的方式，取其平均数，共计连续培养七天，将培养的时间设为横轴，将细胞数设为纵轴，进行生长曲线的绘制。 1.2.4鉴定BMSCs 选择P3的细胞，用混合消化液将细胞进行消化，然后配成细胞的悬液，使用1%浓度的BSA，将封闭液进行10min的封闭处理，然后洗涤PBS三次后，放入FITC荧光标记的CD11b、CD90、CD45抗体中，对照组再放入PBS，在4摄氏度的环境下，进行30min的孵育，1500转/分，离心5分钟，冲洗PBS三次，使用1%浓度的多聚甲醛进行固定，使用FACScan流式细胞仪，进行细胞表面抗原的检测。 2.结果 2.1 BMSCs细胞培养的形态 BMSCs在接种24小时后，就能够看到细胞有贴壁的现象。48个小时后，细胞的贴壁现象更加趋于明显，其中细胞的形状主要是椭圆形、圆形这两种。在第三天到第五天的时候，细胞形状变成多边形、二角形、短梭形，并变成集落的生长方式。在第六天到第十天的时候，细胞能够形成80%到90%的融合现象，而且已经将瓶底铺满，分布形状呈现旋涡状，并且能够进行传代。在刚传代的细胞形状为圆形，且传代的细胞，和原代细胞相比，其生长速度更快，在四个小时的时间内，就出现了贴壁的细胞，在二十四个小时内，所有的细胞已经全部贴壁，并且呈现伸展的生长状态，在6天到8天后，就能够进行传代，传代的细胞生长均匀分布，且大部分细胞的形状是梭形。
SD大鼠脊髓损伤模型的制备及功能的评定作者：程方圆沈程肖贵虎杨明英杨金梅罗川南 指导老师：荣成 （四川省成都市成都医学院，610500） 摘要目的：通过对SD大鼠脊髓顿挫损伤（Spinal cord injury，SCI）模型进行功能评价，观察SD大鼠脊髓恢复情况。方法：将SD大鼠随机分成实验组、对照组两组，将实验组用 Allens法进行T9脊髓顿挫损伤，制成大鼠脊髓损伤模型。对所有大鼠的后肢运动功能进行BBB评分和脊髓组织学观察。结果：实验组大鼠BBB评分一周后最高达到14分，最低达到3分。BBB功能评分显示实验组大鼠运动功能明显低于对照组，并逐渐恢复或增强。结论：脊髓顿挫导致大鼠后肢功能障碍，通过BBB评分显示，大鼠后肢功能逐渐增强。 【关键词】脊髓顿挫损伤；后肢运动功能；BBB评分 Objective: observe the recovery situation of the SD rats through the abortive on spinal cord injury in SD rats (spinal cord injury, SCI) function evaluation model .methods: SD rats were divided into two groups randomly, including normal group and experimental group. SD rat model of acute spinal cord injury were established by using Allens method at 9th spinal cord, evaluate the hind limb motor of all rats and observe the histology of spinal. Result: the experimental rats’ BBB score up to 14 points after one week, the lowest reach 3 points. The BBB score of experimental rat s showed that the rats’ motor function was significantly lower than the normal rats, and gradually restored or enhanced. Conclusion: aborting spinal cord leads to hind limb dysfunction, the BBB score showed that the hind limb function of rats is enhancing gradually。Key words: spinal cord injury; hind limb motor function; BBB score 前言：脊髓损伤是由于各种原因引起的脊髓结构和功能的损害，是脊柱损伤最严重的并发 症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，是中枢神经系统严重的致残性疾病。随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。有研究表明脊髓损伤后有一定修复能力，为此我们设计了此实验。通过对照实验将SD大鼠随机分为脊髓损伤与否两组大鼠，对脊髓损伤的大鼠模型进行功能评价，从而找到更好的治疗脊髓损伤的办法。经过实验，我们发现SD大鼠在脊髓损伤后功能逐步恢复。 1 材料与方法 1.1主要仪器 鼠台、橡胶圈、玻璃分针、烧杯、10g金属棒、粗剪刀、手术器械、婴儿磅秤、缝合针、棉线、棉签、注射器、脊髓打击装置。 1.2 主要试剂 3.6%水合氯醛、青霉素、葡萄糖、1.5%戊巴比妥溶液。 1.3 实验动物 健康成年雌性大鼠10只，体重200±50g。饲养两周后进行实验。
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
脊髓电刺激疗法 疗法简介 脊髓电刺激疗法是治疗慢性顽固性疼痛的一种方法。 脊髓电刺激系统由三个部分组成：植入患者脊髓硬膜外间隙的电极，植入腹部或臀部皮下的发放电脉冲的刺激器，以及连接两者的延伸导线。 脊髓电刺激治疗的原理主要是：通过植入脊髓硬膜外间隙的电极传递的电刺激，阻断疼痛信号通过脊髓向大脑传递，使疼痛信号无法到达大脑皮层，从而达到控制疼痛的目的。 脊髓外周电刺激系统植入术是一个微创手术。医生在影像学设备的引导下通过穿刺或在脊柱上开一个小骨窗，将电极放到脊髓硬膜外间隙的特定节段，然后通过体外的临时刺激器观察刺激覆盖的位置以及疼痛改善的程度，并根据测试的情况调整电极的位置以达到最佳的刺激状态。患者在此过程中保持清醒状态以配合测试。测试成功后患者会带着临时刺激器回病房，接受一个两到七天左右的测试期，观察疼痛和日常生活(如睡眠、行走等)的改善情况。若疼痛缓解良好且患者对治疗效果较满意，则植入整个刺激系统(延伸导线和刺激器。)术后医生和专业技术人员会用体外程控仪对脊髓电刺激系统进行无创性的设置和调整，患者也可以用配置的病人程控器在医生设定的范围内进行调节，操作非常方便灵活。 病例选择 病例选择是神经电刺激治疗能否获得成功的关键，接受治疗的患者必须符合如下标准：患者的诊断必须适合这项治疗(如神经病理性疼痛综合征)、患者传统治疗方法失效、排除显著的心理方面的问题以及神经电刺激测试证明了疼痛的缓解。 让患者明白脊髓电刺激的治疗目标是减轻疼痛而不是消除疼痛，疼痛减轻的程度为50%～70%，而且在治疗中十分需要患者的配合及参与，包括： 1﹒围术期疼痛强度评估表、示意图的填写及绘制; 2﹒术中电极的放置、刺激参数的设置等都是根据患者的描述完成的; 3﹒术后脊髓电刺激系统的操作、术后注意事项、尤其治疗初期对一些活动的限制等都需要患者主动的配合及参与，在整个脊髓电刺激治疗中，只有患者的积极治疗意识及自我管理意识，才能使脊髓电刺激的治疗效果达到最佳。
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
Western blot 试验操作步骤 一、蛋白样品制备 1 用细胞刮刀将细胞刮下（不要将培养基倒掉），用吸管将其吸至离心管中 2 用4℃预冷的PBS 1ml冲洗培养瓶2次收集入上述离心管中 3 1000rpm，离心10min 4 倒掉上清，沉淀用1ml PBS 重悬，转入EP管中，再加1ml PBS冲洗离心管壁上残留的细 胞转入EP管中 5 4℃，4000rpm，离心5min 6 倒掉上清液（用抢把残余上清吸干净） 7 配制裂解液，计算所需用量，每个EP管中加入100ul裂解液(10mg组织/100ul) 若有4管（4组），配制400ul裂解液：PMSF储备液浓度100mM，用RIPA稀释至1Mm. 【单去污剂裂解液（PMSF）：1mol/L Tris·HCl（pH8.0）2.5ml; NaCl 0.438gTritonX-100 0.5ml ; 蒸馏水至50ml; 混匀后4℃保存】 8 4℃裂解30-45min，每5min振荡一次 9 4℃ 14000g 离心5min，取上清（移入1.5ml的EP管中）。 10 蛋白定量（常用BCA法，参见蛋白定量试剂盒使用说明） 每管蛋白一致，分装约20ul/管左右（加入5×buffer并用RIPA稀释成1×） 11 将蛋白样100℃，变性5min，，-80℃（or -20℃）保存。 二、SDS-PAGE的配制： 1 试剂及配制： （1）30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29g，N,N-亚甲基双丙烯酰胺1g，去离子水至100ml，过滤，避光，4℃贮存。 （2）1. 5mmol/L Tris溶液（PH8.8）：称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （3）1.0mmol/LTris溶液（pH6.8）：称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解，用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8，加超纯水定容至100 ml，室温储存。 （4）10%SDS：1g SDS加入10ml去离子水，室温贮存。 （5）10%过硫酸铵溶液：0.1g过硫酸铵加入1ml水，4℃保存，现用现配。 （6）TEMED（可购买成品）