成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较
作者：王春婷，游思维，刘惠玲，陈秉耀，焦西英，孟晓梅，吴宗亮，鞠躬
【关键词】脊髓切断术
关键词: 脊髓切断术;神经纤维;空洞;轴突再生;大鼠
摘要:目的比较成年大鼠4种脊髓全横断方法对后肢运动功能及脊髓组织学的影响. 方法 32只成年SD大鼠分为A，B，C和D4组，每组8只，分别以4种不同方法全横切T9脊髓.A组以尖刀片自左向右横行一次性切断脊髓;B组将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入并分别向两侧缓慢细心切断脊髓;C组将一丝线穿过脊髓腹侧硬膜外腔，以长刃显微剪一次性完全横断脊髓，并将丝线由断端间隙中拉出;D组以尖刀片自脊髓背侧至腹侧分层快速划断脊髓，再抬起脊髓两断端以验证横断的完全性.术后1h肉眼观察脊髓形态变化，8wk时评估截瘫后肢自发性运动功能恢复后，处死动物，取脊髓损伤节段，行连续矢状冰冻切片，小鼠抗神经丝抗体免疫组化染色，光镜下观察有无神经纤维的残留或再生，以及空洞及瘢痕的形成. 结果 A，B两组术后脊髓肿胀、外翻，8wk时分别有50%，38%的动物出现程度不等的功能恢复，镜下可见成束残留纤维和大量空洞.C，D两组术后脊髓外观良好，8wk时无功能恢复和残留纤维，但有少量神经丝免疫反应再生纤维.与D组相比，C组断端间隙较大且空洞较多. 结论经作者创新的D组方法，横断完全、损伤较小，为简便易行、效果可靠的脊髓全横断手术
方法.
Keywords:cordotomy;nerve fibers;cavities;axonal regen-eration;rat
Abstract:AIM To compare the effects of four spinal cord transecting methods on spontaneous motor recovery in para-plegic hindlimbs and histological changes within the spinal cord in adult rats.METHODS Thirty-two adult male SD rats were divided into Groups A，B，C and D（n=8for each group，which received one of the four methods of spinal cord transection at T9）.In Group A，the spinal cord was tran-sected with a sharp blade along the inner wall of the vertebral channel.The blade in Group B，however，was vertically in-serted through the cord at midline and guided to slowly and carefully cut the bilateral halves of the cord separately.In Group C，the cord was cut with a pair of long-edge microscis-sors，and the completeness of the transection was verified by guiding a surgical suture through the ventral extradural space before and pulling the suture out through the gap between the2stumps of the transected cord.The cord of Group D an-imals was dissected with a sharp blade in quick gashes，and complete transection was checked by uplifting one
of the stumps.The appearance of the exposed spinal cord was ob-served with naked eyes1h after the surgery，and the locomo-tor recovery of the hindlimbs was evaluated with the BBB rat-ing scale at8wk after surgery before sacrificing all animals.The damaged spinal cord segments were sectioned sagittally，prepared for anti-neurofilement immunostaining，and ob-served under a light microscope for any possible remaining and regenerating nerve fibers as well as the formation of cavi-tation and scars.RESULTS Spinal cord edema and ectropi-on could be encountered1h after the surgery，and50%and38%animals showed different degrees of locomotor recovery and corresponding remaining nerve fibers with many scars and cavities8wk following the surgery in Groups A and B.As for Groups C and D animals，a better appearance of the cord without much edema and ectropion was observed at1h and no locomotor recovery could be revealed at8wk.A few neurofilament-positive regenerating，but not remaining，fibers were observed within the lesion site.Group C animals had a wider gap between the two stumps of the transected spinal cord and more cavities in the injured spinal segments than those animals in Group D.CONCLUSION The authors’innovated transecting method in Group D is easy and reliable because of its properties of the completeness of tran-section and
大鼠骨髓间充质干细胞培养 干细胞是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，干细胞的增殖保证了机体内的动态平衡。 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血干细胞，能在体外或体内分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。 源于自体骨髓的间质干细胞能够很好地避免异体间移植的免疫排斥反应，在临床上，已经成功地将骨髓间充质干细胞移植到患者体内，用于治疗骨组织缺损和心肌梗塞等疾病。 本实验根据骨髓中间充质干细胞的贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性用贴壁法将其分离开来，此方法得率高、操作简单、无需特殊试剂，已广泛应用于科研工作中。 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 选取SPF级，体重100~150g左右的SD大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5 min。 工作台紫外消毒后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。 无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、全骨髓提取 眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。 假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。 用无菌PBS浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。
成年大鼠4种脊髓全横断方法的比较 作者：王春婷，游思维，刘惠玲，陈秉耀，焦西英，孟晓梅，吴宗亮，鞠躬 【关键词】脊髓切断术 关键词: 脊髓切断术;神经纤维;空洞;轴突再生;大鼠 摘要:目的比较成年大鼠4种脊髓全横断方法对后肢运动功能及脊髓组织学的影响. 方法 32只成年SD大鼠分为A，B，C和D4组，每组8只，分别以4种不同方法全横切T9脊髓.A组以尖刀片自左向右横行一次性切断脊髓;B组将尖刀片自脊髓背部中线处垂直插入并分别向两侧缓慢细心切断脊髓;C组将一丝线穿过脊髓腹侧硬膜外腔，以长刃显微剪一次性完全横断脊髓，并将丝线由断端间隙中拉出;D组以尖刀片自脊髓背侧至腹侧分层快速划断脊髓，再抬起脊髓两断端以验证横断的完全性.术后1h肉眼观察脊髓形态变化，8wk时评估截瘫后肢自发性运动功能恢复后，处死动物，取脊髓损伤节段，行连续矢状冰冻切片，小鼠抗神经丝抗体免疫组化染色，光镜下观察有无神经纤维的残留或再生，以及空洞及瘢痕的形成. 结果 A，B两组术后脊髓肿胀、外翻，8wk时分别有50%，38%的动物出现程度不等的功能恢复，镜下可见成束残留纤维和大量空洞.C，D两组术后脊髓外观良好，8wk时无功能恢复和残留纤维，但有少量神经丝免疫反应再生纤维.与D组相比，C组断端间隙较大且空洞较多. 结论经作者创新的D组方法，横断完全、损伤较小，为简便易行、效果可靠的脊髓全横断手术
方法. Keywords:cordotomy;nerve fibers;cavities;axonal regen-eration;rat Abstract:AIM To compare the effects of four spinal cord transecting methods on spontaneous motor recovery in para-plegic hindlimbs and histological changes within the spinal cord in adult rats.METHODS Thirty-two adult male SD rats were divided into Groups A，B，C and D（n=8for each group，which received one of the four methods of spinal cord transection at T9）.In Group A，the spinal cord was tran-sected with a sharp blade along the inner wall of the vertebral channel.The blade in Group B，however，was vertically in-serted through the cord at midline and guided to slowly and carefully cut the bilateral halves of the cord separately.In Group C，the cord was cut with a pair of long-edge microscis-sors，and the completeness of the transection was verified by guiding a surgical suture through the ventral extradural space before and pulling the suture out through the gap between the2stumps of the transected cord.The cord of Group D an-imals was dissected with a sharp blade in quick gashes，and complete transection was checked by uplifting one
大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定 目的：对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定，观察其生长方式和分化特征。方法：运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养，对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin 表达情况。用血清诱导其分化，分化7 d后，采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulin Ⅲ、Galc的表达情况。结果：大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中，呈悬浮状态生长，形成细胞球，经免疫荧光检测，细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后，转为贴壁生长，经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性，少部分细胞呈MAP-2、β-tubulin Ⅲ及Galc阳性。结论：采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。 脑血管病是威胁全世界人类生命健康的一类疾病，其中缺血性脑梗死作为神经系统的常见病、多发病，其发病率、病死率和致残率均很高。且随着人口结构的老龄化和吸烟人口的增加，脑血管病的发病率有进一步上升的趋势。传统的治疗方法包括药物、康复理疗和功能锻炼等，但效果均不理想。近年来，随着干细胞（Stem cells，SCs）理论的提出，不少研究者相继报道从神经组织、脂肪组织、骨髓等组织中分离并培养出了各自的干细胞，其中神经系统来源的干细胞被称之为神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）[1]。近年来，随着神经干细胞研究的不断深入，部分研究者将骨髓基质细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成功诱导为骨髓源神经干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs）[2]。BMSCs-NSCs的开发和应用，克服了从成体脑组织中获取神经干细胞和危险性和局限性，也避免了胚胎来源干细胞移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。骨髓基质细胞源性神经干细胞的移植治疗修复中枢神经系统损害成为了研究重点，这给脑梗死的细胞移植治疗带来了新思路[1-3]。因此，本研究选用Wistar大鼠骨髓基质细胞，运用含bFGF和EGF的无血清DMEM/F12培养基对其进行诱导培养，拟培养Wistar大鼠骨髓源神经干细胞，为骨髓源神经干细胞的进一步研究打下基础，现具体报道如下。1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物成年Wistar大鼠，雄性，体重（200±50）g，购于兰州大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002。 1.1.2 主要试剂DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶（购自Gibco公司）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Hyclone公司。B27添加剂购自Invitrogen 公司。表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自Peprotech 公司，小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon 公司，小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulin Ⅲ抗体购自Abcam公司，兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG购自Molecular Probes公司。DAPI
BBB(大鼠脊髓损伤)评分标准： 0分： 无可见后肢运动 1分： 一或两个关节轻微运动，通常为髋和/或膝关节 2分： 一个关节广泛活动或一个关节广泛活动且有另一关节轻微活动3分：两个关节广泛活动 4分： 后肢全部三个关节可轻微活动 5分： 两个关节轻微活动，第三个关节可广泛活动 6分： 两个关节广泛活动，第三个关节可轻微活动 7分： 后肢全部三个关节可广泛活动 8分： 非承重情况下可以爪掌面着地 9分： 间或爪掌面承重支撑或爪背面承重移动，无爪掌面支撑移动10分：偶见爪掌面承重移动；无前后肢协调动作
11分： 可较多的见到掌面承重移动，但无前后肢协调动作 12分： 可较多的见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作 13分： 常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作 14分： 有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作；或出现常见的掌面移动，持续型前后肢协调动作，偶有爪背侧移动 15分： 持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或欧有抓地；初接触时主动爪位置与身体平行 16分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转。 17分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。 18分： 步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转。 19分：
步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地；初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行。尾巴有时或总是下垂。 20分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起。 21分： 持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。 关于BBB评分，的确有很大的主观性，我目前把BBB评分分三大块，0-7主要看关节动否？有几个关节动？ 8-14看脚掌能否着地？着地后能否运动？运动协调不？ 15-18看脚尖能否抓地？脚尖与前进方向是否一致？前后肢运动是否协调19-21看运动时躯干稳不稳定？尾巴翘不翘？
大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养 发表时间：2015-07-24T10:18:58.373Z 来源：《医药前沿》2015年第13期供稿作者：邹瑾1 李雅2 尹进3 [导读] 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一。 邹瑾1 李雅2 尹进3 （1湖南科技职业学院湖南长沙 410014） （2湖南中医药大学湖南长沙 410004） （3湖南疾病预防控制中心湖南长沙 410007） 【摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。流式细胞术鉴定表明 CD11b和CD45阴性，CD90阳性。结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠 【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02 Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and to cultivate Zou Jin. Hunan Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Province, Changsha 410007, China 【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle, after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and culture of rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation. 【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat 骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、肌细胞和脂肪细胞，还可以跨胚层分化为神经元、肝细胞和内皮细胞等，是目前组织工程的重点种子细胞。分离培养高纯度和高活力的BMSCs是组织工程的关键。本实验目的在于采用改良全骨髓贴壁法对大鼠BMSCs进行分离培养，为组织工程技术提供种子细胞。 1.材料与方法 1.1材料 雄性SPF级SD大鼠，5～7周，体重110±20g，购自湖南中医药大学动物实验中心。L-DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）。PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶（Sigma公司），EDTA二钠（上海生物工程有限公司），FITC标记CD11b、CD90、CD45抗体（Serantec公司）等。 1.2方法 1.2.1原代培养BMSCs 将经过高压灭菌的手术器械准备好，大鼠采取颈椎脱臼法处死后，放在75%的酒精中浸泡10分钟。在无菌的环境下，快速取出大鼠的股骨、胫骨，并剔除其周围的组织，然后切除大鼠的股骨、胫骨的两端。使用5mL剂量的注射器，抽取DMEM液，给大鼠的骨髓腔进行反复冲洗，然后把冲洗液收集起来，放在离心管里，1500转/分，离心5分钟后将上清液丢弃。放进有15%的胎牛血清的DMEM培养液中，反复吹打，经过细胞计数之后，按照109/mL的密度，在50cm2的培养瓶里接种，放置温度在37摄氏度、湿度饱和、体积分数是0.05的CO2的培养箱里，进行培养。使用倒置的显微镜，进行日常观察其细胞的生长状态。48个小时之后开始换液，并丢弃未贴壁的细胞，之后每隔两天进行一次换液。 1.2.2传代、纯化BMSCs 当原代培养的细胞增殖，能够在瓶底的融合情况大致到达80%左右时，用0.25%浓度和0.01%浓度的EDTA混合消化酶，进行细胞消化，使用有15%的胎牛血清的培养基进行消化反应的终止处理，然后使用吸管，进行轻轻的吹打，让细胞能够完全脱壁，再将其放入离心管里，1200转/分，离心3分钟，将上清液丢弃，放入新的培养基，吹散后按一比二的比例，进行传代培养，将P1设为其标记，之后进行日常观察细胞的生长状态，直到贴壁细胞的融合现象能够有80%左右的时候，再重复上述的操作步骤，进行反复传代。 1.2.3测定BMSCs的生长曲线选择生长良好的P1、P3、P5的细胞，消化后以1×104/mL接种在二十四孔板中，每日均选取三孔，并计算其细胞的数量，按照一孔计算三次的方式，取其平均数，共计连续培养七天，将培养的时间设为横轴，将细胞数设为纵轴，进行生长曲线的绘制。 1.2.4鉴定BMSCs 选择P3的细胞，用混合消化液将细胞进行消化，然后配成细胞的悬液，使用1%浓度的BSA，将封闭液进行10min的封闭处理，然后洗涤PBS三次后，放入FITC荧光标记的CD11b、CD90、CD45抗体中，对照组再放入PBS，在4摄氏度的环境下，进行30min的孵育，1500转/分，离心5分钟，冲洗PBS三次，使用1%浓度的多聚甲醛进行固定，使用FACScan流式细胞仪，进行细胞表面抗原的检测。 2.结果 2.1 BMSCs细胞培养的形态 BMSCs在接种24小时后，就能够看到细胞有贴壁的现象。48个小时后，细胞的贴壁现象更加趋于明显，其中细胞的形状主要是椭圆形、圆形这两种。在第三天到第五天的时候，细胞形状变成多边形、二角形、短梭形，并变成集落的生长方式。在第六天到第十天的时候，细胞能够形成80%到90%的融合现象，而且已经将瓶底铺满，分布形状呈现旋涡状，并且能够进行传代。在刚传代的细胞形状为圆形，且传代的细胞，和原代细胞相比，其生长速度更快，在四个小时的时间内，就出现了贴壁的细胞，在二十四个小时内，所有的细胞已经全部贴壁，并且呈现伸展的生长状态，在6天到8天后，就能够进行传代，传代的细胞生长均匀分布，且大部分细胞的形状是梭形。
SD大鼠脊髓损伤模型的制备及功能的评定作者：程方圆沈程肖贵虎杨明英杨金梅罗川南 指导老师：荣成 （四川省成都市成都医学院，610500） 摘要目的：通过对SD大鼠脊髓顿挫损伤（Spinal cord injury，SCI）模型进行功能评价，观察SD大鼠脊髓恢复情况。方法：将SD大鼠随机分成实验组、对照组两组，将实验组用 Allens法进行T9脊髓顿挫损伤，制成大鼠脊髓损伤模型。对所有大鼠的后肢运动功能进行BBB评分和脊髓组织学观察。结果：实验组大鼠BBB评分一周后最高达到14分，最低达到3分。BBB功能评分显示实验组大鼠运动功能明显低于对照组，并逐渐恢复或增强。结论：脊髓顿挫导致大鼠后肢功能障碍，通过BBB评分显示，大鼠后肢功能逐渐增强。 【关键词】脊髓顿挫损伤；后肢运动功能；BBB评分 Objective: observe the recovery situation of the SD rats through the abortive on spinal cord injury in SD rats (spinal cord injury, SCI) function evaluation model .methods: SD rats were divided into two groups randomly, including normal group and experimental group. SD rat model of acute spinal cord injury were established by using Allens method at 9th spinal cord, evaluate the hind limb motor of all rats and observe the histology of spinal. Result: the experimental rats’ BBB score up to 14 points after one week, the lowest reach 3 points. The BBB score of experimental rat s showed that the rats’ motor function was significantly lower than the normal rats, and gradually restored or enhanced. Conclusion: aborting spinal cord leads to hind limb dysfunction, the BBB score showed that the hind limb function of rats is enhancing gradually。Key words: spinal cord injury; hind limb motor function; BBB score 前言：脊髓损伤是由于各种原因引起的脊髓结构和功能的损害，是脊柱损伤最严重的并发 症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，是中枢神经系统严重的致残性疾病。随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。有研究表明脊髓损伤后有一定修复能力，为此我们设计了此实验。通过对照实验将SD大鼠随机分为脊髓损伤与否两组大鼠，对脊髓损伤的大鼠模型进行功能评价，从而找到更好的治疗脊髓损伤的办法。经过实验，我们发现SD大鼠在脊髓损伤后功能逐步恢复。 1 材料与方法 1.1主要仪器 鼠台、橡胶圈、玻璃分针、烧杯、10g金属棒、粗剪刀、手术器械、婴儿磅秤、缝合针、棉线、棉签、注射器、脊髓打击装置。 1.2 主要试剂 3.6%水合氯醛、青霉素、葡萄糖、1.5%戊巴比妥溶液。 1.3 实验动物 健康成年雌性大鼠10只，体重200±50g。饲养两周后进行实验。
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml 细胞生长液中大约需要4.5ml
文章编号:0253-3626(2003)04-0436-04 大鼠骨髓巨噬细胞的分离,纯化,培养以及鉴定 李静,王亚平 (重庆医科大学基础医学院组胚教研室,重庆400016) =摘要>目的:为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。方法:分离获取大鼠骨髓细胞,在60%DM EM培养液,20%马血清,20%(v/v)L929培养上清的诱导条件下进行体外贴壁培养,6~7天时获得纯度较高的贴壁细胞。采用倒置显微镜下观察生活状态、Wr ight c s染色光镜观察、电子显微镜观察检测贴壁细胞形态学;酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达;吞噬鸡红细胞及墨汁颗粒实验检测其吞噬功能;免疫细胞化学染色观察细胞表面标志等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。结果:获得高纯度的巨噬细胞,且具有良好的吞噬功能,并且具备巨噬细胞的形态特征,特有的水解酶类及特有的表面标志-CD68。结论:本法是一种简易实用的体外分离、纯化、培养骨髓巨噬细胞的方法。 =关键词>骨髓巨噬细胞;分离;纯化;鉴定 =中国图书分类法分类号>R32.43=文献标识码>A=收稿日期>2002-09-24 Methodology of separation,purification,cultivation an d identification of rat bone marrow macrophage LI Jing,et al (Dep artment o f Histolo gy and Embry ology,College of Basic Medical Sciences,Chongqing Medical University) =Abstract>Obj ective:T o study t he biolo gical functions of bone marrow macrophage(BM M5)and to establish the methodolog y of separation,purification,cultivation and identification of BM M5.M ethods:Using the techniques of anchorage-dependent culture of separated r at bone marrow cell(rBM C)in DM EM culture media(contain20%horse serum,20%(v/v)L929conditioned media)in v itro,a lo t o f purified anchor cells were obtained,and t hese cells were identified wit h specifically biological mar ker of macrophage, such as1,morpholog ical obser vation:invert phase contrast microscopy,light and electron microscopy;2,enzyme cytochemistr y:acid phosphatase(A CP),A-acet ic acid naphthol esterase(A-AN E);3,phagocytic exper iment:phag ocy tosis of chicken er ythrocy tes and prepared Chinese ink;4,immunocytochemistry:surface specific antig en of macrophage(CD68stain).Results:T he cells w er e purified having functional satisfactory macrophage acco rding to morphological observation,enzyme cytochemistr y,phag ocyt ic ex periment and immunocytochemistry.Conclusion:T his is a simple and easy method for separation,purification,cultivation and identificat ion of rat marro w macrophage. =Key w ords>Bone marr ow macro phag e;Separation;Purification;I dentification 巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明[1,2],巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心 作者介绍:李静(1973-),女,讲师,硕士, 主要研究方向:血细胞发生及其调控机理。问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管国内外不少文献报道[3,4]已能从多种组织和器官中分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,成功的建立了骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。
中国组织工程研究与临床康复 第13卷 第36期 2009–09–03出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 3, 2009 Vol.13, No.36 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 7073Department of Urology, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China Cai Peng ★, Studying for master’s degree, Physician, Department of Urology, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China warriormd@https://www.doczj.com/doc/068313695.html, Correspondence to: Zhu Shao-xing, Doctor, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Urology, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China zsxing2005@126. com Supported by: the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. C0710018* Received: 2009-06-12 Accepted: 2009-07-25 全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化*★ 蔡 鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇 Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method Cai Peng, Zhu Shao-xing, Su Yi-ming, Huang Shi-yong Abstract Cai P, Zhu SX, Su YM, Huang SY.Isolation, culture and multi-directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by using the whole bone marrow adherence method.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(36): 7073-7077. [https://www.doczj.com/doc/068313695.html, https://www.doczj.com/doc/068313695.html,] 摘要 蔡鹏，朱绍兴，苏一鸣，黄世勇.全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，13(36):7073-7077. [https://www.doczj.com/doc/068313695.html, https://www.doczj.com/doc/068313695.html,] 基础医学
全骨髓法培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特 性 [ 10-11-01 14:00:00 ] 编辑：studa20 作者：丰炳峰，董晨，关 凤军 【摘要】目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充 质干细胞(MSC) 的方法，研究MSC的生物学特性。方法贴壁培养法分离纯化大鼠MSC，体外培养和连续传代, 在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化；利 用四唑盐比色（MTT）法测定MSC的生长曲线；流式细胞仪（FCM）鉴定MSC膜 抗原。结果原代分离的MSC在接种后48 h贴壁,细胞形态为椭圆形、多角形及短梭形,12天时细胞呈长梭形并达到90%单层融合。经传代扩增,细胞进一步纯化。细胞传代后2天内处于潜伏期, 3天后进入生长期,7天后进入平台期。FCM 检测CD45、CD90阳性率分别为19.60%、95.38%。结论贴壁培养法能有效分离 纯化大鼠MSC,用此方法培养的细胞生长稳定,增殖能力活跃,具有MSC的一般生 物学特性,为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。 【关键词】间充质干细胞;骨髓;贴壁法分离培养 Abstract:Objective To establish a simple and effective method of isolation, purification and cultivation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) in vitro, and explore their biological characteristics.Methods MSC were isolated and purified for culture in vitro and serial passage by the attachment culture method. The morphological changes of the MSC were continuously observed under the inverted microscope. The cell growth curve was measured by MTT method, and membrane antigens were detected with flow cytometry (FCM).Results The MSC in primary culture which were adhered to plastic surface within 48 h after displacement took the oval, asteroid, short and fusiform shapes. 12 days after culture in DMEM- F12 medium containing 10% FBS, the cells reached 90% confluence in single layers, taking a long and fusiform shape. Further purification was achieved by expansion at serial passages. MSC were in latency for 2 days, converted into growth period on the 3rd day and entered the stationary phase on the 7 th day. FCM results indicated that the positive rate of CD45 and CD90 was 19.60% and 95.38%, respectively.Conclusion The attachment culture method can be effectively used to isolate and purify rat MSC. The cultured MSC are stable in growth with active proliferation and share the general biological characteristics of MSC, which will further make them ideal seed cells for tissue engineering.
2011年3月第8卷第9期·短篇论著· EPCS是一类能分化成为血管内皮细胞的干细胞。1997年Asahara等[1]报道EPCS分离成功，并在体内证明其血管生成的能力。随后的研究显示这些细胞来源于骨髓，可特异性地向血管形成的部位（包括缺血组织及肿瘤微环境）归巢[2-4]，参与受损部位的血管发生和血管生成，而且很少整合至正常血管组织内。越来越多的研究认为，EPCS可能会成为新一代理想的再生医学工具或者基因治疗肿瘤的载体，为靶向性治疗提供可能性。SPIO作为MR阴性标记物标记移植细胞，可以为EPCS移植的MRI示踪奠定基础。 1材料与方法 1.1实验动物及试剂、仪器 SD大鼠，体重120～150g，雌雄不拘，清洁级，由山西医科大学实验动物中心提供。 超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Schering公司，德国），淋巴细 大鼠骨髓内皮祖细胞SPIO标记及检测 崔碧，李健丁，张瑞平 山西医科大学第一医院影像科，山西太原030001 [摘要]目的：研究大鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCS）的分离、培养、SPIO标记，SPIO对EPCS的标记效果及其对细胞存活、增殖以及凋亡的影响，为进一步的实验研究奠定基础。方法：SD大鼠体重120～150g，采用梯度密度离心法和贴壁法获取大鼠EPCS，采用25μg/ml SPIO对其标记，比较标记和未标记的EPCS。普鲁士蓝染色观察铁标记率，台盼蓝检测细胞活力，MTT法检测细胞增殖力，Calcein-AM/PI染色检测细胞活性及细胞膜完整性，AO/PI染色检测细胞凋亡率。结果：分离培养EPCS7～10d，细胞集落相互连接，呈典型的铺路石样外观。普鲁士兰染色显示SPIO（25μg/ml，24h）对细胞的标记率接近94%；比较SPIO标记及未标记的EPCS，细胞活力分别为（94.34±0.25）%和（95.33±0.31）%；MTT法检测两组间相比差异无统计意学义（P＞0.05）；Calcein-AM/PI染色检测细胞的活性和膜完整性，存活率分别为96%和97%；AO/PI染色两组细胞的凋亡率均为5%。结论：采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞，经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养。25μg/ml浓度的SPIO细胞标记率高，对细胞毒性小，且不影响EPCS的活力、增殖及凋亡。 [关键词]内皮祖细胞；骨髓；超顺磁性氧化铁颗粒；标记 [中图分类号]R73-351[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）03（c）-033-04 Rat bone endothelial progenitor cells labeled with superparamagnetic iron oxide particles and the detection CUI Bi,LI Jianding,ZHANG Ruiping Department of Radiology,the First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan030001,China [Abstract]Objective:To study the isolation,culture,SPIO mark of the rat bone marrow progenitor cells(endothelial progenitor cells,EPCS),and observe whether there is any effect on cellular viability,proliferation and apoptosis.which lay the foundation for future experimental studies.Methods:The EPCS were collected from bone marrow of rats (weighing120-150g)and cultured.EPCS were obtained by density gradient centrifugation and adhesive-screening methods and labeled with25μg/ml SPIO.Marked and unlabeled groups were compared.Prussian blue staining was used to identify labeling index,Trypan blue staining was employed to detect cell vitality,MTT assay was utilized to detect proliferation activity of stem cells,Calcein-AM/PI staining cell was detected cell activity and membrane integrity,AO/PI staining was detected cell apoptosis.Results:Cell Colonies were connected,showing the typical cobblestone appearance on the7-10d. Prussian blue staining showed that SPIO(25μg/ml,24h)of cells labeled rate of close to94%;compared SPIO labeled and unlabeled EPCS,cell viability was94.34%±0.25%and95.33%±0.31%;MTT assay detected that there was no statistical difference between the groups compared with Italy in righteousness(P＞0.05);Calcein-AM/PI staining cell activity and membrane integrity,survival rates were96%and97%;AO/PI staining cells withered groups death rate was5%.Conclusion: Gradient centrifugation from bone marrow mononuclear cells can be achieved by induction of endothelial progenitor cells, isolated and cultured;25μg/ml high concentrations of SPIO cell labeling dose not affect the EPCS viability,proliferation and apoptosis. [Key words]Endothelial progenitor cell;Bonem arrow;Superparamagnetic iron oxid;Labeling [基金项目]山西医科大学青年科技研究基金（项目名称：SPIO标记干细 胞移植治疗兔脊髓损伤的MR活体示踪；项目编号：2010021038-2）。 [作者简介]崔碧（1984-），女，山西医科大学2008级在读硕士；研究方 向：腹部影像。 [通讯作者]李健丁（1951-），男，本科学历，山西医科大学第一医院影像 科主任，教授；研究方向：腹部影像。