一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶
1、固定化载体的预处理
吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。
2、载体选择
取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。
３、固定化条件的优化
取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。
4、蛋白质含量测定
采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。
5、酶活收率
指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。
6、酶活测定
以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在
60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。
二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶
1、固定化载体及其预处理
选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290
和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。
2、脂肪酶的固定化
采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环
泵中,搅拌器搅拌反应 24h。过滤,测定上清液的蛋白质含量。抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。
三、D380树脂固定果糖基转移酶
1、树脂的预处理
吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理，最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂，然后用 4% HCl 、4% NaOH 交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性，置于 4°C 冰箱保存备用。
2、游离果糖转移酶提取方法
黑曲霉 AS0023细胞的制备见参考文献 [12J 。称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中，加入适量的 0.05moI/ L ， pH5.0 的拧棱酸一磷酸缓冲液，在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后，于 4°C 下冷冻离心( 10000 * g) 20min ，收集上清液在 4°C 条件下进行超滤以提高单位酶活，压力 0.15MPa ，截留相对分子质量 10000 ，粗酶提取液放入冰箱保藏备用。
3、果糖转移酶的固定化方法
用滤纸吸干温树脂表面的水后称取 0.5g 于三角瓶中，加入一定量的酶液，在所需的 pH 下在恒温水浴振荡器中缓慢振荡吸附一定时间后，加入一定量的戊二醒进行交联。交联完成后，弃去上清，用缓冲洛液冲洗戊二醒残留及未固定上的游离酶，所得固定化酶用缓冲液漫
泡待用。
4、酶活测定方法
游离果糖基转移酶活测定:一定体积底物浓度为 10% (w/v )0.05moI/ L 、 pH5.0 的拧穰酸-磷酸缓冲液于直径 50mm ， 100mL 的恒温夹套酶反应器中， 50°C下恒温搅拌反应 1 h ，于 1弗水中煮沸lO min 终止反应。
5、惰组分测定方法
采用 HPLC( 高效液相色谱)法。 HPLC , Waters 209 系列，配有R401 示差折光检测器和M740 数据处理器;色谱柱: Hewlett Packard 公司 APS Hypersil 4.6 * 100mm 填料密度5μm; 流动相:乙睛/水 75/25 ，流速 1mLl min; 强度28 ℃;进样量 :10μL 。6、酶活力定义
每分钟产生 1μmol 在果三糖( 1-kestose )为一个酶活力单位。酶用量为 2U/g 蔗糖。固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶活的
测定方法。固定化酶活回收率:酶活回收率定义为固定化酶活与所添加的总酶活的比值。
四、Burkholderic cepecia 1003 产海因酶固定
1、海因酶的制备
将由本实验室的一株 Burkholderic c叩ecia 10.03 菌株发酵产酶经过细胞破碎、硫酸镣沉淀、疏水层析和离子交换层析等步骤后得到经初步纯化的海因酶酶液。蛋白质量浓度为1. 2 mg/ mL ，于- 2.0°C
下保存备用。
2、 Eupergit C 和 Eupergit C250L的氨基化
分别称取 5 g Eupergit C 和 Eupergit C250L干树脂，于密闭容器内，45 °C下分别用 4.0 mL 2.5% 的NH3? H20 浸泡.48 h ，以去离子水反复淋洗至中性。以 pH 6.5 , 0.1 mol/L 的磷酸缓冲平衡氨基化后的树脂，于4 °C下保存备用。
3、 EDC 溶液的配置
称取0.785 g EDC( 碳化二亚胶 (N 一( dimethyl-aminopropyl) - N’- ethylcarbodiimide) ) ，加入 5 mL MnC1 2 水溶液 (1 mmol/L) 中，用 1%HCl 调节 pH 值至 5.0，定容至 12 mL 。
4、环氧基载体上海因酶的固定化
酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出2mL分别加人0.2 g 的环氧基载体 Eupergit C 和Eupergit C250L 湿树脂。 4°C 下水平轻微振荡后，用pH 8.5 , 0.1 mol/L 的 Tris - HCl 缓冲滤洗，4°C下至少保存48 h后方可使用。
5、氨基载体上海因酶的固定化
酶液用0.1 mol/L 的一定 pH 值的缓冲液稀释，取出 2 mL 分别加入0.2 g 的氨基载体 Eupergit C ( -NH2) 和Eupergit C250L( -NH2 )湿树脂，冰浴条件下手动振荡滴加 EDC 溶液， 4 °C下悬空振荡。反应结束后，需用含0. 5 mol/L NaCl 的 pH 8.5 , 0.1 mol/L 的Tris - HCl 缓冲反复淋洗 3 次，最后用pH 8. 5 , 0.1 moVL 的 Tris - HCl 缓冲滤洗后 4°C保存。
五、黑曲霉果胶酯酶固定化
1、游离酶活力的测定
J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kerte钮， 1937 )测定果胶醋酶的活力。取100mL 质量分数为 0.5% 的柑桶果胶溶液于 40 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到 4 .4，加入lmL 酶液(稀释 10 倍) ，同时开始记时。果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人 O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在4 .4。每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应5min ，以加人的NaOH 的微摩尔数一反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。 1 个酶活单位 :40 °C下，每分钟生成的酸的微摩尔数，即PE 活力单位是μmol/min 。
2、固定化酶活力的测定
J 用 pH - stat 法(Z. 1. Kertesz , 1937) 测定果胶醋酶的活力。取100mL 质量分数为 0.5% 的柑情果胶溶液于 45 °C下恒温，用O.lmol/L 的 NaOH 将 pH 调到固定化果胶醋酶的最适 pH( 明胶固定化果胶醋酶为 4.0 、蛋壳固定化果胶醋酶为 4.2) ，加人一定量的固定化果胶醋酶(明胶固定化果胶醋酶为 8g 、蛋壳固定化果胶醋酶为 1g) ，同时开始记时，果胶醋酶催化果胶水解，使体系的 pH 不断下降，利用自动滴定仪不断滴人O.lmol/L 的 NaOH ，使体系 pH 始终保持在固定化果胶醋酶的最适 pH 。每隔 lmin 记 1 次 NaOH 的消耗量，反应 5min ，以加人的 NaOH 的微摩尔数反应时间作图，由所得直线的斜率计算果胶醋酶的活力。 1个酶活单位: 45 °C下，每
分钟生成的酸的微摩尔数，即 PE 活力单位是μmol/min。
3、固定化酶的制作方法
蛋壳固定化酶的制作方法
蛋壳的预处理
取用水浸泡了一段时间的蛋壳，揭除内层薄膜，研成小片。用去离子水彻底清洗后，用蒸馆水洗涤，再用丙酣溶液洗涤，所得蛋壳碎片于干燥箱内 60 °C干燥数小时，研成小颗粒，待用。
蛋壳的酸处理
称取与预处理好的蛋壳于100mL 烧杯中，向其中缓慢加人 50mL pH = 1. 0 的拧攘酸，以缓解蛋壳的强碱性质，拧攘酸处理 24h ，最终pH =4 。
固定化酶的制备
称取 1g 酸处理后干燥的蛋壳，加入 9mL 乙酸-乙酸铀 (pH = 4.5) 缓冲液，再加入稀释 10 倍的黑由霉果胶醋酶 lmL( 酶活力60U) ，在 4°C (冰水温合物中)搅拌 2-3 h，使其充分吸附在蛋壳上。之后对其进行离心 (4 °C , 5000*g , 20min) ，得到的离心沉淀产物即为固定化果胶醋酶，用乙酸一乙酸铀 (pH4.5 )缓冲液洗涤数次，放在冰箱中 (4 °C)保存备用。
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶 1、固定化载体的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。 2、载体选择 取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。 ３、固定化条件的优化 取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。 4、蛋白质含量测定 采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。 5、酶活收率 指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。 6、酶活测定 以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在
60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。 二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶 1、固定化载体及其预处理 选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290 和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。 2、脂肪酶的固定化 采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环
黑曲乳糖酶的固定化 方法：吸附交联法 载体：以阳离子交换树脂D151 交联剂：戊二醛 与游离酶性质相比： 最适作用温度：降低 热稳定性：降低。 最适pH值：乳糖酶经固定化处理后,其最适pH值较游离酶稍向碱性方向移动 酸碱稳定性：固定化酶酸碱稳定pH值范围在2.5 ～ 4.5;而游离酶酸碱 稳定pH值范围在5.0 ～7.0。 总之，应用吸附交联法制得的固定化乳糖酶, 较游离酶在牛奶的天然pH值下使用 更为适宜, 且操作稳定性好。 脂环酸芽孢杆菌α-葡萄糖苷酶固定化 方法：物理交联法 载体：壳聚糖 交联剂：戊二醛 最适pH：固定化α-葡萄糖苷酶的最适pH 4.5，与游离酶的pH 5.2 相比，其最适pH 值向酸性方向偏移，具有更强的耐酸性，但对碱的耐受性有所降低。 最适温度：固定化酶的最适温度较游离酶有所提高，从游离酶的52 ℃提高到固定化酶的55 ℃，说明固定化后α-葡萄糖苷酶的热稳定性有所提高。 酸碱稳定性：游离酶的耐碱性较固定化酶弱，而pH 大于9.5 时固定化酶活性降低，小于游离酶。 热稳定性：经固定化处理的α-葡萄糖苷酶的热稳定性有了极大的提高。当温度65 ℃时，固定化酶保持近100%酶活力，而游离酶完全失去活性。 总之，相对于游离酶，经壳聚糖固定化后酶的活性中心构象更稳固，削弱了不利因素对酶活性的影响，增加了固定化α-葡萄糖苷酶的稳定性，有利于工业化应用。 漆酶固定化 方法：物理吸附法 载体：纳米多孔金 最适pH：固定化后漆酶具有与游离酶相似的活力-pH 轮廓图, 最佳反应pH 都是 4.5。与游离酶相比固定化不但使漆酶可稳定的pH 范围变宽了(pH 3.5～6.0), 也明显提高了漆酶的耐酸耐碱性 最适温度：固定化酶的最佳反应温度为60 ℃, 较游离酶的40 ℃上升了20 ℃ 热稳定性：固定化后漆酶的热稳定性明显提高 重复利用性：固定化酶具有很好的重复利用性 总之，相对于游离态, 固定化漆酶的最适pH 没有改变, 但最适温度却从游离态的40 ℃上
酶固定化一般方法及载体特性 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
考点二固定化酶和固定化细胞 基础点 1固定化酶 (1)应用实例——果糖生产：葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 (2)固定化酶技术：将酶固定在颗粒状的载体上，再将酶颗粒装到反应柱内，反应柱底端的孔应满足酶颗粒无法通过而反应溶液可以自由通过。 2固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)制备固定化酵母细胞的操作流程：酵母细胞的活化→配制0.05 mol/L CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。 重难点 1制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵 2直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
易错警示(1)固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、pH 等环境条件，以利于酶发挥作用。 (2)正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。 1．思维辨析 (1)反应产物对固定化酶的活性没有影响。( ) (2)固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应。( ) (3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl 2和杂菌。( ) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液。( ) (6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物。( ) 答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√ (5)× (6)× 2．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( ) A ．热稳定性 B ．催化高效性 C ．催化特异性 D ．可反复使用性 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。
2019-2020学年度北师大版高中选修一生物第2章酶技术第4节固定化酶的制 备和应用课后辅导练习第八十八篇 第1题【单选题】 下列说法不正确的是( ) A、固定化酶和固定化细胞在应用上的主要区别是后者需要一定的营养 B、固定化酶技术一次只能固定一种酶 C、固定化酶和固定化细胞的共同点之一是酶都是在细胞外起作用 D、固定化酶和固定化细胞都能反复使用 【答案】： 【解析】： 第2题【单选题】 下图是应用固定化酵母进行葡萄糖发酵的装置，下列说法中不正确的是 A、为使固定化酵母可以反复使用，实验要在无菌条件下进行 B、加入反应液后应保持活塞1始终打开，活塞2则必须关闭
C、装置的长导管主要是为了释放CO2并防止杂菌进入反应柱 D、加入反应液的浓度不能过高以免酵母细胞失水过多而死亡 【答案】： 【解析】： 第3题【单选题】 下列有关固定化酶和固定化细胞的说法正确的是 A、某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应 B、固定化细胞技术一次只能固定一种酶 C、固定化酶和固定化细胞的共同点是所固定的酶都可在细胞外起作用 D、固定化酶和固定化细胞都能反复使用，但酶的活性迅速下降 【答案】： 【解析】： 第4题【单选题】 同工酶具有以下哪个特性?( ) A、具有相同的蛋白质分子结构 B、理化性质相同 C、催化相同的化学反应 D、免疫性能相同 【答案】： 【解析】：
第5题【单选题】 固定化酶和固定化细胞常用的方法不包括( ) A、射线刺激法 B、包埋法 C、化学结合法 D、物理吸附法 【答案】： 【解析】： 第6题【单选题】 加酶洗衣粉既能提高洗涤效果又能缩短洗涤时间而得到普及，洗衣粉中不包括的酶制剂是( ) A、蛋白酶 B、纤维素酶 C、淀粉酶 D、脂肪酶 【答案】： 【解析】： 第7题【单选题】 在以如图所示酶的固定方法模式图中，属于载体结合法的是( )
乳糖酶在乳制品加工中的应用 李倩倩，王丽颖 西南大学荣昌校区动物科学系，重庆 402460 摘要：：乳与乳制品是营养成分十分丰富的天然食品，其营养价值早已得到了世人的公认，然而美中不足的是由于部分人体内缺乏乳糖酶导致的乳糖不耐受现象，影响了他们对乳制品的正常摄入，这在很大程度上制约了乳制品在人们日常生活中的普及和人体对乳制品营养成分的消化吸收。随着现代生物科学技术的发展，人们利用乳糖酶定向水解牛乳中大量的乳糖，从而使得从根本上解决乳糖不耐受这一困绕世人多年的医学难题成为可能。本文就乳糖酶在乳制品加工业生产中的应用作一简要论述，以期对大家有所启迪和帮助。 关键词：乳糖酶；乳制品；应用； Application of lactose in dairy processing LI qianqian.WANG liying Department of Animal Science, Rongchang Campus of Southwest University，Chongqing 402460,China Abstract: Milk and dairy products is very rich in nutrients in natural food, its nutritional value has been recognized, however, a fly in the ointment is due in part to the human body caused by lack of lactase lactose intolerance phenomenon, affecting their normal intake of dairy products, which restricted the dairy products in people's daily life and the popularity of the human body digestion of dairy products in the absorption of nutrients in a very large extent. With the development of modern biological science and technology, people use a lot of lactase hydrolytic milk lactose orientation, so as to fundamentally solve the medical problems that afflict people with lactose intolerance for possible. The application of lactose in dairy industry production are briefly described, with a view to enlighten and help you. Key words: Lactaste; dairy; products; application; 1 乳糖酶
Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding 方法 1测定土壤及植物水状况 （1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。 （3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。 Notice 1RWC计算：RWC=（W f－W d）／（W t－W d）×100% 2WC计算：WC=（W f－W d）／W f×100% W f：叶片鲜重； W d：叶片干重； W t：叶片吸水饱和时的重量。 2酶粗提液的制备 为了测定CA T，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。 为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。 试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。 3酶活性的测定 所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。 3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和Choudhuri，1985；Zhang et al。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm 处的吸光度作为对照，并将之从A560中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个酶活单位。 Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。 试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8） 试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8） 3.2CA T与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CA T来说，其活性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着H2O2的分解而降低程度来确定（ε=39.4M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含50mM磷酸缓冲液（pH7.0），15mMH2O2，0.1ml酶液。加入酶液反应即开始。对POD来说，其活性可以通过测定反应混合液在460nm处的吸光度在1min内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（ε=26.6M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含20mM愈创木酚50μl，10mM磷酸缓冲（pH7.0）2.83ml，0.1ml酶液。加入40mMH2O220μl后反应开始。 试剂：H2O2，愈创木酚 3.3AP的活性可以根据反应混合液在290nm处的吸光度在1min内降低程度来确定（ε=2.8mM －1cm－1，Nakano和Aasda，1981）。反应混合液包含0.5mMAsA,0.1mMH2O2,0.1mMEDTA,50mM 磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.15ml酶液。加入H2O2后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶液反应体系的反应速率进行校正。
乳糖酶的生产技术及其在食品工业应用研究进展 摘要：乳糖酶亦称β-半乳糖苷酶，在工业生产中有广泛的应用，本文通过来源及其性质、基础研究与应用等方面对乳糖酶进行综述。 关键词：乳糖酶；固定化；应用 乳是各种哺乳动物哺育其幼仔最理想的天然食物。它富含优质蛋白质、乳脂、乳糖等营养成分和钙、磷、钾等矿物质以及多种维生素，还含有多种免疫物质、酶、激素等具有生理活性调节功能的生物活性物质。 乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，它是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖组成的双糖，其合成步骤为：以葡萄糖为前体物质，一部分葡萄糖先转化为半乳糖，然后经乳糖合成酶催化。半乳糖与葡萄糖结合，形成乳糖。人体摄入乳糖后，在消化过程中，经乳糖酶催化，分解为葡萄糖和半乳糖。乳糖是矿物质的载体，能促进钙、磷吸收及整理肠道，其分解产物半乳糖是婴儿脑发育的必需物质，参与脑组织及其神经系统的构成。但是，机体却不能直接利用乳糖，乳糖必须经乳糖酶分解为单糖后才能被吸收和利用（杨卉新等，2014）。 若乳糖酶缺乏者一次摄入较多乳糖，乳糖未能及时被消化吸收，进入结肠后被肠道细菌分解，产生大量乳酸、甲酸等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹涨、肠鸣、肠绞痛直至发生水泻等症状，总称为乳糖不耐受症。乳糖不耐受症状，在中国人群中发生率很高，因此限制了很大一部分国人对牛奶的摄入，而牛奶又是人类良好的优质蛋白、矿物质及维生素的天然来源，故乳糖酶缺乏问题显得尤为突出（张玉英，2014）。 1889年荷兰生物学家，Beijerineek 首次报道了乳糖酶可水解乳糖以来，人们对于乳糖酶的研究日趋完整（蒋世琼，2000）。目前，解决乳糖不耐受的最佳方法是用乳糖酶水解乳糖来生产低乳糖或无乳糖乳制品。而现在商业乳糖酶中乳糖酶的最适温度在37℃左右或者更高（P Nicholas，2002）。国外学者经多年研究，已成功地找到产乳糖酶的微生物，并研制了一系列乳糖酶商品，现已投入市场。有学者研究发现环氧活化水凝胶固定化酶可以更好的解决乳糖不耐症问题（Elnashar et al., 2014）。本文就乳糖酶的生产方式及其在食品加工业生产中应用的研究进展作简要论述。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。（2）紫外吸收法： 称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，
2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na
张 海 龙 山东教育学院 生物系 Shan Dong Institute of Education 第九章 第九章 固 固定化酶与固定化细胞技术
第一节固定化酶 ?固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 ?酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的特点（与游离酶相比） ?（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化； ?（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化； ?（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ?（4）酶的反应过程能够严格控制； ?（5）酶的利用率提高，生产成本降低； ?（6）能够进行多酶反应； ?（7）可以增加产物收率，提高产物的质量； ?（8）增加了生产的成本； ?（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。
一、固定化酶的制备方法 ?根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则： –（1）必须维持酶的催化活性以及专一性； –（2）有利于实现连续化和自动化； –（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量； –（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用； –（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应； –（6）成本要低，以便于工业使用；
实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。?（一）包埋法： –1、网格型 –2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法?（二）吸附法： –1、物理吸附法 –2、离子吸附法 ?（三）、共价偶联法 ?（四）、交联法 ?（五）、共价结合法 –1、结晶法 –2、分散法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
第五章酶与细胞固定化技术 教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。 教学办法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺陷办法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。 2、固定化细胞（原生质体）
指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。 四、固定化酶长处 增长了酶稳定性 能减少酶总体费用 酶分离和回收变得容易，并可重复使用 使反映过程持续操作成为也许 反映产物也易于提取纯化 有助于过程设计和优化 拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化办法 一、酶固定化办法 1、酶固定化办法（四大类办法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其他（酶逆胶束包囊法） 一、酶固定化办法 2、选取办法根据： ⑴酶性质 ⑵载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等 ⑶制备办法简便易行 ⒊衡量根据： ⑴测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率；
酵母细胞的固定化练习题 1．下图所示的固定化方式中，适宜固定化酶的是() A．①②③B．①②C．②③D．①③ 2．在制备固定化酵母细胞的实验中，CaCl2溶液的作用是() A．用于调节溶液pH B．用于进行离子交换 C．用于胶体聚沉D．用于为酵母菌提供Ca2＋ 3．制备好的凝胶珠是否符合应用要求，常用的检测方法有() ①挤压法②摔打法③观察法④培养法 A．①②④B．①③④ C．②③④D．①②③ 4．关于固定化酶中酶的说法，正确的是() A．酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应 B．酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用 C．酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去D．固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点5．下列关于配制海藻酸钠溶液的措施，正确的是() A．用酒精灯加热，加热时不能搅拌 B．由于海藻酸钠溶解速度快，所以不用加热 C．海藻酸钠在水中溶解的速度慢，需用酒精喷灯加热 D．采用小火或间断加热，促进溶解，防止发生焦糊 6．下列属于固定化酶应用特点的是() ①可以被反复使用②有利于酶与产物分离③能自由出入载体④一种固定化酶只催化一种酶促反应⑤酶多用包埋法固定化 A．①②③B．③⑤C．①②④D．①②⑤ 7．某校学生尝试用琼脂作载体，用包埋法固定α-淀粉酶来探究固定化酶的催化效果。实验结果见表(假设加入试管中的固定化淀粉酶量与普通α-淀粉酶量相
同)。实验表明l号试管中淀粉未被水解，你认为最可能的原因是() 比较项目1号试管2号试管 固定化淀粉酶√ 普通α-淀粉酶√ 淀粉溶液√√ 60 ℃保温5分钟，取出冷却至室温，滴加碘液 现象变蓝不变蓝 B．淀粉是大分子物质，难以通过琼脂与淀粉酶接触 C．水浴保温时间过短，固定化淀粉酶未将淀粉水解 D．实验程序出现错误，试管中应先加入碘液后保温 8．如图为固定化酵母细胞及其应用的相关图解，请据图回答问题： (1)某生物小组利用海藻酸钠制备固定化酵母细胞，应使用图甲中的方法[]__________(填号码及名称)，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是________________________。 (2)部分同学制得的凝胶珠如图乙所示，其原因可能是________________、________________等。观察形成的凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明________________。
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
第五章酶与细胞的固定化技术 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法
3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。 2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用； 缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的. 4、常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。 5、举例： 将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。 （二）包埋法 1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法 （网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高； 缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。 3、海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒
β-半乳糖苷酶的固定化及其应用 摘要： β-半乳糖苷酶是一种来源广泛且具有多种用途的酶。开发理想的载体是固定化研究的重要课题之一。本文对乳糖酶为性质、应用及固定化方面的研究进行了综述。 Immobilization and Application of β-galactosidase Abstract: β- galactosidase is a enzyme that source are abroad and was used in many filed. DeveloPing an ideal carrier one of the important topics of immobilization study. This paper reviewed the property, application and immobilization of lactase. 关键字：β-半乳糖苷酶；应用；固定化 乳糖酶(Lactase)的系统名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactoside galcagal-cato-hydrolase， EC.3.2.1.23)，或称β-半乳糖苷酶(β-galactosidaes)，乳糖酶为其商品名。广泛存在于各种动物、植物及微生物中。β-半乳糖苷酶能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键发生水解反应，将一分子乳糖水解成一分子葡萄糖和一分子半乳糖；另外乳糖酶还能还能通过转糖苷作用合成低聚半乳糖(简称GOS)。GOS能有效促进双歧杆菌增殖、分解致癌物质、改善便秘、降低血糖、抗龋齿、促进钙吸收和维生素合成等，近年来备受关注[1]。国外对β-半乳糖苷酶的研究较早，多集中在食品加工应用方面。1889年，荷兰生物学家Beijerincek第一次报道了β-半乳糖苷酶可水解乳糖[2]。β-半乳糖苷酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。利用各种技术手段研究β-半乳糖苷酶对牛乳中乳糖的水解作用，对改善乳糖不耐症，充分发挥牛乳的保健作用和发展乳制品工业具有一定的现实意义。 1、β-半乳糖苷酶的性质及不同来源的 1.1β-半乳糖苷酶的作用机制 wallneefls等人研究表明，利用尽半乳糖苷酶水解乳糖，最少包括三个步骤，最后一步呈现水解或转移活性。步骤如下: （1）酶 + 乳糖 --→酶-乳糖；
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
中华人民共和国专业标准 蛋白酶活力测定法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)4 2.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10 mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使 用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃管号 试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━