酶的固定化的方案
一、材料和方法
1.实验材料及试剂
酶，25%戊二醛溶液，带氨基的载体，考马斯亮蓝，牛血清白蛋白。
2. 主要实验仪器
紫外可见光分光光度计Uv-1800，THZ一C恒温振荡器，MD200一3型电子天平PHS一3C酸度计
3.酶的固定化方法
1）载体的活化
a 对所得的载体表面带有大量的氨基，对其进行活化处理可用于酶蛋白的共价结合。采用戊二醛为活化试剂，使凝胶表面连接上游离的醛基。具体方法为:将lg带氨基的载体颗粒臵于3ml、10%的戊二醛溶液中振荡24h，然后真空过滤。所得固体用去离子水洗涤多次，干燥后即为戊二醛活化的树脂颗粒。
b大孔树脂预处理方法：称取10g树脂于锥形瓶中，用95%的乙醇浸泡24h，真空抽滤，用1L蒸馏水冲洗。树脂依次用25mL的5%HCl和5%NaOH溶液浸泡4h后抽滤，用蒸馏水洗至中性。抽滤后臵于4℃冰箱中干燥4h，室温保存备用。
举例：称取适量经预处理的大孔树脂于50mL锥形瓶中，加入适量磷酸缓冲液（pH7.5，0.05mol/L）和适量的酶，臵于恒温水浴振荡器中吸附一定时间后（37℃，150r/min）真空抽滤，并用100mL缓冲液冲洗载体，抽干后臵于4℃冰箱中干燥4h，并于4℃冰箱中密封保存。
2）固定化方法
a 共价结合法
准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后离心收集固体，用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
b 酶聚集体包被法
准确称量20g戊二醛活化的树脂颗粒臵于50ml的离心管中，向其中加入体积为2ml的一定浓度的酶液(酶粉溶于pH7.0、0.03M的磷酸缓冲液)。然后于冰浴中缓慢振荡24h。之后向混合液中加入0.5ml、2%的戊二醛溶液，继续振荡10h，离心收集固体。最后用相同的磷酸缓冲液洗涤固体5次以上。
c.酶活性的测定
d. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
固定化时溶液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定：
考马斯亮蓝试剂的配制：将考马斯亮蓝 G-250 100mg 溶于 50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000mL。
标准蛋白溶液的配制：以牛血清白蛋白为标准蛋白，用蒸馏水配臵成0.1mg/mL 的蛋白溶液。
制作标准曲线：分别取 0.0-1.0mL 的标准蛋白溶液于试管中，用蒸馏水加至 1mL，然后加入考马斯亮蓝试剂 5mL，摇匀，放臵 5min 后用分光光度计在 595nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标绘制标准曲线
样品测定：取样品溶液 1mL，样品蛋白质含量高时，可将取样量减少，并有蒸馏水补至 1mL。加入考马斯亮蓝试剂 5mL，摇匀，放臵 5min 后用分光光度计在 595nm处测定吸光度。根据标准曲线计算出样品溶液的蛋白质含量。
二、固定化工艺条件的选择
(1) 固定化温度的选择
将 0.50g载体，600μL酶和 10mL缓冲液(pH7.5)混合后分别在 25、30、37、45、55℃下固定5h，测定各温度下脂肪酶的固定化率和相对酶活力。因为较高温度下蛋白分子运动加剧，减小了酶的扩散限制作用，使酶分子能更快扩散进入载体的孔道内并与载体发生相互作用，加快固定化。但高温会破坏蛋白质的结构，导致酶因热变性而失活。
(2) 固定化ph值的选择
将 0.50g载体，600μL酶分别和pH为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0 的 10mL缓冲液混合后在 30℃下固定 5h，并测定各pH 值条件下的固定化率和相对酶活力。缓冲液的pH值会影响酶分子周围的离子微环境，从而影响固定化酶的活力，在特定的pH值条件下，酶分子的活性基团能处于最佳的离子状态，从而使酶显示出较高的活力。
(3) 固定化时间的选择
将 0.50g载体，600μL酶和 10mL缓冲液(pH4.0）混合后在 30℃下分别固定 1、2、3、4、5、7h，测定不同吸附时间下的固定化率和相对酶活力。随着吸附时间的延长，载体的固定化率在增大，在 h后基本达到平衡，吸附刚开始时，载体上的吸附位点很多，传质的驱动力大，吸附迅速。吸附时间超过后，相对酶活力开始下降，因为酶分子在载体上开始积聚，影响了酶分子的扩散，降低了暴露的活性位点数量，且酶在长时间的振摇过程中部分酶会失活，因此选择 h为最佳吸附时间。
（4）固定化酶的添加量的选择
研究酶添加量(用蛋白含量计算，酶液的蛋白含量为 4mg/mL)与载体的比例为 4、6、8、10、12、16、20、24mg/g时的固定化率和相对酶活力。pH4.0，30℃下固定 h。随着酶加入量的增多，相对酶活力增大，但是固定化率和酶活回收率都在下降。当酶添加量较小时，载体吸附的酶量少，酶可以更加分散，增大它与底物接触的比表面积，活性部位更加暴露，提高反应效率，但当酶加入量大时，载体上吸附的酶增多，空间位阻增大，影响酶活性中心和底物的接触，从而降低了反应效率，导致相对酶活力和酶活回收率下降，因此研究选择酶与载体比例为 mg/g作为最优的酶添加量。
（5）交联剂-戊二醛对固定化酶的影响
在酶被载体吸附后，再加入交联剂，使酶分子之间发生交联，达到更好的固定效果。考察戊二醛在不同浓度（0、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%下对酶固定的效果影响。低浓度戊二醛（＜0.025%）的加入可以增加酶的固定化率，这是因为交联剂的加入可以使酶分子相互交联，使载体孔道内的酶分子增加。但是固定化酶活力却随着戊二醛浓度的增加而下降，这是因为酶分子发生交联后，使载体内孔径变小，增强了底物和产物的扩散限制作用而且戊二醛本身就是一种变性剂，所以当戊二醛加入量增大时，酶活急剧下降。因此后续实验不加入交联剂。
三、固定化酶的酶学特性
1.固定化酶的最适温度
在不同的反应温度(20℃一80℃)下进行试验，分别测定自制固定化酶、游离酶的活力，根据结果得到最适温度。
2固定化酶的最适pH
在不同pH值的缓冲液中进行试验，分别测定自制固定化酶、游离酶的活力，根据结果判定最适pH值。
3固定化酶的热稳定性
在不同温度的水浴中将自制固定化酶、游离酶保温 h后，立即臵于4℃冰浴中冷却，测定剩余酶活，根据结果判定其热稳定性。
4固定化酶的pH稳定性
将自制固定化酶、游离酶臵于不同pH值的缓冲液中，4℃放臵 h，测定剩余酶活，根据结果判定其pH稳定性。
5固定化酶的重复使用性
称取一定量的自制固定化酶，在相同的条件下，进行多次试验，测定其剩余酶活，考察重复使用性。
一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶 1、固定化载体的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。 2、载体选择 取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。 ３、固定化条件的优化 取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。 4、蛋白质含量测定 采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。 5、酶活收率 指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。 6、酶活测定 以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在
60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。 二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶 1、固定化载体及其预处理 选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290 和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。 2、脂肪酶的固定化 采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环
酶固定化技术及其应用 摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并且迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。 关键词：酶固定化；载体；应用 The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly. This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme technology application. 一、前言 酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，与化学催化剂相比具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强,可在水溶液和中性pH 下操作等优点。但其 高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素均可使没丧失活力。 而且，随着反应过程的进行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产 物在一起，反应后酶不能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以 上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得 方法十分迫切。 可喜的是，经过专家学者的不断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍能与底物有效的进行反应。这中酶的出现，使得酶与产物在反应液中相互分离，具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。 酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作 用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重 要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研 究新进展。 二、传统酶固定化技术
酶固定化一般方法及载体特性 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
实验六十二固定化酶制备及酶活力测定 实验项目性质：综合性 所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定 计划学时：6学时 一、实验目的 1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。 2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 二、实验原理 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。 酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。 载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。 交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。 包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
酶的固定化技术 摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。 关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞 Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future. Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell 前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。
酶工程课程论文 题目：酶的固定化技术及其应用 学院：食品学院 专业：食品科学与工程 班级：食品101（35） 2012-11-21
酶的固定化技术及其应用 摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。并对其研究的前景进行了简洁的预测。 关键字：酶固定化技术应用 酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。 固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。 用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶细胞或 细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应．由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术． 固定化细胞的优点是： (1)省去了酶分离纯化的时间和费用； (2)可进行多酶反应； (3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性． 但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足 之处： (1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代 谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低； (2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤 其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别 明显： (3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相 应的固定化酶活性低．
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
固定化酶制备及酶活力测定 实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青 实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20 实验指导：易喻 摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。 关键词：固定化酶酶活力包埋法 Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity. 前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 正文： 1.实验过程 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 ①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂
固定化酶技术与应用 姓名：高强 专业：生物科学 学号：2004083011 日期：2013年5月
固定化酶技术及应用 摘要：近年来由于固定化酶技术的发展，对固定化酶载体的研究非常活跃。本文对固定化酶载体,固定化酶的应用生产,酶传感器，固定化细胞技术进行简单介绍。 关键词：固定化酶载体应用固定化细胞 引言 固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物。1971年第一届国际酶工程会议上正式建议采用“固定化酶”的名称。所谓固定化酶，即在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶属于修饰酶，其具有以下优点：1极易将固定化酶与底物，产物分开；2可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；3在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；4反应过程能够加以严格控制；5产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；6较游离酶更适合于多酶反应；7可以增加产物的收率，提高产物的质量；8酶的使用效率提高，成本降低。鉴于固定化酶的优点，本文从固定化酶载体的研究进展,固定化酶的应用，固定化酶的生产，在食品加工中的使用，固定化细胞技术等方面进行介绍。 固定化酶载体研究进展 载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。酶蛋白的活性中心是酶催化活性所必需的，酶蛋白的空间结构也与酶活力密切相关，因而．在固定化的过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响．而且要避免酶蛋白高级结构的破坏[1]。 甲壳素及壳聚糖作为载体的固定化方法报道较多的有吸附法、通过双功能试剂交联的共价结合法。目前，使用较多的是用戊二醛作交联剂的共价结合法。载体的形态有片状、球状、膜状、无定形等。1982年．John Wiley 利用甲壳素、壳聚糖的吸附作用固定化胰蛋白酶，把甲壳素、壳聚糖固态混合研磨40h，加入粉末状胰蛋白酶混合研磨进行固定化，另一对照样加入酶液进行固定化。结果表明胰蛋白酶以粉末状进行固定化时效果更好，且研磨时间越长，固定化效果越好。得出结论：甲壳素、壳聚糖表面积的增加有利于胰蛋白酶的固定化溶液酶在数天内几乎失去全部活力，而固定化酶在室温或高于室温的条件下仍保持其活力。 纳米粒子作为酶固定化的载体，当其具有磁性时，制备的固定化酶易从反应体系中分离和回收，操作简便；并且利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。在众多纳米材料中，氧化铁因其在磁性、催化等多方面的良好特性而备受瞩目[2]。 微胶囊是一种采用高分子聚合物或其他成膜材料将物质的微粒或微滴包覆所形成的微小容器，其粒径一般在微米至毫米级范围，通常为5～400μm。将酶用微胶囊包覆后形成的微胶囊固定化酶，由于被催化物质和产物可自由通过囊壁,因而能起到酶催化剂的作用[3]。酶经过微胶囊固化后,还使酶具有如下的优点：①提高了酶的稳定性,使其可以在恶劣的条件下存活。微胶囊囊壁可将对酶活性和稳定性有影响的抑制因子、有害因子等排除在外，同时还可与一定量的稳定剂、整合剂等一起包埋，进一步增加其耐极端条件的能力；②通过选择合适的胶囊，可控制酶的释放时间。这对于多阶段加工过程中酶的活力要在后一阶段发挥的情况
酶的固定化技术、现状及发展趋势 酶的固定化 固定化酶是20世纪60年代开始发展起来的一项新技术最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物, 所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”但后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中, 高分子底物与酶在超滤膜一边, 而反应产物可以透过膜逸出, 在这种情况下, 酶本身仍是可溶的因此, 用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了在年第一届国际酶工程会议上, 正式建议采用“固定化酶”的名称。所谓的固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用的，并能反复和连续使用的酶。固化酶的出现，解决了酶在工程化应用中存在的问题。极大地提高了酶的应用价值。 酶的本质是蛋白质，酶的固定化实质是具有催化活性的蛋白质的固定。没的催化活性主要依靠他的特殊的高级结构——活性中心。当高级结构或活性中心发生变化时，酶的催化活性便下降，底物的特异性也可能发生变化，因此制备固定化酶时必须严格操作条件，尽可能避免酶的高级结构受到损害。 酶的固定化方法很多，主要分 为四类：即吸附法、包埋法、共价 结合法、交联法等。吸附法和共价 结合法又可称为载体结合法。 1、包埋法： 包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中这样可以防止酶蛋白释放, 但是底物仍能渗人格子内与酶相接触此法较为简便, 酶分子仅仅是被包埋起来, 生物活性破坏少, 但此法对大分子底物不适用 （1）凝胶包埋。凝胶包埋法是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法交联聚丙烯酞胺凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术。用此法固定了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、β一淀粉酶用此方法后来又固定了过氧化氢酶、胰凝乳蛋白酶、β一葡萄糖苷酶，近年又有人使用天然材料如藻酸盐和卡拉胶进行包埋。 （2）微胶囊包埋将酶包埋于半透性聚合体膜内, 形成直径为1~100μm的微囊这种固定化酶是以物理方法包埋在膜内的, 只要底物和产物分子大小能够通过半透膜, 底物和产物分子就能 够以自由扩散的方式通过膜。 2、吸附法： 吸附法吸附固定是最简单的方法, 酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键此方法又可分为物理吸附法和离子吸附法 （1）物理吸附法,使用对蛋白质具有高度吸附能力的非水溶性载体, 如活性碳、几丁质、多孔玻璃等作为吸附剂, 将酶吸附到表面上使酶固定化这种方法操作简单, 反应条件温和, 载体 可反复使用, 但结合不牢固, 酶易脱落。
2002年12月天津大学学生学报第六卷第2期Dec.2002 S tudent’s Journal Of Tianjin University Vol.6 No.2 酶的溶胶凝胶固定化技术 陈岩 摘要酶的溶胶——凝胶固定化技术以其温和的反应条件，较好的酶活收率而受到日益广泛的关注。本文概括介绍了这种酶固定化技术的过程，条件及优点。 关键词溶胶——凝胶固定化酶 Eneyme is Imnmbilized by Sol-Gel Chen Yan Abstract Eneyme is imnmbilized by sol-gel is kind for the facik neaction condition moneoner．The activity Heneymes is aways rerernecl．The process thectian condition and adventepes of sol-qel technique and neproted in this paper． Keywords sol-gel，immobilizatien，enzyme 酶作为一种天然高活性，高选择性的催化剂，使许多难以进行的有机化学反应在酶的催化下能顺利进行，而且避免或减少副反应的发生。更重要的，无污染物质产生，属于绿色催化剂，酶以其如此之多的优点，近年来倍受化学工作者的青睐。但是目前认为酶是一种蛋白质，稳性较差。在过热，强酸，强碱，有机溶剂等条件下，都能发生蛋白质的变性，使酶失去催化效能。即使在最佳酶反应条件下，也往往会很快失活，且酶在反应后，也不能回收，造成重大浪费（难以回收）。目前常用的固定方法分为三类[4]：（1）吸附法，它是最简单的方法，适用于各种试剂，但由于试剂与基质之间的作用力较弱，被吸附的试剂容易洗脱，此点也就限制了催化剂的寿命应用性；（2）共价键合法，此法固定的试剂一般比吸附法寿命长，但用此法固定试剂较复杂和费时，有时由于被固定的试剂与基质形成的共价键使试剂的自由度减少而导致试剂的响应降低；（3）包埋法，试剂被物理的包裹在多孔的机制中，方法简单且适合各种试剂，只要控制适当的包埋步骤，此法固定的试剂不会洗脱或洗脱很慢。 于是酶的固定化技术便成为人们关注的焦点。也是本实验的重点。根据实验要求，酶固定化之后必须满足以下条件[1]： 1．固定化之后的酶仍能维持良好的生物活性和反应专一性；
1.2 脂肪酶的研究与应用 1.2.1 脂肪酶的研究概况 脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。 作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。 1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制 脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(?-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。脂肪酶是一种很有前途的富集催化剂，但脂肪酶的脂肪酸特异性较差。 在脂肪酶催化酯键水解的过程中，活性酶的构象和四面体跃迁态的稳定都是至关重要的。利用蛋白酶定点突变实验的x射线结构数据和结果已被用作预测可
第4节固定化酶的制备和应用 课时过关·能力提升 一、基础巩固 1.酶制剂、固定化酶已经广泛地应用于各个领域,下列有关叙述错误的是( ) A.用乳糖酶分解乳糖,可以提高牛奶的可消化性 B.制备固定化酶的常见方法之一是凝胶包埋法 C.固定化酶固定时可能会造成酶的损伤而影响活性 D.检测牛奶中乳糖的分解时需用双缩脲试剂 答案:D 解析:检测牛奶中乳糖的分解时应用斐林试剂。 2.下列不属于固定化酶在利用时的特点的是( ) A.有利于酶与产物分离 B.可以被反复利用 C.能自由出入依附的载体 D.一种固定化酶一般情况下不能催化一系列酶促反应 答案:C 解析:固定化酶在利用时被固定在一定的空间内,不能自由出入。 3.下列关于固定化酶技术的叙述,正确的是( ) A.固定化酶技术就是固定反应物,使酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B.固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C.固定化酶中的酶无法重复利用 D.固定化酶技术是将酶固定在一定空间内的技术 答案:D 解析:固定化酶技术是利用物理或化学的方法将酶固定在一定空间内的技术,其优点是酶被固定在一定装置内可重复利用,不足是无法同时催化一系列酶促反应。 4.研究认为,用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌中得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂,可用于降解残留在土壤中的有机磷农药,与用微生物降解相比,其起作用不需要适宜的( ) A.温度 B.pH C.水分 D.营养 答案:D 解析:固定化酶与微生物相比较,它的活性发挥不需要营养。 5.下列有关酶的制备和应用的叙述,正确的是( ) A.酶解法和吸水涨破法常用于制备微生物的胞内酶 B.透析和酸解等方法常用于酶的分离与纯化 C.蚕丝织物能使用添加蛋白酶的洗衣粉进行洗涤 D.多酶片中的胃蛋白酶位于片剂的核心层 答案:A 解析:酸解法不能用于酶的分离与纯化。多酶片中的胃蛋白酶应位于片剂的最表层。 二、能力提升 6.固定化酶的优点是( ) A.有利于增加酶的活力 B.有利于产物的纯化 C.有利于提高反应速度 D.有利于酶发挥作用 答案:B 解析:固定化酶将酶固定在载体上,使酶与反应物分开,大大提高了产物的纯度。 7.在乳糖酶固定化过程中,要用N,N-甲叉双丙烯酰胺 (Bis),其作用是( ) A.调节酸碱度 B.与酶交联 C.增强酶的活力 D.消毒
酶固定化技术研究进展 选题说明 酶作为一种生物催化剂，具有高催化效率，高选择性，催化反应条件温和，清洁无污染等特点，其卓越的催化效能，令普通无机催化剂难以望其项背，因此酶的工业化使用一直是广受社会关注的课题，但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及其一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本，严重限制了酶的工业推广。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近些年酶工程研究的重点。酶的固定化，是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。通过固定化，可以解决天然酶的局限性，实现酶的广泛运用。 基于对于酶的工业化使用和固定化酶的兴趣，我通过互联网和数据库信息检索的方式对酶的固定化技术发展状况进行了初步探索，并对目前的研究成果进行了简要的概括。希望能使大家对这一领域有所认识。 检索过程说明 1，检索工具和数据库 1.1，百度搜索引擎 1.2，Google搜索引擎 1.3，中国期刊全文数据库 1.4，万方数据系统 1.5，重庆维普中文科技期刊数据库 2，检索过程简述
首先，我选择了使用百度和Google搜索引擎进行关键词检索，都得到了浩繁的搜索结果，所的信息主要是百科简介和企业广告信息，介绍较为浅显陈旧，可利用性较差，但可以用于简单的信息了解，在搜素过程中，尝试使用了布尔检索规则如“固定化酶and应用”、高级检索和结果中检索的检索方式，以减小数据量。也尝试了Google学术搜索，得到了很多有用信息。运用维普中文科技期刊数据库搜素“题名或关键词”为“固定化酶”的相关资料得到655条，搜素“题名或关键词”为“固定化酶应用”的相关资料得到72条，检索关键词搜素“题名或关键词”为“固定化酶研究”的相关资料得到4条. 万方数据系统搜索主题词"固定化酶",得到相关资料1024条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料23条.。中国期刊全文数据库中检索“固定化酶技术”得到相关资料2604条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料742条 关键词 酶固定化载体制备研究应用 酶固定化技术研究进展 提要： 固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术。目前已得到长足的发展。本文重点介绍了固定化酶制备的传统方法和近些年出现的一些新方法，同时对酶在一些性能优良的栽体上的固定进行了综述。 正文： 一，传统的酶固定化方法
制备和应用固定化酶 （2012上海）9．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有 A．热稳定性 B．催化高效性 C．催化特异性 D．可反复使用性 【答案】D 【解析】固定化酶指通过物理或化学的方法，将水溶性酶与非水溶性载体结合，既能与反应物接触又能与产物分离，与直接使用酶相比，除催化效率高、特异性强外，还可反复使用酶；酶的热稳定性一般都不强。故D正确。 【试题点评】本题考查了固定化酶与直接使用酶的区别及酶的特性，重点在于理解两者的区别，找出固定化酶依据的基本原理，难度中等。 （2012江苏）17.下列关于酶和固定化酵母细胞的研究与应用的叙述，错误 ．．的是（） A.从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小 B. 作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药 C. 尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用 D.将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌 【答案】C 【解析】化学结合法可能影响酶的活性部位而影响反应效果，而吸附法是物理方法不影响酶的分子结构，A正确；消化酶在消化道内起作用，B正确；尿糖试纸由于使用后不能将反应物和酶分开，而不能再次使用，C错；固定化酵母细胞在凝胶珠中，用无菌水冲洗可洗去CaCl2和表面的杂菌，D正确【试题点评】本题考查酶的应用，涉及固定化酶中的原理、操作和应用等知识。属于了解层次。 （2011上海）38．通过酶工程可将联苯水解酶用于生产实践。酶工程通常包括酶的生产、＿＿＿＿＿＿＿、酶的固定化和酶的应用等方面。酶固定化的好处是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。【答案】酶的分离纯化便于重复利用能连续进行反应 （2010山东）34. 【生物—生物技术实践】生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化石燃料的消耗，科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油（如下图）。
酶的固定化技术及其应用 曾鸿雁 (西南科技大学,四川,绵阳) 摘要:随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶在各个领域的广泛应用，对酶的要求也越来越严格。本文针对目前酶工程技术之一酶的固定化，对酶的固定化技术及其展望做一综述。 关键词：酶，固定化，技术 Immobilization of Enzyme And its Applications Abstract：with the continuous development of biotechnology industrial and enzyme engineering , enzyme are widely used in various fields and the requirements to enzymes also become more and more stringent . This article is to review the enzyme immobilization, which is one of the current enzyme engineering technologies Key words: enzyme, immobilization, technology 一、引言 酶是一类具有生物催化性质的高分子物质，其催化性具有专一性强、催化效率高和作用脚尖温和等特点。但是在实际工业生产中，由于实际环境因素，应用酶的过程出现了一些不足之处：①酶的催化效率不高。人们在使用酶的过程中，往往要求酶的催化效率要足够高，以加快反应速度，提高劳动生产率，然而实际上很多酶的催化效率不够高而难于满足人们的使用要求。 ②酶的稳定性较差。大多数酶稳定性较差，在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素的影响下，都容易变形失活。③酶的一次性使用。酶一般是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混合在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且也难于连续生产。④产物的分离纯化比较困难。酶反应后成为杂志与产物混在一起，无疑给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。为此，人们开始针对酶的这些不足寻求改善方法，方法之一就是酶的固定化。 固定化酶是20世纪60年代开始发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾称为“水不溶酶”和“固相酶”。但后来发现也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍是可溶的。因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”(immobilized enzyme)的名称。所谓固定化酶是指固定在一定载体上并有一定的空间范围内进行催化反应的酶。 固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有提高酶的催化效率、增加稳定性、可反复或连续使用以及易于和反应物分开的显著优点。 二、酶的固定化技术 采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程成为酶的固定化
固定化酶的制备及应用 徐玉尚 08生工（2） 20080804243 摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。本文主要从传统固定化酶技术以及新型固定化酶技术两大方面介绍了固定化酶的制备方法。另外，又对固定化酶在医药、食品、环保、生物传感器、能源五大方面的应用作了综述。本文旨在进一步研究固定化酶的制备方法以及探究固定化酶在多个领域的应用。 关键词：固定化酶；制备；载体；应用 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利 用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性 的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。现今，固定化酶的制备方法已由传统走向新型，并在多个领域有重要应用[1]。 1固定化酶的传统制备方法 1.1吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面[2]。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 (1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 (2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般