第三章病毒的复制
第一节研究病毒复制的一般性方法
1.1建立病毒复制的实验研究系统
研究病毒的常用培养系统
①噬菌体——细胞培养系统
用该系统研究噬菌体复制的优点：
敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制；
噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察；
噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。
噬菌体同步感染敏感的细菌培养物—建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。
②动物病毒—动物细胞培养系统
目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。
在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。
③植物病毒—原生质体培养系统
高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。
植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。
采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。
无论是哪种培养系统，都要考虑：
①宿主细胞的敏感性与生理状态
②注意感染复数病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。
感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell）
1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律）
以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒－细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期：①潜伏期②突破期③平稳期
潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期)
潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间
隐蔽期：病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间
（1）潜伏期，这一时期几乎没有形成噬菌斑，进入裂解期后就形成了噬菌斑，也就是有新的病毒粒子释放出来了，因此潜伏期是指病毒吸附于细胞到受染细胞释放出子代病毒所需的最短时间。不同病毒潜伏期长短不一，噬菌体一般有几分钟，动物病毒和植物病毒以小时或天计。
（2）裂解期：在潜伏期后，病毒效价急剧增加，这是新合成的病毒核酸和蛋白质装配成大量病毒粒子，并释放的结果。潜伏期后宿主细胞裂解释放出大量子代病毒的时期称为裂解期或成熟期。
这一点跟细菌的生长曲线不同，细菌的生长曲线中的延滞期是为分裂做准备，对数期是大量繁殖的时期，而病毒一步生长曲线中的裂解期则是病毒大量释放的时期，而不是繁殖（即复制）的时期（复制过程实际上是在潜伏期完成的）。
（3）稳定期：裂解期末，受染细胞将子代病毒粒子全部释放出来，病毒效价稳定在最高处的时期，称为稳定期，即病毒粒子已经全部释放，没有新的病毒粒子释放了，所以形成的噬菌斑数量保持不变，不会下降，因此不会像细菌的生长曲线那样有衰亡期。
一步生长曲线的意义：
（1）可获知潜伏期和裂解期。
（2）可获知裂解量：每一受感染细胞所产生的子代病毒粒子的平均数。
稳定期的病毒粒子数目
裂解量= ————————————
潜伏期受感染细胞的数目
第二节病毒的复制周期
病毒增殖（multiplication）只在活细胞内进行，以病毒基因为模板，在酶作用下，分别合成其基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称复制。
从病毒进入宿主细胞开始，经过基因复制，到最后释放出子代病毒，称为一个复制周期。病毒的复制周期依次包括吸附，穿入，脱壳，生物合成及组装，成熟和释放。
2.1吸附（adsorption）
病毒附着于敏感细胞的表面，细胞表面能吸附病毒的物质结构称为病毒受体。
敏感的宿主细胞是病毒复制的第一阶段。该过程包含静电吸附及特异性受体吸附两阶段。细胞及病毒颗粒表面都带负电荷，Ca2+、Mg2+等阳离子能降低负电荷，促进静电吸附。静电吸附是可逆的，非特异的。
可逆性吸附：又称为静电吸附，指病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆的，是由随机碰撞、布朗运动、静电引力引起，其他的粒子也可以发生这种吸附，如灰尘的吸附等。
不可逆吸附：又称为真正的吸附，指病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。如噬菌体通过尾丝与细菌表面的受体结合，再如流感病毒通过HA（血凝素蛋白）与宿主细胞表面的唾液酸受体结合。
吸附类型的转变：
一般情况下病毒与宿主细胞通过不可逆吸附后即发生侵入过程，但有时也会由不可逆吸附变为可逆性吸附，这个过程主要取决于三方面的条件，即病毒吸附蛋白、病毒的细胞受体和环境因素。
病毒吸附蛋白：能够识别细胞表面特异性受体的病毒体表面结构蛋白称为病毒吸附蛋白
（VAP）(virus attachment protein,BAP)。它决定了病毒与敏感的细胞表面受体的特异性结合。吸附后病毒粒子或病毒核酸能进入宿主细胞中。
实例：如：T－偶数噬菌体的吸附蛋白→噬菌体尾丝蛋白。有包膜的动物病毒的吸附蛋白是包膜上的糖蛋白突起（流感病毒→血凝素糖蛋白）；无包膜的动物病毒腺病毒的吸附蛋白是二十面体壳体上的五邻纤维。
病毒的细胞受体：
能被病毒吸附蛋白识别，是启动感染发生的特殊细胞位点。它在很大程度上决定了病毒的宿主范围、组织亲和性，并影响病毒的致病性（不同的宿主上有不同的受体，不同的细胞上也有不同的受体）。
病毒受体可分为细胞受体单位和细胞受体位点
细胞受体单位（cellular receptor unit）：是指能够识别一个病毒吸附蛋白的细胞分子。通常由几个亚基单位构成，其活性依赖于分子的空间结构。
细胞受体位点（cellular receptor site）：是指由一个或几个受体单位组成，并能有效地结合一个病毒粒子的细胞表面结构。
具有种系特异性。一些不同种系动物的细胞存在不同的病毒受体。如多瘤病毒受体只存在于小鼠细胞上。
具有组织特异性。动物不同组织细胞上存在不同的病毒受体，从而决定了病毒的组织嗜亲性。如HIV可感染具有CD4抗原的T辅助性淋巴细胞，单核巨噬细胞。而不能感染其他细胞。实例：①细菌病毒：大多数噬菌体的细胞受体在细菌的细胞壁上，如LPS、脂蛋白、蛋白质等。噬菌体的细胞受体特异性很强，因此噬菌体的专一性很强。
②动物病毒：多数动物病毒的细胞受体单位是镶嵌在细胞质脂双层之间的糖蛋白，即细胞膜上的糖蛋白。
植物病毒没有吸附这一步，因此没有细胞受体，其感染是通过昆虫的刺入或者胞间连丝完成的。
③病毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制
毒吸附蛋白与细胞受体结合的机制：氢键、离子间静电引力、范德华力等
可逆性吸附：只是静电引力引起，无化学键结合，易受pH影响
不可逆性吸附：病毒吸附蛋白与细胞表面受体形成牢固的化学键
植物病毒迄今尚未发现有特异性细胞受体，其病毒进入植物的机制是通过伤口或媒介昆虫传播的。
④病毒外壳蛋白与寄主细胞受体之间的关系
植物病毒不表现出外壳蛋白与寄主细胞表面受体之间的特异性
1把不能侵染番茄的TMV株系的RNA包上一个能侵染番茄的TMV株系的外壳，所得杂种仍不能侵染番茄。单独用不能侵染番茄的TMV毒株的RNA来接种也不能侵染番茄。反过来，能侵染番茄的RNA和不能侵染番茄的外壳装配成的病毒仍然可以侵染番茄。
2用体外装配的方法把脊髓灰质炎病毒的RNA包上另一种同属肠道病毒组能侵染小鼠细胞的柯萨奇病毒的蛋白质衣壳，这种体外装配的杂种病毒就能侵染原来脊髓灰质炎病毒不能侵染的小鼠细胞。
⑤环境因素
（1）温度：在一定范围内，病毒的吸附速率与温度成正比，例如：脊髓灰质炎病毒在1℃的吸附率仅是37℃的十分之一。
（2）离子环境：在一定浓度的阳离子存在的条件下，能够促进病毒对细胞的吸附（二价阳离子能促进噬菌体的吸附）。螯合剂可抑制吸附。
（3）pH：不同的病毒－－细胞系统吸附反应的最适pH有很大的不同。例如：腺病毒T
型与红细胞结合的最适pH是5.5～8.7；而柯萨奇病毒B4吸附HeLa细胞的最适pH是3.0～3.5。
2.2侵入（penetration）
病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的细胞内期。
侵入是病毒感染的第二阶段。主要的方式有：
①注射式侵入：是有尾噬菌体的侵入方式。
T偶数噬菌体的尾丝与细胞表面受体结合→尾鞘蛋白收缩使基板上升→尾管在尾部溶菌酶的作用下插入细菌细胞壁→噬菌体头部的dsDNA分子通过尾管注入细胞
大肠杆菌雄性菌株的丝杆状噬菌体也采取注射侵入细胞
②细胞内吞——是病毒穿入细胞的常见方式
细胞内吞：是种常见的动物病毒的侵入方式，如：流感病毒、痘病毒、多瘤病毒等。
细胞膜将病毒粒子包裹→膜内陷形成吞噬泡使病毒粒子进入细胞质→与细胞器（如溶酶体）等的内膜融合→释放病毒粒子
③膜融合——常见包膜病毒
膜融合：病毒包膜与细胞膜的融合过程，主要是有包膜的病毒的侵入方式。
④直接侵入——常见无包膜病毒
病毒直接侵入的方式分为三种类型。
部分病毒粒子直接侵入细胞，如脊髓灰质炎病毒、腺病毒
许多无包膜病毒通过吸附蛋白与细胞受体结合后，宿主细胞膜的流动性可引起病毒衣壳蛋白的重排和构型变化，导致病毒粒子释放核酸进入细胞质内，病毒衣壳仍留在细胞膜外。
其他特殊方式：植物病毒未发现有特异性细胞受体，通过存在于植物细胞壁上的小伤口或天然存在的外壁孔侵入细胞，也可通过植物细胞之间的胞间连丝而侵入细胞，或者通过昆虫的口器侵入细胞。
2.3脱壳（virus uncoating）
脱壳是病毒感染的第三阶段。指病毒感染性核酸从衣壳内释放出来的过程。有包膜病毒和无包膜病毒脱壳方式随不同病毒而异。病毒脱壳后并不完全裸露，而是与一些特异的病毒蛋白或细胞蛋白连接以抵抗核酸酶的降解作用。
无包膜病毒脱壳：
小RNA病毒、有尾噬菌体直接在细胞膜或细胞壁表面进行脱壳，其侵入与脱壳一次完成；呼肠孤病毒粒子有双层衣壳，经细胞内吞作用进入细胞后被溶酶体中的酶水解脱掉外衣壳，再进一步脱壳；
腺病毒粒子以内吞方式进入内吞泡，其结构会发生改变由二十面体变为球形颗粒，然后进入细胞质，进一步脱去六邻体蛋白。
有包膜病毒脱壳：
由于以膜融合方式侵入细胞，其包膜在与细胞膜融合时已脱去，只剩核衣壳。核衣壳被移至脱壳部位，在细胞蛋白酶的作用下脱去衣壳。
痘苗病毒脱壳分为两个阶段：
病毒包膜经膜融合脱掉使其核心裸露，然后通过吞噬泡转移至细胞质，吞噬泡破裂进入细胞质；
病毒核心在病毒特异的RNA聚合酶作用下，从痘苗病毒基因组DNA上转录约25%的早期基因，合成包括脱壳酶在内的早期蛋白，引起病毒进一步脱壳。
2.4生物合成（biosynthesis）
病毒感染细胞后，细胞内无病毒粒子状态，病毒要么潜伏下来将核酸整合于细胞基因组（病毒的隐蔽期），要么接管细胞的代谢机制，利用宿主的大分子合成装臵通过核酸的复制与表达来完成大分子的合成，为最终形成成熟的病毒粒子提供前提物质，这是体现病毒的生命特征的周期。
病毒粒子以不同方式来影响宿主细胞大分子合成，无论何种病毒与宿主细胞系统，都能有效保护当时病毒核酸的存在，有利于大分子的物质向着病毒大分子物质合成方向转移。
2.4.1生物合成分三个阶段
大分子物质合成的整个过程有一个调节机制，基因的表达存在时间顺序性，主要通过基因表达的转录时间顺序性来调节，即分期进行的。
①早期转录：早期基因→早期mRNA →早期蛋白
a. 改变/抑制宿主细胞大分子合成
b. 与病毒复制有关的蛋白质
②复制
③晚期转录：晚期蛋白（病毒的结构蛋白）
无论哪个阶段，都会产生对病毒核酸复制有调节作用的调节因子。
2.4.2病毒大分子的合成
2.4.2.1病毒基因组的复制
病毒基因组复制的基本特点
全保留复制和半保留复制：大多数dsDNA病毒基因组复制为半保留复制。如T4、SV40 全保留复制（conservative replication）：病毒dsRNA中的两条亲本链一直缠绕在一起，仅在复制点处有几个碱基对解链，并且在复制酶的作用下复制出一条子代RNA链，然后以该新生链为模板合成出互补链，由此产生子代dsRNA基因组。
如：呼肠孤病毒的dsRNA基因组是全保留复制
一些+ssRNA噬菌体基因组复制产生的复制中间体也能通过全保留复制形成子代+ssRNA 病毒基因组复制的起始：
DNA病毒基因组上只有一个复制原点；
RNA病毒5’端的共价结合蛋白作为基因组复制起始引物；
ssDNA病毒基因组两端的末端重复序列形成反转发夹结构可作为引物起始DNA的合成；逆转录病毒以互补于病毒RNA基因组的tRNA分子为引物起始合成（-）DNA链。
病毒基因组复制的方向：dsDNA病毒基因组复制：单向（腺病毒）或双向复制（大多数）连续复制和不连续复制
大多数dsDNA病毒基因组5’→3’方向复制（冈崎片段）
RNA病毒的复制常常是连续合成
病毒基因组复制所需要的复制酶：依赖于宿主细胞的复制酶。如SV40、多瘤病毒
病毒基因组自身编码的复制酶。如痘苗病毒
对于RNA病毒来说，复制与转录是同一种酶，即这种酶既是复制酶，又是转录酶。
2.4.2.2病毒基因组复制主要方式
①复制叉方式（replication fork）
指双链DNA在复制原点解开成单链，由此出现两个叉子状生长点，称为复制叉。
大多数线状dsDNA病毒如T4、T7噬菌体以复制叉方式复制；
环状dsDNA如SV40、λ-噬菌体DNA以θ方式进行复制。复制叉的生长大多是双向的，也有的是单向的。
②滚环方式（rolling cirlcle）
单链环状DNA病毒侵入寄主后，以正链DNA为模板利用寄主细胞的DNA聚合酶复制出与之互补的负链DNA，然后形成双链DNA。在DNA酶的作用下，正链DNA被切断，它
的某些内部结构被暴露出来。此时DNA聚合酶以负链DNA为模板进行复制。随着复制的进行像一条长尾巴似的被滚出去，所以这种方式叫滚环复制。
③链臵换方式（strand displacement）
以3’→ 5’的DNA链为模板，并且由新合成的生长链臵换出与模板链互补的亲链，然后新生链和模板链互补生成子代dsDNA。
2.4.2.3病毒核酸的复制类型
（1）dsDNA复制：双链DNA主要以线状存在，少数环状存在，复制时都经过两个阶段: 双链DNA在固定位臵双向进行，有一个复制点或有多个复制点
出现单链的缺口或者间隙，会导致它们对核酸酶结合力大大增加。
核内复制：Papovavirus（乳头瘤病毒）adenovirus（腺病毒）、herpesvirus（疱疹病毒）质内复制：poxvirus（痘病毒）
（2）ssDNA复制：病毒基因组ssDNA是以链臵换的方式进行复制的；
病毒基因组DNA末端的反转发夹序列即为复制时的引物；
病毒基因组编码末端蛋白或T蛋白具有特异的核酸酶活性，可对复制中间体产生切割，T 蛋白通常共价结合在处于复制状态DNA 5’端；
病毒DNA复制需要宿主细胞提供DNA聚合酶和拓扑异构酶。
如：细小病毒
（3）dsRNA复制：双链RNA病毒有两个特点：
①它的基因组为多片段基因组（10-12）；
②有双层衣壳，没有囊膜。
病毒编码的RNA-RNA 聚合酶存在于细胞核中，在该聚合酶的作用下病毒基因组转录正链RNA。它们既能作为mRNA，又能作为病毒基因组的模板，以全保留的方式进行复制。mRNA翻译结构蛋白，装配内层衣壳后，正链RNA进入，并形成双链RNA。然后又重复上述过程，最后获得了外层衣壳。
如：呼肠孤病毒
（4）+ ssRNA复制：先以+ssRNA为模板，复制出-ssRNA，再以新合成的-ssRNA为模板合成子代+ssRNA，最后由+ssRNA与病毒蛋白质装配成子代病毒粒子。
如：ssRNA 噬菌体、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、TMV等。
（5）- ssRNA复制：其复制过程首先以-ssRNA为模板，复制形成+ssRNA，再以新合成的+ssRNA为模板合成子代-ssRNA，然后–ssRNA 与病毒蛋白装配生成子代病毒粒子。如：弹状病毒、正粘病毒、副粘病毒等。
（6）具有DNA中间体的单链+RNA复制：单链RNA的基因组必须反转录成双链DNA；随后这种DNA必须整合到细胞DNA中；
整合状态长期持续下去并传给子代细胞，也可能转录RNA，生产子代病毒或使细胞转化；感染细胞不会死亡，分裂不停止。这类病毒的潜伏期很长，有时可以终身带毒而不发病。该类病毒通常引起人和动物的肿瘤，其中包括造成人免疫性缺陷症的艾滋病病毒、白血病病毒、肉瘤病毒等。
（7）部分双链DNA病毒：亲代的双链DNA先以其中的负链为模板转录为正链RNA，此RNA可作为mRNA，同时又以此正链RNA为模板反转录为负链DNA，再以负链DNA合成其互补链即形成子代双链DNA。
病毒核酸的复制的主要方式
病毒核酸复制的主要类型
2.4.2.4病毒基因组的转录和翻译
噬菌体的转录和翻译：
噬菌体基因组转录分为四个时期：
立即早期（immediate early）、延迟早期（delayed early）
准晚期（quasi-late）、晚期（late）
噬菌体的转录调控机制：
①可利用宿主的转录酶进行转录（某些噬菌体本身携带转录酶，当转录酶与DNA进入细胞后，转录即刻开始）、小的DNA噬菌体完全依赖宿主的转录酶。
②某些噬菌体DNA是逐步注入细胞的，首先进入细胞的基因片段被转录、余下的DNA才能进入细胞，可以导致不同的基因依次被转录。
③在同一转录单位的基因相继转录时，靠近启动子的基因优先转录。
④修饰宿主的转录酶，可改变其与调节亚基的相互作用。
⑤噬菌体基因与宿主转录酶结合可以改变转录起始或终止的特异性。
⑥噬菌体DNA出现单链的缺口或间隙可以改变它的模板性质。
⑦不同噬菌体的mRNA的功能活性持续的时间不同。
⑧噬菌体的多顺反子的mRNA能被切割成小mRNA。
★并不是每种病毒都有上述的8种机制，可含有1～3种进行调节
DNA噬菌体的翻译：
病毒基因能决定早期mRNA翻译的持续时间以及特定mRNA的翻译速率，从而控制噬菌体蛋白质合成的累积量。
通过改变宿主蛋白质合成的方向来达到抑制细胞本身蛋白质的合成，从而有利于病毒蛋白的产生。病毒核酸进入宿主后，病毒基因的存在决定了mRNA 在宿主细胞内翻译的持续时间以及翻译速度，从而决定了这些蛋白在细胞内的总量。
动物病毒基因组的转录和翻译
转录策略：一般在核内进行，绝大多数病毒依赖于细胞的转录酶和有关因子。
正链RNA病毒：直接作为mRNA翻译为蛋白质；
负链RNA病毒：由依赖于RNA的RNA聚合酶转录为互补的mRNA，再进行蛋白质合成。双链RNA病毒：由病毒的RNA 聚合酶转录为mRNA。
双链DNA病毒：由依赖于DNA的RNA聚合酶转录为mRNA。
单链DNA病毒：先转变为双链DNA，再转录产生mRNA。
反转录病毒的正链病毒RNA：由反转录酶转录为互补单链DNA，再转变为双链DNA，整合于细胞基因组，然后转录产生mRNA。
动物病毒基因组的翻译
翻译：早期RNA 经修饰后从病毒的核心转移出来，翻译为病毒早期蛋白，包括酶类、病毒核酸复制所需的其他蛋白质。或调节宿主细胞RNA和蛋白质合成。晚期蛋白通常是子代病毒的结构蛋白，合成过量。
植物病毒基因组的转录和翻译：
大部分植物病毒基因组为ss RNA，复制方式与其他RNA病毒类似，大多数植物中都有依赖于RNA的RNA聚合酶，这些酶参与病毒RNA的复制。
存在多种翻译策略。如豇豆花叶病毒基因组两个片段分别翻译产生两种聚蛋白，经酶切产生包括壳体蛋白在内的不同蛋白质。
2.5装配与释放（assembly and release）
新合成的病毒核酸和病毒结构蛋白组合成病毒颗粒的过程称为组装，而从细胞内转移到细胞外的过程称为释放。
病毒释放的方式：⑴宿主细胞裂解释放，见于无囊膜病毒。⑵出芽释放，见于有囊膜病毒。
病毒的结构成分核酸与蛋白质分别合成后，在细胞核内或细胞质内组装成核衣壳。
绝大多数DNA病毒在细胞核内组装；
RNA病毒与痘病毒类在细胞质内组装。
无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的病毒体，病毒的早期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。
2.5.1装配（assembly）
噬菌体：T4噬菌体：
头部的装配（衣壳蛋白gp23、核心蛋白gp22、内部蛋白gpIP Ⅲ）
DNA的装填（DNA长度500nm，头部高度0.1nm，高度折叠。
DNA填装需要gp49（核酸酶--切割多联体）、gp16、gp17参与）
尾管和尾鞘的装配（尾管144个gp19构成，6个?环→与基板连接→gp18围绕尾管聚合形成尾鞘，未端加上gp3和gp15（稳定）
基板的装配：
外部六角形结构：gp10、gp11、gp7、gp8、gp53、gp25
中心的塞子：gp27、gp5、gp26、gp28、gp51、gp29
gp9、gp12、gp48、gp54参与构成完整的基板。
尾丝的装配：
尾丝结构成份：gp37、gp36、gp35、gp34
附属和催化蛋白：gp38、gp57、gp63、gpWac
成熟的T4噬菌体以裂解细胞方式释放。
尾部附着于头部不需要酶的作用，是一个自发过程。
动物病毒（分为2个阶段）
a. 壳体装配：如脊髓灰质炎病毒，壳体由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4组成。病毒基因组翻译产生前体蛋白→切割形成P1、P2、P3 →P1生成VP0、VP1和VP3 →基因组+ssRNA进入前衣壳→RNA-(VP0、VP1、VP3 )60 前病毒→58个VP0切割成VP2和VP4。
b. 壳体与核酸结合，形成核衣壳
对于无包膜的病毒，形成的核衣壳就是一个完整的病毒粒子，对于有包膜的病毒，需要在核衣壳外再形成一层包膜，而包膜的形成是来源于宿主细胞膜的成分，壳体装配与核衣壳形成是同时进行的。
植物病毒
无包膜，核壳都以自我装配方式成熟。植物病毒一般不裂解细胞，而是通过胞间连丝传递给相邻的细胞。如TMV有2140个蛋白亚基，当蛋白亚基聚集形成20S双盘时，同一层圆盘内形成氢键、离子键。
装配的起始：20S双盘与TMV-RNA结合，起始环插入双盘中央孔;
装配的延伸：另外的双盘结合到TMV-RNA与第一个双盘形成的装配起始复合物上，蛋白质亚基逐个加入，完成装配过程。
延伸沿两个方向进行，5’端快于3’端，完成整个装配需5-7分钟
2.6释放（release）
裂解（Disintegration）：烈性噬菌体、脊髓灰质炎
绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞随即死亡。
出芽（Budding）
绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或包上细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。
从单个病毒吸附开始至所有病毒释放，此过程称为感染周期或复制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为100-1000。
第三节病毒的非增殖性感染
病毒对敏感细胞的感染可分为两类：一类是增殖性感染，这类感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征。
另一类是非增殖性感染：指由于病毒或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后某一阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然也可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。
病毒的非增殖性感染有三种类型：流产感染、限制性感染和潜伏感染。
（一）流产感染
1、概念：病毒进入细胞后，可合成部分或全部病毒成分，但不能正常装配，或仅产生无感染性的子代病毒颗粒。
2、原因：
（1）依赖于细胞的流产感染
允许细胞：病毒能在其中完成复制循环的细胞
非允许细胞: 病毒不能在其中完成复制循环的细胞（这两个概念见教材）
若病毒感染的是非允许细胞，则病毒能进入早期复制，然而由于缺乏装配的酶，晚期基因的表达等，导致病毒没完成复制过程。
（2）依赖于病毒的流产感染
基因组不完整的缺损病毒引起，因一个或多个病毒复制所需基因有缺损，丧失功能，无论感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环，如DI颗粒、卫星病毒等。
（二）限制性感染
由于易感细胞的瞬时允许性而产生的，其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制（此时的易感细胞是非允许性细胞），直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖，或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。
（三）潜伏感染：在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，而且受染细胞也不会被破坏。
非增殖性感染：病毒感染宿主细胞后不能产生有感染性的病毒粒子。
原因：
①可能是病毒基因组侵入细胞后任一阶段出现差错，宿主DNA/蛋白等仍能合成；
②可能是装配和释放过程出现错误，从而导致非增殖性感染出现。
整合感染：病毒的基因组整合在宿主细胞染色体上，这种感染方式也不产生有感染性的病毒粒子。
3.1非增殖性感染原因有两大类
a. 源于细胞本身产生→非允许细胞（病毒无法完成感染）
b. 源于病毒本身产生→缺损病毒造成：这种缺损病毒是因为缺少病毒自主复制所必需的一个或几个基因功能，所以在宿主细胞中不能完成增殖性感染的过程。
3.2缺损病毒的5种形式
（1）干扰缺损病毒（DI病毒）：在病毒的感染过程中，所产生的一类亚基因组突变体，这类突变体缺少了病毒基因复制所必需的一个或几个功能基因，因此不能单独复制，必须要在同型完整病毒辅助下才能完成复制，但是由于DI病毒与完全病毒竞争复制所需的共同基因产物，所以DI病毒在某种程度上能抑制完全病毒的复制，导致产量下降，这种完全病毒称为标准病毒。
①基因组存在缺失。不同的DI病毒缺损的大小数量是不同的，有的达到90%，但无论缺损多少，都必需保留有：
a. 为病毒复制起始化的序列；
b. 病毒壳体化序列。
②可以干扰同源的标准病毒复制。DI病毒和标准病毒为了复制竞争相同的基因功能产物而发生选择性的复制过程，且这种情况下，DI病毒一般处于优势，因为DI病毒含有较小的基因组，对核酸酶的亲和力较大，从而使标准病毒复制数量大大降低。
③必须依赖同源病毒才能进行复制。
④具有与标准病毒相同的形态特征、结构蛋白与抗原性。
如何产生完整的高活性病毒以避免DI病毒的产生：
①通过高倍稀释（低感染复数）
②直接采用克隆病毒的方法：类似于在微生物分离纯化中用到的挑噬菌斑方法。
由于缺损干扰颗粒的产生，使同种感染性病毒数量减少，在导致病毒的持续性感染中具有一定的作用，但疫苗中含有大量缺损干扰颗粒会影响活疫苗的免疫效果。
（2）卫星病毒
最典型的特征：具有极端寄生性，寄生于与之无关的辅助病毒上。
与DI颗粒相似性：它也是缺损病毒，必须依赖于辅助病毒才能进行复制，并且能够干扰辅助病毒的复制；
与DI颗粒不同：卫星病毒不是来源于辅助病毒的亚基因组突变体，它是自然界中存在的一类病毒，与辅助病毒的DNA/RNA毫无关系。
子代对应亲代：
干扰缺损病毒与标准病毒两者存在亲缘关系；
卫星病毒与辅助病毒无任何关系，与辅助病毒间存在严格的特异性。
（3）假病毒体
在病毒感染过程中，由于宿主细胞核酸完全取代了病毒基因组核酸的一类病毒，则称为假病毒体。
（4）条件缺损病毒
一类基因组发生突变的条件致死突变体，在允许条件下能够正常繁殖，在限制条件下导致流产感染，也能干扰野生型病毒复制。
（5）整合感染
基于某些温和性病毒（某些噬菌体、肿瘤病毒）感染宿主细胞后，其部分或整个病毒基因组整合于宿主细胞的基因组中，并且能够随细胞基因组而同步复制，遗传给子代细胞，只有在某些条件下（自发/诱导），病毒基因组脱离细胞基因组，转向合成完整的病毒粒子。3.3病毒的拯救
处于流产感染状态的病毒，可以通过一定办法，使它们完成增殖性感染，从而产生子代病毒粒子。两种办法：
①协同培养：2种或2种以上的细胞混合培养，假如其中一种细胞是另一种细胞中的病毒允许细胞则混合培养可使病毒增殖。
②协同感染：由2种或2种以上的病毒同时感染一个细胞，因为其中辅助病毒可为流产感染病毒提供繁殖所必需的基因产物。
温和噬菌体与溶源性细菌
温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。
原噬菌体（或前噬菌体）：即整合在宿主核DNA上的噬菌体的核酸。
溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖，而不被裂解。病毒感染细胞后会发生2种反应：
①溶源反应：产生溶源性细菌→子代细胞
λCI基因的产物CI蛋白：是一种阻遏蛋白，可阻止λ左右两个早期启动子的转录，使之不能产生引起与复制及细胞裂解有关的蛋白，但在UV诱导下REC蛋白可降解CI蛋白，诱导90%的细胞裂解。
②裂解反应：通过大分子合成成熟的子代病毒→导致细胞被裂解死亡
溶原性细菌的特点
可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性；
可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-2～10-5 ；
可诱导裂解：用化学、物理方法诱导；
具有“免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体无免疫性；
可自愈：自然遗失前噬菌体；
溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。
第三章病毒习题 填空题： 1．病毒的存在范围是病毒能够感染并在其中复制的___宿主种类和组织细胞种类___。 2．从原核生物中分离的病毒统称噬菌体，它们包括___噬菌体___、___噬蓝(绿)藻体___和___支原体噬菌体___等。 3．病毒属名的词尾是___virus___、科名的词尾是___viridae___、亚科名的词尾是___virinae___，目名的词尾是___virales___。 4．纯化的病毒制备物应保持其___感染性___和___理化性质的均一性___。 5．血凝抑制试验是根据特异性的病毒抗体与病毒表面蛋白作用可能抑制___病毒的血细胞凝集___性质设计的。 6．螺旋对称病毒体的直径是由___蛋白质亚基的大小___决定的，而其长度则是由___病毒核酸分子的长度___所决定的。 7．病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为___结构蛋白___和___非结构蛋白___两类。 8．病毒包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链，通过___β-N-糖苷键___将糖链的___N-乙酰葡萄糖胺___与肽链的___天冬酰胺残基___—连接形成。 9．由一步生长曲线可获得病毒繁殖的两个特征性数据，即潜伏期和裂解量。前者为___病毒吸附于细胞到子代病毒释放___所需的最短的时间，后者为___每个受染细胞释放的子代病毒___的平均数目。 10．病毒的复制过程依其发生事件顺序分为以下___吸附___、___侵入___、___脱壳___、___病毒大分子合成___和___装配与释放___5个阶段。 11．动物病毒进入细胞的方式包括___移位___、___内吞___、___病毒包膜与细胞质膜融合___、___依赖抗体的增强作用___等。 12．动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录要经过包括___5’末端加帽___、___3’末端聚腺苷化___、___甲基化___和___拼接___等修饰才能成熟为功能性mRNA。 13．病毒的非增殖性感染有___流产感染___、___限制性感染___和___潜伏感染___3种类型。 14．流产感染的发生或是由于病毒感染的细胞是___非允许细胞___或是由于感染的病毒是___缺损病毒___。 15．有生物活性的缺损病毒包括___干扰缺损病毒___、___卫星病毒___、___条件缺损病毒___和___整合的病毒基因组___4类。 16．溶源性转变是指原噬菌体所引起的溶源性细菌除免疫性外的其他表型的改变，包括___细胞表面性质的改变___和___致病性转变___。 17．根据病毒感染机体所引起症状的明显程度，可分为___显性感染___和___隐性感染___o 18．毒力是特定的病毒___致病性的强弱___，它是___病毒株___的特征。 19．亚病毒包括___类病毒___、___卫星病毒___、___卫星RNA ___和___朊病毒___。 20．动物病毒感染抑制宿主细胞DNA复制的原因是___为病毒DNA合成提供前体___、___为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和／或复制蛋白___和___细胞蛋白质合成被抑制的次级效应___。 选择题（4个答案选一）： 1．病毒显著区别于其他生物的特征是( (2) )。 (1)具有感染性 (2)独特的繁殖方式 (3)体积微小 (4)细胞内寄生 2．病毒纯化方法均是根据病毒的基本理化性质建立的，包括( (2) )。 (1)病毒的核酸是DNA或是RNA (2)病毒的主要化学组成是蛋白质 (3)病毒含有脂类和糖类 (4)病毒体积微小 3．病毒物理颗粒计数方法测定的是( (3) )。 (1)有活力的病毒数量 (2)无活力的病毒数量 (3)有活力的病毒与无活力病毒数量的总和 (4)致病性的病毒数量 4．描述螺旋对称壳体特征的参数有( (2) )。 (1)核酸的相对分子质量 (2)螺旋长度与直径 (3)螺旋的外观 (4)蛋白质亚基大小 5．ssRNA能够按照它的极性或意义分为( (2) )。 (1)感染性核酸和非感性核酸 (2)正链RNA、负链RNA和双意RNA (3)反意RNA和正意RNA (4)基因组RNA 和非基因组RNA 6．以下病毒中在细胞核内复制的有( (1) )。 (1)腺病毒 (2)痘病毒 (3)小RNA病毒 (4)嗜肝DNA病毒 7．T4噬菌体的的装配包括的亚装配过程有( (3) )。 (1)2个 (2)3个 (3)4个 (4)5个 8．构成机体病毒感染的因素包括( (2) )。
北京大学医学部
Peking University Health Science Center
病毒复制
The replication of virus
北京大学医学部病原生物学系 邹清华
zouqinghua@https://www.doczj.com/doc/8e11100798.html, 医学微生物学 精品课程
Medical Microbiology Excellent Curriculum
复制周期
1、吸附 2、穿入 3、脱壳 4、生物
合成 5、组装 6、释放
病毒单周期生长曲线
病毒的复制
复制（replication） 病毒在细胞内由病毒基因组引导合成病毒核 酸、蛋白质及其它病毒结构成分，在宿主细胞 质内或核内装配成熟，释放到细胞外的增殖方 式。
复制周期 从病毒体侵入细胞到子代病毒体生成释放， 称为一个复制周期。
病毒的复制周期
? 复制早期：识别、吸附、穿入、脱壳。 ? 复制晚期：生物合成、装配、病毒包膜
芽生和释放。
? 隐蔽期：病毒脱壳后进入复制的生物合成阶段，此时电镜 法在细胞内查不到完整病毒颗粒，血清学方法测不到病毒 的抗原，也没有感染性，称为隐蔽期（Eclipse period）。
? 潜隐期：从病毒进入细胞至释放子代病毒前，细胞外无感 染性病毒存在，此段时间称为潜隐期（latent period）。
病毒的异常增殖
顿挫感染（abortive infection）
病毒基因组不完整或发生了改变。 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶、能量等条件。 以上两方面因素使病毒进入宿主细胞后不能在细 胞内完成增殖的全过程或不能装配出有感染性的 病毒体。
伪病毒颗粒 (pseudovirion)
病毒衣壳包裹一段宿主细胞的DNA形成的病毒颗粒。
第三章病毒习题及答案 一、名词解释 1.包涵体：当病毒颗粒大量聚集并使宿主细胞发生病变时，形成了具有一定形态、构造并能用光镜观察的特殊群体，称为包涵体。 2.噬菌斑：将噬菌体与敏感宿主菌在固体培养基上培养一段时间后宿主细菌菌苔上出现的一个个透明圈或负菌落，称为噬菌斑。 3.烈性噬菌体：短时间内能在宿主细胞内增殖，产生大量子代噬菌体，并通过裂解寄主细胞而释放出来的噬菌体，被称为烈性噬菌体。 4.温和噬菌体：某些噬菌体侵染细菌后，将自身核基因组整合到宿主细胞核染色体上，随宿主细胞核基因组的复制而进行同步复制，并不引起寄主细菌裂解，称作温和噬菌体。 5.一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 6.溶源性：温和噬菌体的侵入并不引起宿主细胞裂解，与宿主菌共存的特性称为溶源性或溶源现象。 7.溶源菌：是指在核基因组上整合有前噬菌体，能正常生长繁殖而不被裂解的细菌。 8.病毒多角体：多数昆虫病毒可在宿主细胞内形成光镜下呈多角形的包涵体，称为多角体。 9.类病毒：是由单链共价闭合环状RNA分子组成，专性寄生在活细胞内的分子病原体。 10.拟病毒：是一类包裹于真病毒粒中的有缺陷的类病毒。 11.朊病毒：朊病毒是一类不含核酸的传染性蛋白质分子。 二、包涵体和噬菌斑各有何实践意义？ 答：1、包涵体是病毒颗粒的群体形态，有助于对病毒的分离、纯化、鉴别和计数等许多实际工作。由于不同病毒包涵体的大小、形状、组分以及存在于宿主细胞中的部位均不同，所以包涵体可用于病毒的快速鉴别和某些病毒疾病的辅助诊断指标。 2、噬菌斑有一定的形态，可用作该噬菌体的鉴定指标，也用于纯种分离纯化和计数。 三、简述测定噬菌体效价的双层平板法。 答：预先分别配制含2%和1%琼脂的底层培养基和上层培养基。先用底层培养基在培养皿上浇一层平板，待凝固后，再把预先融化并冷却到45℃以下，加有较浓的敏感宿主和一定体积待测噬菌体样品的上层培养基，在试管中摇匀后，立即倒在底层培养基上铺平待凝，然后在37℃下保温。一般经10余h后即可对噬菌斑计数。 这种方法有许多优点，可弥补培养皿底部不平的缺陷，使噬菌斑大小一致、边缘
第三章病毒和亚病毒 一、名词解释 噬菌斑：由于噬菌体的作用而使布满细菌细胞的菌苔上，出现肉眼可见的一个个透亮的小圆斑。 噬菌体：原核生物的病毒。 病毒：是微生物中最小的生命实体，组成简单，由核酸（DNA或RNA）和一种或少数多种蛋白质组成的非细胞生物。 是一类比较原始的、有生命特征的、能够自我复制和严格细胞内寄生的非 细胞生物。 溶源细胞：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动。 温和噬菌体：能导致溶源性发生的噬菌体。 烈性噬菌体：噬菌体在短时间内能连续完成吸附→侵入→增殖（复制与生物合成）→成熟（装配）→裂解（释放）五个阶段而实现其繁殖的噬菌 体，称为烈性噬菌体。 原噬菌体：某些温和噬菌体侵染细菌后，其核酸整合到宿主细菌染色体中。 处于整合状态的噬菌体DNA称为原噬菌体。 类病毒：是一类只含RNA一种成分、专性寄生在活体的分子病原体。 一步生长曲线：定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。 逆转录病毒：能编码逆转录酶的RNA病毒。病毒RNA基因组可逆转录为病毒DNA，并整合在宿主染色体中一同复制。 裂解量：平均每个宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数。 双层平板法：先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计 算噬菌斑的数量。 效价：每毫升试样中所含有的具侵染性的噬菌体粒子数。 壳体：包在髓核外面的一层蛋白质膜。
阮病毒：不含核酸的传染性蛋白分子，能引起宿主体内的同类蛋白分子发生与其形似的构象变化，而使寄主致病。 壳粒：组成壳体的形态结构单位。 核壳：病毒核酸加上包围的蛋白质衣壳。 包膜：大多数动物病毒，核衣壳外由蛋白或糖蛋白与脂肪所形成类脂（来自寄主）双层外膜，称为包膜。 刺突：糖蛋白在膜上形成各种形状的突起，称刺突。 潜伏期：指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个成熟噬菌体粒子释放前的一段时间。 卫星病毒：是一类存在于某专一病毒粒（辅助病毒）的衣壳内，并完全依赖后者才能复制自己的小分子RNA病毒。 溶源性：当温和噬菌体侵入宿主细胞后，DNA整合到宿主基因组上，随着宿主DNA 复制而复制，但不合成蛋白质，宿主细胞不裂解，继续进行正常 的分裂现象。 自发裂解：在没有任何外来噬菌体感染的情况下，极少数溶源细胞中的原噬菌体偶尔也可恢复活动，进行大量的复制成为营养噬菌体核酸，并接着成 熟为噬菌体粒子，引起宿主细胞裂解。 溶源转变：当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状 的现象，称为溶源转变。 包涵体：表达外源基因的宿主细胞。 二、填空题 1.病毒分为真病毒（简称病毒）和亚病毒分子，后者又分为类病毒、拟 病毒、卫星病毒、卫星RNA 和朊病毒。 2.病毒直径很小，通常用nm 作为度量单位，最大的病毒为似菌病毒和一 种海洋原生病毒，最小的病毒为猪圆环病毒（PCV）和长尾鹦鹉喙羽病 毒（PBFDV），病毒、细菌和真菌个体直径比约1：10：100 。
病毒的复制过程 病毒增殖的方式--- 自我复制( self replication) 当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制（Replication）”。病毒复制的过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放五个步骤，又称复制周期(Replication cycle)。 一、复制周期: （一）吸附(adsorption):病毒表面接触蛋白---- 细胞表面受体 吸附（Adsorption）是指病毒附着于敏感细胞的表面，它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。随后的特异性吸附是非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。 脊髓灰质炎病毒的细胞表面受体是免疫球蛋白超家族，在非灵长类细胞上没有发现此受体，而猴肾细胞、Hela细胞和人二倍体纤维母细胞上有它的受体，故脊髓来质炎病毒能感染人体鼻、咽、肠和脊髓前角细胞，引起脊髓灰质炎（小儿麻痹）。 水磨石病毒的细胞表面受体是含唾液酸（N-乙酰神经氨酸）的糖蛋白，它与流感病毒表面的血凝素剌突（受体连结蛋白）有特殊的亲和力，如用神经氨酸酶破坏该受体，则流感病毒不再吸附这种细胞。 此外，HIV受体为CD4；鼻病毒的受体为细胞粘附分子-1（1CAM-1）；EB病毒的受体为补体受体-2（CR-2）。病毒吸附也受离子强度、pH、温度等环境条件的影响。研究病毒的吸附过程对了解受体组成、功能、致病机理以及探讨抗病毒治疗有重要意义。 （二）穿入(penetration):膜融合；病毒胞饮等 穿入（Penetration）是指病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的细胞内期。 主要有三种方式：（1）融合(Fusion)，在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆。副粘病毒以融合方式进入，如麻疹病毒、腮腺炎病毒囊膜上有融合蛋白，带有一段疏水氨基酸，介导细胞膜与病毒囊膜的融合。（2）胞饮(Viropexis)，由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡。胞饮是病毒穿入的常见方式，也是哺乳动物细胞本身具有一种摄取各种营养物质和激素的方式。当病毒与受体结合后，在细胞膜的特殊区域与病毒病毒一起内陷形成膜性囊泡，此时病毒在胞浆中仍被胞膜覆盖。某些囊膜病毒，如流感病毒借助病毒的血凝素（HA）完成脂膜间的融合，囊泡内低Ph环境使HA蛋白的三维结构发生变化，从而介导病毒囊膜与囊泡膜的融合，病毒核衣壳进入胞浆。（3）直接进入，某些无囊膜病毒，如脊髓灰质炎病毒与受体接角后，衣壳蛋白的多肽构形发生变化并对蛋白水解酶敏感，病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中，而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外，这种进入的方式较为少见。 （三）脱壳(uncoating):细胞溶酶体酶；病毒脱壳酶 穿入和脱壳是边续的过程，失去病毒体的完整性被称为“脱壳(Uncoating)”。脱壳到出现新的感染病毒之间叫“隐蔽期”。经胞饮进入细胞的病毒，衣壳可被吞噬
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
第三章病毒的复制 第一节研究病毒复制的一般性方法 1.1建立病毒复制的实验研究系统 研究病毒的常用培养系统 ①噬菌体——细胞培养系统 用该系统研究噬菌体复制的优点： 敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制； 噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察； 噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。 噬菌体同步感染敏感的细菌培养物—建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。 ②动物病毒—动物细胞培养系统 目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。 在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。 ③植物病毒—原生质体培养系统 高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。 植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。 采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。 无论是哪种培养系统，都要考虑： ①宿主细胞的敏感性与生理状态 ②注意感染复数病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。 感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell） 1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律） 以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒－细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期：①潜伏期②突破期③平稳期 潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期) 潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间
病毒的复制及各类病毒的增殖过程 1 病毒的种类 病毒可分为亚病毒与真病毒两类：前者不具有完整的病毒结构，仅由某种核酸或蛋白质构成；后者通常由核酸及蛋白质外壳构成，部分病毒还具有囊膜结构。不同病毒所含核酸的种类、转录形成m ＲNA和合成蛋白质的方式迥异。因此，根据病毒的核酸类型和转录形成mＲNA的方式不同，可将病毒归为六大类：双链DNA病毒、单正链DNA( + DNA) 病毒、双链ＲNA病毒、单正链ＲNA( +ＲNA) 病毒、单负链ＲNA(－ＲNA) 病毒和逆转录病毒。以下介绍各类病毒的具体增殖步骤。 2 各类病毒的增殖过程 2.1 双链DNA病毒
腺病毒、疱疹病毒以及痘病毒等病毒均属于双链DNA病毒。 以疱疹病毒为例，说明此类病毒的主要增殖过程：①疱疹病毒包膜上的血型糖蛋白B与宿主细胞膜上的受体特异性识别并吸附； ②宿主细胞膜包裹疱疹病毒颗粒，形成吞噬泡，疱疹病毒颗粒通过吞噬作用而进入细胞质，并脱去包膜；③在宿主细胞的溶酶体作用下脱去蛋白质外壳；④病毒DNA进入宿主细胞的细胞核；⑤在ＲNA 聚合酶的帮助下，以病毒DNA为模板合成早期mＲNA并进入细胞质中；⑥早期mＲNA翻译形成早期蛋白，主要指与DNA复制相关的酶，如DNA聚合酶、脱氧胸腺嘧啶激酶等；⑦在解旋酶作用下，DNA双链打开，以打开的两条链为模板，遵循碱基互补配对原则，依赖合成的 DNA 聚合酶，合成子代DNA分子；⑧合成晚期mＲNA，并以此翻译成晚期蛋白，主要为病毒的结构蛋白，子代病毒DNA与结构蛋白装配形成子代病毒；⑨子代病毒从细胞核释放出来，同时披上包膜；⑩细胞膜通过胞吐的形式将子代病毒释放到体外。 2.2 单正链 DNA( + DNA) 病毒 代表病毒为细小病毒，此类病毒增殖的主要过程为：①形成复制中间体：单正链 DNA 病毒进行生物合成时，首先以亲代DNA 作模板，依赖复制酶，遵循碱基互补配对原则，合成其互补DNA 链，并与亲代DNA形成双链，作为复制中间型，含有亲代DNA的新合成的双链 DNA 继续复制；②转录和翻译: 不含亲代 DNA 的新
第三章病毒得复制 第一节研究病毒复制得一般性方法 1、1建立病毒复制得实验研究系统 研究病毒得常用培养系统 ①噬菌体——细胞培养系统 用该系统研究噬菌体复制得优点: 敏感得宿主细菌易于在琼脂平板上培养,其数目易于控制; 噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮,在合适得接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑,其结果容易观察; 噬菌体与细菌得增殖速度快、增殖周期短,在一定时间内可多次反复实验。 噬菌体同步感染敏感得细菌培养物—建立了测定一步生长曲线得实验方法,弄清了噬菌体得复制循环。 ②动物病毒—动物细胞培养系统 目前已建立了很多细胞株,包括脊椎动物细胞(哺乳动物细胞株)与无脊椎动物细胞(昆虫细胞株),为研究病毒复制打下了良好得基础。 在离体条件下,避免了机体内得控制机制及其她因素得影响,因此只能近似反映动物机体内病毒得复制过程。 ③植物病毒—原生质体培养系统 高活性得原生质体得分离与培养方法得建立,把病毒与植物机体或组织之间得复杂关系,转变为病毒与植物单细胞得简单关系,提高了感染效率。 植物体得单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外,有由纤维素组成得细胞壁,植物病毒感染植物体得感染效率要低很多。前二者都就是一个病毒感染一个细胞,但就是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。 采用原生质体(去掉细胞壁),则病毒得感染效率大大提高。但就是总得效率还就是比噬菌体与动物病毒差。 无论就是哪种培养系统,都要考虑: ①宿主细胞得敏感性与生理状态 ②注意感染复数病毒感染宿主细胞后,会导致宿主细胞出现裂缝,胞内得物质渗漏,使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1,即一个对一个。 感染复数(multiplicity of infection, m、o、i) :用以起始病毒感染得每个细胞所需得病毒颗粒数目。单位(PFU/cell) 1、2一步生长实验(定量描述烈性噬菌体得生长规律) 以适量得病毒接种于标准培养得高浓度得敏感细胞,待病毒吸附后,再高度稀释病毒－细胞培养物(避免二次吸附),或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物(去除过量得噬菌体,也就是为了避免二次吸附)以建立同步感染,然后继续培养,定时取样测定培养物中得病毒效价,并以感染时间为横坐标,病毒得感染效价为纵坐标,绘制出病毒特征性得繁殖曲线,即一步生长曲线。体现3个时期: ①潜伏期②突破期③平稳期 潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性得病毒粒子从消失到出现这段时期) 潜伏期:噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体得时间
第三章DNA的复制 蒋毅水产本101班 1012405101 3.1DNA复制的基本特征 3.1.1DNA的半保留复制 DNA复制过程中亲代DNA的双链分子彼此分离，作为模板，按AT配对，CG配对的原则，合成两条新生子链，并称这种方式为半保留复制。 3.1.2DNA复制按5＇→3＇延伸方向 3.1.3DNA的半不连续复制 双链DNA分子的复制是分别以两条极性相反的单链分子为模板，按5’→3’的延伸方向合成新生单链DNA分子。 3.1.4DNA复制的起点、方向 DNA复制的起点，方向和模式等有关的研究是利用条件型复制突变体展开的。 3.1.5DNA复制的引物 M13噬菌体是一直单链DNA病毒，利用寄主细胞内的各种酶类和底物，复制一条负链DNA，形成复制型（RF），再按双链DNA复制模式进行DNA分子的复制。 3.1.6DNA复制的转录激活 双链DNA分子复制起始时从复制远点处双链DNA分子解链，前导链在一段RNA引物的发动下按连续合成的模式完成合成过程，而后随链是按不连续合成的模式不断地完成冈崎片段的合成，而每一个冈崎片段都需要有RNA引物的发动过程。 3.1.7DNA复制的模式 3.1.7.1新起始方式或复制叉式 每次复制的起始均从一个固定复制起点开始，转录激活作用使双链DNA开链，启动前导链的联想复制并在两个方向形成复制叉，后随链按不连续方式合成冈崎片段。 3.1.7.2滚环方式或共价延伸方式 单链环状DNA病毒的复制主要以滚环方式或共价延伸方式进行DNA分子的复制。噬菌体和真核生物的rDNA的扩增是采用滚环复制的方式。 3.1.7.3置换式或D环方式 真核生物线粒体源于原核生物，其DNA也是环形的，但其复制却采用置换式进行。 3.1.8DNA复制体的结构与复制的回环模型 DNA的复制是由多种酶类共同参与的一个复杂的酶促反应过程，而且包括DNA聚合酶，引物的引发酶，DNA解旋酶，单链结合蛋白，链接酶等在内的如此众多的酶分子均集中在复制叉处组成一个复合体协同互作，共同完成DNA分子的复制过程。 3.1.9线形DNA复制避免5’端短缩的方式 共联体假说认为在线状DNA分子的两端具有丰足末端，从而保证了合成的两条子代DNA分子在5’末端的单链缺口处互补，形成共联体。
乙肝病毒复制过程 乙肝病毒DNA复制过程 不同于一个真正的生物体，病毒并不通过生长和分裂等方式繁殖自身，而是像铸造机器零件一样，按照一定的模具拷贝出来的。病毒DNA中包含有一些程序，指导病毒的遗传物质和其它一些结构蛋白组分增殖。另外，病毒DNA中还包含有一些信息，使得单一组分能够在细胞因子的帮助下，自发组装成新的病毒颗粒。 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA
（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA 链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV大有“赤膊上阵”
病毒的复制增殖过程 病毒不具有能独立进行代谢的酶系统，因此只有进入活的易感宿主细胞内，由宿主细胞提供合成病毒核酸与蛋白质的原料，如低分子量前体成分、能量、必要的酶等，病毒才能增殖。病毒增殖的方式不是二分裂，而是自我复制。即以病毒核酸为模板，在DNA多聚酶或RNA多聚酶及其他必要因素作用下，合成子代病毒的核酸和蛋白质，装配成完整病毒颗粒并释放至细胞外。病毒复制（replication）一般可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段，称为复制周期（replication c ycle）。病毒经过复制产生大量的子代病毒，而此时，宿主细胞的生物合成则受到不同程度的抑制和破坏。 一、病毒复制周期 吸附（adsorption）吸附于宿主细胞表面是病毒感染的第一步。吸附主要是通过病毒体表面的配体蛋白与易感细胞表面特异性受体相结合。不同细胞表面有不同受体，它决定了病毒的不同嗜组织性和感染宿主的范围，如小RNA病毒衣壳蛋白特定序列能与人及灵长类动物细胞表面脂蛋白受体结合，而腺病毒衣壳触须样纤维能与细胞表面特异性蛋白相结合。有包膜病毒多通过表面糖蛋白结构与细胞受体结合，如流感病毒HA糖蛋白与细胞表面受体唾液酸结合发生吸附；人类免疫缺陷病病毒（HIV）包膜糖蛋白gp120的受体是人Th细胞表面CD4分子；EB病毒则能与B细胞CD21受体结合。无受体细胞不能吸附病毒，也不能发生
感染。细胞含受体数不尽相同，最敏感细胞可含10万个受体。吸附过程可在几分钟到几十分钟内完成。 穿入（penetration）病毒与细胞表面结合后，可通过胞饮、融合、直接穿入等方式进入细胞。胞饮类似吞噬泡，细胞内陷将病毒包进细胞浆内，无包膜病毒多以胞饮形式进入易感染动物细胞内。融合是指病毒包膜与细胞膜融合，包括病毒融合蛋白与细胞第二受体的作用，如HIV 与CCR5的结合。融合后再将病毒的核衣壳释放至细胞浆内。还有少数无包膜病毒在吸附时某些蛋白衣壳的多肽成分发生改变，从而可直接穿过细胞膜。 脱壳（uncoating）病毒脱去蛋白衣壳后，核酸才能发挥作用。多数病毒穿入细胞后，在细胞溶酶体酶的作用下，脱去衣壳蛋白释放病毒核酸。痘病毒脱壳过程复杂，分为两步。先由溶酶体酶作用脱去外壳蛋白，再经病毒编码产生的脱壳酶脱去内层衣壳，方能使核酸完全释放出来。 生物合成（biosynthesis）病毒脱壳后，进入生物合成阶段，即病毒利用宿主细胞提供的环境和物质合成大量病毒核酸和结构蛋白。病毒核酸在细胞内复制的部位因核酸类型不同而不同。除痘病毒外，DNA病毒都在细胞核内复制；除正粘病毒和逆转录病毒外，RNA病毒均在细胞浆内复制。 生物合成一般分早期和晚期两个阶段。早期蛋白合成阶段是病毒早期基因组在细胞内进行转录、翻译而产生病毒生物合成中必需的酶类及某些
第三章病毒试题一．选择题 30569.多数病毒粒子的大小为 A.10nm, B.100nm左右 C.300nm D.10-300nm 答:(B) 30570.病毒的大小以()为单位量度。 A. m B.nm C.mm 答:(B) 30571.E.coli T4噬菌体的典型外形是： A.球形 B.蝌蚪形 C.杆状 D.丝状 答:(B) 30572.类病毒是一类仅含有侵染性的病毒。 A.蛋白质 B.RNA C.DNA D.DNA和RNA。 答:(B) 30573.病毒壳体的组成成份是： A.核酸 B.蛋白质 C.多糖 D.脂类 答:(B) 30574.病毒囊膜的组成成分是： A.脂类 B.多糖 C.蛋白质 答:(A) 30575.病毒含有的核酸通常是： A.DNA和RNA B.DNA或RNA C.DNA D.RNA 答:(B) 30576.最先发现病毒的是：
A.巴斯德 B.柯赫 C.伊万诺夫斯基 D.吕文虎克 答：（C) 30577.在-70℃时病毒的保存时间为： A.以小时计 B.以天计 C.以月计 D.以年计 答:(C) 30578.昆虫病毒主要靠()感染 A.接触 B.口器 C.伤口 答:(B) 30579.CPV是 A.颗粒体病毒 B.质多角体病毒 C.核多角体病毒 答:(B) 30580.NPV是 A.核多角体病毒 B.质多角体病毒 C.颗粒体病毒 答:(A) 30581.GV是： A.无包涵体病毒 B.颗粒体病毒 C.核多角体病毒 答:(B) 30582.核多角体病毒是： A.dsDNA杆状病毒 B.ssDNA杆状病毒 C.dsRNA病毒 D.ssRNA病毒 答:(A) 30583.质多角体病毒是: A.dsDNA球形病毒 B.ssDNA球形病毒 C.dsRNA球形病毒 D.ssRNA杆状病毒 答:(C) 30584.颗粒体病毒是:
干货丨病毒的复制及各类病毒的增殖过程 1 病毒的种类 病毒可分为亚病毒与真病毒两类：前者不具有完整的病毒结构，仅由某种核酸或蛋白质构成；后者通常由核酸及蛋白质外壳构成，部分病毒还具有囊膜结构。不同病毒所含核酸的种类、转录形成mＲNA和合成蛋白质的方式迥异。因此，根据病毒的核酸类型和转录形成mＲNA的方式不同，可将病毒归为六大类：双链DNA病毒、单正链DNA( + DNA) 病毒、双链ＲNA 病毒、单正链ＲNA( +ＲNA) 病毒、单负链ＲNA(－ＲNA) 病毒和逆转录病毒。以下介绍各类病毒的具体增殖步骤。 2 病毒的复制 病毒为颗粒状的非细胞结构，极其微小，通常以纳米为单位，营寄生生活。病毒侵入宿主细胞后，借助宿主细胞提供的核苷酸原料、氨基酸、核糖体及能源系统等，以病毒核酸为控制中心，合成子代病毒所需核酸与蛋白质等成分，最后在宿主细胞内装配成结构完整、具有一定侵染力的病毒粒子，这个过程称为病毒的复制。病毒正常复制周期分为六个阶段：吸附、侵入、脱壳、生物合成、组装和释放。 2.1 吸附 病毒感染宿主细胞的第一步就是吸附。绝大多数病毒的吸附可分为非特异性吸附和特异性吸附两个阶段：前者是指病毒依靠静电作用与宿主细胞接触而结合；后者是指病毒表面蛋白质作为抗原与宿主细胞膜上相应的受体特异性识别并结合。2.2 侵入无囊膜的病毒一般由细胞膜直接包裹吞入从而进入细胞，称为病毒胞饮。有囊膜的病毒除了通过细胞胞饮的方式进入细胞，还可通过囊膜与宿主细胞膜融合的方式，使病毒进入
细胞。2.3 脱壳即病毒内具有感染性的核酸从外壳内释放出来的过程。不同病毒脱壳方式迥异，大多数是在宿主细胞溶酶体作用下脱壳并释放出核酸。脱壳与侵入通常是连续进行的，如某些通过胞饮进入细胞的病毒在细胞壁或细胞膜表面同时进行脱壳和侵入，以膜融合方式入侵的病毒在与细胞膜融合时同时脱去包膜。 2.4 生物合成 病毒核酸进入宿主细胞后，利用宿主细胞的物质首先合成自身复制所必需的复制酶和一些抑制蛋白，然后合成子代病毒的核酸和结构蛋白，不同种类病毒的生物合成方式各不相同。2.5 组装病毒的组装是指新的病毒核酸与蛋白质衣壳装配在一起，形成结构完整、具有一定感染力的子代病毒。ＲNA 病毒和DNA病毒组装的位置具有一定差异，其中绝大多数DNA病毒在宿主细胞的细胞核中完成组装，而ＲNA病毒和痘病毒类一般在细胞质中完成组装。2.6 释放绝大多数无囊膜病毒同步释放，会对宿主细胞造成急性伤害，使得宿主细胞短时间内迅速死亡；而绝大多数有囊膜的病毒则需要经过内质网加工，最后以出芽的方式释放，在一段时间内逐个释出，宿主细胞死亡较缓慢。一个感染细胞通常可以释放出100～1000 个病毒。 3 各类病毒的增殖过程 3.1 双链DNA病毒 腺病毒、疱疹病毒以及痘病毒等病毒均属于双链DNA病毒。 以疱疹病毒为例，说明此类病毒的主要增殖过程：①疱疹病毒包膜上的血型糖蛋白B与宿主细胞膜上的受体特异性识别并吸附；②宿主细胞膜包裹疱疹病毒颗粒，形成吞噬泡，疱疹病毒颗粒通过吞噬作用而进入细胞质，并脱去包膜；③在宿主细胞的溶酶体作用下脱去蛋白质外壳；④病毒DNA 进入宿主细胞的细胞核；⑤在ＲNA 聚合酶的帮助下，以病毒DNA为模板合成早期mＲNA并进入细胞质中；⑥早期mＲNA翻译形成早期蛋白，主
乙肝病毒的复制过程 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA 称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA 颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG 及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV 大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着HBv的复制的。 复制的第三步：入核 HBv DNA从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善，形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBv cccDNA)。这个cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝细胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目药物都难以通过这坚韧的核膜，因而对cccDNA 也无可奈何，但cccDNA却掌控着HBv所有的遗传信息，指令着HBv的复制。因此．现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难，这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制，“全部转阴”也只能是一种幻想。 复制的第四步：转录 HBV在这一阶段会以cccDNA为“模子”，像录音带似的把HBv cccDNA上的所有信息全都转录到“信息核糖核酸”(mRNA)上。这个转录过程需要人体内的酶类帮忙，因为所有的
病毒感染细胞实验整体 流程及原理 文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1）几乎可以感染所有类型的细胞
第三章病毒和亚病毒 病毒学（virulogy）研究病毒（virus）的本质及其与宿主的相互作用的科学，是微生物学的重要分支学科。 第一节病毒 一、病毒的发现和研究历史 第一个记载的植物病毒病当属郁金香碎色花病，至今荷兰阿姆斯特丹的博物馆还保存着一张1619年荷兰画家的一幅得病的郁金香静物画。 当时人们对郁金香病花的狂热了，一枚得病的郁金香球茎竟能换成吨的谷物或上千磅的奶酪。 1886年，A. Mayer 发现烟草花叶病具有传染性 1898年，M W Beijerinck对烟草花叶病病原体的研究结果： 能通过细菌滤器； 可被乙醇沉淀而不失去其感染性， 能在琼脂凝胶中扩散； 用培养细菌的方法不能被培养出来，推测只能在植物活细胞中生活； 结论：病原是一种比细菌还小的“有传染性的活的流质”。 真正发现病毒存在的是贝叶林克，给病毒起拉丁名叫“Virus”也是他。 一百多年以来，烟草花叶病毒在病毒学发展史乃至遗传学、生物化学以及当代基因工程中起到了里程碑的作用。 1917年迪海莱（F. D'Herelle） ?痢疾杆菌培养液（浑浊）+ 污水 ?培养液变清澈 ?细菌过滤器 ?清液+痢疾杆菌培养液（浑浊） ?培养液变清澈 ?引起细胞破裂的因子叫噬菌体 二、病毒的特点和定义 1. 特点 1）不具有细胞结构，具有化学大分子的特征。 Eg. 一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳（coat）构成，故可把它们视为核蛋白分子。
朊病毒甚至仅由蛋白质构成 3）大部分病毒不能进行独立的代谢作用。 4）严格的活细胞内寄生，必须依赖宿主细胞进行自身的核酸复制，形成子代。 5）个体微小，在电子显微镜下才能看见 6）对大多数抗生素不敏感，对干扰素敏感。 7）在离体条件下，能以无生命的生物大分子状态存在，并可长期保持其侵染活力。 8）有些病毒的核酸还能整合到宿主的基因组中，并诱发潜伏性感染。 2. 定义 ★什么是病毒？ 病毒（virus)是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的超显微“非细胞生物”，其本质是一种只含DNA或RNA的遗传因子。 病毒是一类非细胞生物，故称之为病毒粒或病毒体（virion） 病毒颗粒或病毒粒子（virus particle）：专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。 三、病毒的宿主范围 病毒几乎可以感染所有的细胞生物，并具有宿主特异性 （二）病毒的形态 （三）典型病毒粒的构造 1.病毒粒的结构 2. 病毒粒的对称体制 3. 病毒的群体形态 （1）包涵体（inclusion body） 病毒粒大量聚集并使宿主细胞发生病变时，就形成了具有一定形态、构造并能用光学显微镜加以观察和识别的特殊“群体”，称之为包涵体（inclusion body）。 有的可用肉眼观察， Eg：由噬菌体在菌苔上形成的“负菌落”即噬菌斑（plaque）； 由动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成的空斑（plaque）； 由植物病毒在植物叶片上形成的枯斑（lesion，病斑）。 4. 噬菌体的形态 从结构上噬菌体可分为六个类群 Ⅰ类：有头有尾，尾部可收缩，双链DNA