北京大学医学部
Peking University Health Science Center
病毒的复制
复制（replication） 复制（ li ti ） 病毒在细胞内由病毒基因组引导合成病毒核 酸、蛋白质及其它病毒结构成分，在宿主细胞 质内或核内装配成熟，释放到细胞外的增殖方 式。 复制周期 从病毒体侵入细胞到子代病毒体生成释放， 称为一个复制周期。
病毒复制
The replication of virus
北京大学医学部病原生物学系 邹清华 zouqinghua@https://www.doczj.com/doc/a22962601.html,
医学微生物学 精品课程
Medical Microbiology Excellent Curriculum
复制周期
1、吸附 2、穿入 3、脱壳 4、生物 合成 5、组装 6、释放
病毒的复制周期
? 复制早期：识别、吸附、穿入、脱壳。 复制早期：识别 吸附 穿入 脱壳 ? 复制晚期：生物合成、装配、病毒包膜 芽生和释放。 ? 隐蔽期：病毒脱壳后进入复制的生物合成阶段，此时电镜 法在细胞内查不到完整病毒颗粒 血清学方法测不到病毒 法在细胞内查不到完整病毒颗粒，血清学方法测不到病毒 的抗原，也没有感染性，称为隐蔽期（Eclipse?period）。 ? 潜隐期：从病毒进入细胞至释放子代病毒前，细胞外无感 p 染性病毒存在，此段时间称为潜隐期（latent?period）。
病毒的异常增殖
顿挫感染（abortive infection） 顿挫感染（abortive?infection）
病毒基因组不完整或发生了改变。 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶 能量等条件 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶、能量等条件。 以上两方面因素使病毒进入宿主细胞后不能在细 胞内完成增殖的全过程或不能装配出有感染性的 病毒体。 病毒体
伪病毒颗粒 (pseudovirion)
病毒衣壳包裹一段宿主细胞的DNA形成的病毒颗粒。
病毒单周期生长曲线
缺陷性干扰颗粒
（defective interfering particles，DIP） （defective?interfering?particles，DIP） 经过一个复制周期，一个细胞可产生高达10?万个 子代病毒，但只有1%~10%病毒具有感染性，其他无 感染性的病毒称为缺陷颗粒 (defective?particles)， (defective particles) 通常由变异和装配错误所致。缺陷病毒本身不能复制 ，但却能干扰同种成熟病毒体进入细胞或在细胞内增 殖。
吸附（adsorption）
※ 是病毒体感染并侵入细胞的第一步，是病
毒体表面病毒吸附蛋白与细胞表面受体特异 表 病 白 细 表 结合的过程。
※ 决定病毒的嗜组织性和宿主特异性
病毒吸附蛋白（VAP）
细胞受体（receptor）
裸露病毒的吸附
裸露病毒体通过衣壳蛋白吸附细胞 脊髓灰质炎病毒表面深凹的皱褶
Attachment
CD4 binding
Co-receptor Co receptor binding
Membrane fusion
HIV HIV?gp120识别辅助受体 120识别辅助受体
包膜病毒的吸附
包膜病毒体通过包膜糖蛋白吸附细胞 甲型流感病毒血凝素与唾液酸受体结合
流感病毒 血凝素 唾液酸受体 敏感细胞
神经氨酸（NeuAc）
NeuAc-α2,3-Gal
NeuAc-α2,6-Gal
NeuAc-α2,3-Gal NeuAc α2,6 NeuAc2,6-Gal Gal
甲型流感病毒的血凝素能与多种不同细胞表面的唾液酸结合
黄热病毒 森林脑炎病毒 流行性乙型脑炎病 黄热病毒、森林脑炎病毒、流行性乙型脑炎病 毒能与多种动物细胞表面的受体结合，包括节 肢动物、爬行动物、两栖动物、鸟类和哺乳动 物等，因此，这些病毒不仅能感染多种动物， 而且还能感染蚊子和其他昆虫。 而且还能感染蚊子和其他昆虫
穿入 (penetration)
病毒体吸附在宿主细胞膜上后，可通过数种穿入 方式进入细胞：
1 包膜的病毒 1.无包膜的病毒
一般经过细胞膜吞入 般经过细胞膜吞入，如腺病毒、小RNA病 如腺病毒 小RNA病 毒等
无包膜病毒胞吞
2. 有包膜的病毒 2.?有包膜的病毒
? 包膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接 膜 宿 胞膜融合， 毒 核衣壳 接 进入细胞浆内 ? 病毒胞饮:?细胞膜吞入
(病毒胞吞形成的吞噬空泡)
(1)?膜融合后进入
(2) 病毒胞饮
(病毒胞吞形成的吞噬空泡)
脱壳（uncoating）
不同病毒脱壳方式不一 多数在宿主细胞溶酶体酶作用 不同病毒脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶作用 下脱壳，释放出基因组核酸。 (1)溶酶体酶直接裂解经过膜融合后进入的衣壳; (2)溶酶体酶也可注入吞噬空泡内 将衣壳裂解 (2)溶酶体酶也可注入吞噬空泡内,将衣壳裂解
? 脱壳位置
– DNA病毒：细胞核 – RNA病毒：细胞质 病毒 细胞质
? 脱壳时间
– 与细胞受体结合时即启动：脊髓灰质炎病毒 – 部分脱壳：呼肠孤病毒 – 痘病毒：病毒本身酶合成mRNA，合成脱壳酶
生物合成（biosynthesis）
? 病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提 病毒基因组 旦从衣壳中释放后 就利用宿主细胞提 供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。 ? 早期，病毒复制合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白 ? 生物合成阶段，病毒处于隐蔽期 生物合成阶段 病毒处于隐蔽期 ? 根据病毒基因组如何转录成mRNA、如何指令合成蛋 白质，病毒的生物合成过程可基本归为6大类：双链 DNA病毒、单链DNA病毒、单正链RNA病毒、单负 链RNA病毒、逆转录病毒和双链RNA病毒。
第I类：双链DNA病毒
? ? ? ? ? 痘病毒科 疱疹病毒科 腺病毒科 乳头状病毒科 T4噬菌体等
dsDNA病毒复制示意图
病毒DNA
转录(核内)
细胞核内的依 赖DNA的RNA 多聚酶
细胞的依赖 DNA的RNA 多聚酶
早期mRNA
翻译 (胞质)
复 制 子代DNA 转录
早期蛋白:DNA多 聚酶和调节蛋白 晚期mRNA 翻译 晚期蛋白质 晚 白 (病毒 结构蛋白)
第II类: 单正链RNA病毒
? 基因组RNA直接具有mRNA功能 ? 属于多顺反子，先翻译成一个大蛋白，经切割 多顺反 先 译成 个大 白 经切割
形成成熟的蛋白。
? 可直接附着于宿主核糖体上转译出病毒结构蛋
白和非结构蛋白（依赖RNA的RNA多聚酶），故 病毒核酸本身具有感染性。 包括:SARS病毒和脊髓灰质炎病毒等
第 III类: 单负链RNA病毒
? RNA?病毒必须具有自身的RNA?依赖的RNA?聚 合酶 (RNA (RNA-dependent dependent?RNA?polymerase, RNA polymerase, RdRp)?才能复制。 ? 单负链RNA病毒本身携带有依赖RNA的RNA 多聚酶，病毒核酸本身不具有感染性。 ? 包括:?流感病毒,?腮腺炎症病毒和狂犬病毒等
本身携带依 赖RNA的 RNA多聚酶
第IV类: 逆转录病毒
+ssRNA
RdRp?的校读 (proofreading)?能力很低，合成核酸 时其碱基的错配率是DNA?聚合酶的1?万倍。病毒复 制过程中，RNA?病毒的变异速度可达DNA?病毒的 100?万倍以上。 所以，同一种RNA?病毒毒粒与毒粒间的基因序列并 所以， 种 因序列并 不完全相同。因此，某种RNA?病毒实际上是一组起 源相同，遗传上密切相关但其基因序列不完全相同的 病毒群，即准种 (quasispecies)。
逆转录酶+细胞的tRNA为引物 RNA酶H降解亲代RNA；逆转录 酶以-ssDNA为模板合成+ssDNA
+ssRNA:-ssDNA +ssRNA: ssDNA
-ssDNA:+ssDNA
整合酶将dsDNA 整合到细胞染色体
Provirus前病毒
NF KB和LTR的作用 NF-KB
+ssRNA
HIV的复制
用作病毒基因组 合成结构蛋白
第V类: 单链DNA病毒
ssDNA病毒的特点： 种类很少,仅人类输血传染病毒(TTV)为ssDNA病毒; 先以亲代ssDNA为模板,?合成一个互补链形成中间型 dsDNA,?然后解链,?由新合成互补链为模板复制出子 , 然后解链, 由新合成互补链为模板复制出子 代ssDNA,转录mRNA和翻译合成病毒蛋白质。
第VI类: 双链RNA病毒
d RNA病毒的特点 dsRNA病毒的特点： 人类病毒中只有呼肠孤病毒属于此类,?病毒基因组共 人类病毒中只有呼肠孤病毒属于此类 病毒基因组共 有10~12个非重叠的dsRNA节段组成。每个节段均 可由病毒自身的RNA多聚酶转录出不同的 RNA 可由病毒自身的RNA多聚酶转录出不同的mRNA; dsRNA病毒只有其负链RNA复制出正链RNA,再由 d RNA病毒只有其负链RNA复制出正链RNA 再由 正链RNA复制出新负链RNA.?故其复制不遵循DNA 半保留复制的原理 子代RNA全部为新合成的RNA 半保留复制的原理,?子代RNA全部为新合成的RNA。
装配（assembly）
装配 assembly：核衣壳形成的过程 病毒装配的位置和机制取决于病毒核酸复制的位 机 核 置以及病毒有无包膜
?大部分DNA病毒在细胞核内组装：如腺病毒 大部分 病毒在细胞浆内组装：如脊髓灰质炎病毒 ?大部分RNA病毒在细胞浆内组装：如脊髓灰质炎病毒 ?有些病毒在细胞核膜上组装：如疱疹病毒 ?也有病毒在细胞膜上组装：如流感病毒 也有病毒在细胞膜上组装 如流感病毒 ?装配方式
?有些无包膜病毒的结构蛋白能形成不含核酸的空壳结构，称为 前衣壳(procapsid)，然后再由病毒基因充填，完成病毒的装配 ，如微小RNA?病毒，但此类病毒也通过结构蛋白包绕病毒基因 病 病 结 白 病 而装配。 ?逆转录病毒、披膜病毒和负链RNA病毒的核衣壳是由结构蛋 白包绕病毒基因而装配，然后由包膜包裹。
?装配过程中能发生错误，产生无核酸的毒粒或基因缺 陷的毒粒。缺陷病毒能占据病毒合成场所，从而干扰或 阻止病毒的合成，这种缺陷病毒称缺陷干扰颗粒。
释 放（release）
裸病毒：通过细胞裂解释放
细胞融合
包膜病毒 通过“出芽”方式释放 包膜病毒：通过“出芽”方式释放
绝大多数无包膜病毒释放 一次同步 破坏宿主细胞膜 绝大多数无包膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细胞膜， 细胞迅速死亡。 绝大多数有包膜病毒以出芽方式释出时包上细胞核膜或细 胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非 次同步，细胞死亡 胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡 缓慢。
狂犬病病毒破膜而出或被外排
复制周期
流感病毒出芽释放
Summary
1.掌握病毒复制的概念 2.掌握病毒复制周期每个阶段的特点 3.其他概念： Abortive infection DIP
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病毒复制
The replication of virus
北京大学医学部病原生物学系 邹清华
zouqinghua@https://www.doczj.com/doc/a22962601.html, 医学微生物学 精品课程
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复制周期
1、吸附 2、穿入 3、脱壳 4、生物
合成 5、组装 6、释放
病毒单周期生长曲线
病毒的复制
复制（replication） 病毒在细胞内由病毒基因组引导合成病毒核 酸、蛋白质及其它病毒结构成分，在宿主细胞 质内或核内装配成熟，释放到细胞外的增殖方 式。
复制周期 从病毒体侵入细胞到子代病毒体生成释放， 称为一个复制周期。
病毒的复制周期
? 复制早期：识别、吸附、穿入、脱壳。 ? 复制晚期：生物合成、装配、病毒包膜
芽生和释放。
? 隐蔽期：病毒脱壳后进入复制的生物合成阶段，此时电镜 法在细胞内查不到完整病毒颗粒，血清学方法测不到病毒 的抗原，也没有感染性，称为隐蔽期（Eclipse period）。
? 潜隐期：从病毒进入细胞至释放子代病毒前，细胞外无感 染性病毒存在，此段时间称为潜隐期（latent period）。
病毒的异常增殖
顿挫感染（abortive infection）
病毒基因组不完整或发生了改变。 宿主细胞缺少病毒复制所需要的酶、能量等条件。 以上两方面因素使病毒进入宿主细胞后不能在细 胞内完成增殖的全过程或不能装配出有感染性的 病毒体。
伪病毒颗粒 (pseudovirion)
病毒衣壳包裹一段宿主细胞的DNA形成的病毒颗粒。
病毒的复制过程 病毒增殖的方式--- 自我复制( self replication) 当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制（Replication）”。病毒复制的过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放五个步骤，又称复制周期(Replication cycle)。 一、复制周期: （一）吸附(adsorption):病毒表面接触蛋白---- 细胞表面受体 吸附（Adsorption）是指病毒附着于敏感细胞的表面，它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。随后的特异性吸附是非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。 脊髓灰质炎病毒的细胞表面受体是免疫球蛋白超家族，在非灵长类细胞上没有发现此受体，而猴肾细胞、Hela细胞和人二倍体纤维母细胞上有它的受体，故脊髓来质炎病毒能感染人体鼻、咽、肠和脊髓前角细胞，引起脊髓灰质炎（小儿麻痹）。 水磨石病毒的细胞表面受体是含唾液酸（N-乙酰神经氨酸）的糖蛋白，它与流感病毒表面的血凝素剌突（受体连结蛋白）有特殊的亲和力，如用神经氨酸酶破坏该受体，则流感病毒不再吸附这种细胞。 此外，HIV受体为CD4；鼻病毒的受体为细胞粘附分子-1（1CAM-1）；EB病毒的受体为补体受体-2（CR-2）。病毒吸附也受离子强度、pH、温度等环境条件的影响。研究病毒的吸附过程对了解受体组成、功能、致病机理以及探讨抗病毒治疗有重要意义。 （二）穿入(penetration):膜融合；病毒胞饮等 穿入（Penetration）是指病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的细胞内期。 主要有三种方式：（1）融合(Fusion)，在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆。副粘病毒以融合方式进入，如麻疹病毒、腮腺炎病毒囊膜上有融合蛋白，带有一段疏水氨基酸，介导细胞膜与病毒囊膜的融合。（2）胞饮(Viropexis)，由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡。胞饮是病毒穿入的常见方式，也是哺乳动物细胞本身具有一种摄取各种营养物质和激素的方式。当病毒与受体结合后，在细胞膜的特殊区域与病毒病毒一起内陷形成膜性囊泡，此时病毒在胞浆中仍被胞膜覆盖。某些囊膜病毒，如流感病毒借助病毒的血凝素（HA）完成脂膜间的融合，囊泡内低Ph环境使HA蛋白的三维结构发生变化，从而介导病毒囊膜与囊泡膜的融合，病毒核衣壳进入胞浆。（3）直接进入，某些无囊膜病毒，如脊髓灰质炎病毒与受体接角后，衣壳蛋白的多肽构形发生变化并对蛋白水解酶敏感，病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中，而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外，这种进入的方式较为少见。 （三）脱壳(uncoating):细胞溶酶体酶；病毒脱壳酶 穿入和脱壳是边续的过程，失去病毒体的完整性被称为“脱壳(Uncoating)”。脱壳到出现新的感染病毒之间叫“隐蔽期”。经胞饮进入细胞的病毒，衣壳可被吞噬
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
第三章病毒的复制 第一节研究病毒复制的一般性方法 1.1建立病毒复制的实验研究系统 研究病毒的常用培养系统 ①噬菌体——细胞培养系统 用该系统研究噬菌体复制的优点： 敏感的宿主细菌易于在琼脂平板上培养，其数目易于控制； 噬菌体在细菌内增殖导致细菌培养物变清亮，在合适的接种密度下很容易在琼脂平板上形成噬斑，其结果容易观察； 噬菌体和细菌的增殖速度快、增殖周期短，在一定时间内可多次反复实验。 噬菌体同步感染敏感的细菌培养物—建立了测定一步生长曲线的实验方法，弄清了噬菌体的复制循环。 ②动物病毒—动物细胞培养系统 目前已建立了很多细胞株，包括脊椎动物细胞（哺乳动物细胞株）和无脊椎动物细胞（昆虫细胞株），为研究病毒复制打下了良好的基础。 在离体条件下，避免了机体内的控制机制及其他因素的影响，因此只能近似反映动物机体内病毒的复制过程。 ③植物病毒—原生质体培养系统 高活性的原生质体的分离和培养方法的建立，把病毒与植物机体或组织之间的复杂关系，转变为病毒与植物单细胞的简单关系，提高了感染效率。 植物体的单细胞体外培养目前无法实现。在植物体外，有由纤维素组成的细胞壁，植物病毒感染植物体的感染效率要低很多。前二者都是一个病毒感染一个细胞，但是要104～106个植物病毒才能感染一个植物体。 采用原生质体（去掉细胞壁），则病毒的感染效率大大提高。但是总的效率还是比噬菌体和动物病毒差。 无论是哪种培养系统，都要考虑： ①宿主细胞的敏感性与生理状态 ②注意感染复数病毒感染宿主细胞后，会导致宿主细胞出现裂缝，胞内的物质渗漏，使宿主细胞死亡。要尽可能做到感染复数为1，即一个对一个。 感染复数(multiplicity of infection, m.o.i) ：用以起始病毒感染的每个细胞所需的病毒颗粒数目。单位（PFU/cell） 1.2一步生长实验（定量描述烈性噬菌体的生长规律） 以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，再高度稀释病毒－细胞培养物（避免二次吸附），或以抗病毒抗血清处理病毒－细胞培养物（去除过量的噬菌体，也是为了避免二次吸附）以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。体现3个时期：①潜伏期②突破期③平稳期 潜伏期中包含有隐蔽期(有感染性的病毒粒子从消失到出现这段时期) 潜伏期：噬菌体吸附到细胞到释放出新噬菌体的时间
病毒的复制及各类病毒的增殖过程 1 病毒的种类 病毒可分为亚病毒与真病毒两类：前者不具有完整的病毒结构，仅由某种核酸或蛋白质构成；后者通常由核酸及蛋白质外壳构成，部分病毒还具有囊膜结构。不同病毒所含核酸的种类、转录形成m ＲNA和合成蛋白质的方式迥异。因此，根据病毒的核酸类型和转录形成mＲNA的方式不同，可将病毒归为六大类：双链DNA病毒、单正链DNA( + DNA) 病毒、双链ＲNA病毒、单正链ＲNA( +ＲNA) 病毒、单负链ＲNA(－ＲNA) 病毒和逆转录病毒。以下介绍各类病毒的具体增殖步骤。 2 各类病毒的增殖过程 2.1 双链DNA病毒
腺病毒、疱疹病毒以及痘病毒等病毒均属于双链DNA病毒。 以疱疹病毒为例，说明此类病毒的主要增殖过程：①疱疹病毒包膜上的血型糖蛋白B与宿主细胞膜上的受体特异性识别并吸附； ②宿主细胞膜包裹疱疹病毒颗粒，形成吞噬泡，疱疹病毒颗粒通过吞噬作用而进入细胞质，并脱去包膜；③在宿主细胞的溶酶体作用下脱去蛋白质外壳；④病毒DNA进入宿主细胞的细胞核；⑤在ＲNA 聚合酶的帮助下，以病毒DNA为模板合成早期mＲNA并进入细胞质中；⑥早期mＲNA翻译形成早期蛋白，主要指与DNA复制相关的酶，如DNA聚合酶、脱氧胸腺嘧啶激酶等；⑦在解旋酶作用下，DNA双链打开，以打开的两条链为模板，遵循碱基互补配对原则，依赖合成的 DNA 聚合酶，合成子代DNA分子；⑧合成晚期mＲNA，并以此翻译成晚期蛋白，主要为病毒的结构蛋白，子代病毒DNA与结构蛋白装配形成子代病毒；⑨子代病毒从细胞核释放出来，同时披上包膜；⑩细胞膜通过胞吐的形式将子代病毒释放到体外。 2.2 单正链 DNA( + DNA) 病毒 代表病毒为细小病毒，此类病毒增殖的主要过程为：①形成复制中间体：单正链 DNA 病毒进行生物合成时，首先以亲代DNA 作模板，依赖复制酶，遵循碱基互补配对原则，合成其互补DNA 链，并与亲代DNA形成双链，作为复制中间型，含有亲代DNA的新合成的双链 DNA 继续复制；②转录和翻译: 不含亲代 DNA 的新
乙肝病毒复制过程 乙肝病毒DNA复制过程 不同于一个真正的生物体，病毒并不通过生长和分裂等方式繁殖自身，而是像铸造机器零件一样，按照一定的模具拷贝出来的。病毒DNA中包含有一些程序，指导病毒的遗传物质和其它一些结构蛋白组分增殖。另外，病毒DNA中还包含有一些信息，使得单一组分能够在细胞因子的帮助下，自发组装成新的病毒颗粒。 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA
（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA 链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV大有“赤膊上阵”
病毒的复制增殖过程 病毒不具有能独立进行代谢的酶系统，因此只有进入活的易感宿主细胞内，由宿主细胞提供合成病毒核酸与蛋白质的原料，如低分子量前体成分、能量、必要的酶等，病毒才能增殖。病毒增殖的方式不是二分裂，而是自我复制。即以病毒核酸为模板，在DNA多聚酶或RNA多聚酶及其他必要因素作用下，合成子代病毒的核酸和蛋白质，装配成完整病毒颗粒并释放至细胞外。病毒复制（replication）一般可分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段，称为复制周期（replication c ycle）。病毒经过复制产生大量的子代病毒，而此时，宿主细胞的生物合成则受到不同程度的抑制和破坏。 一、病毒复制周期 吸附（adsorption）吸附于宿主细胞表面是病毒感染的第一步。吸附主要是通过病毒体表面的配体蛋白与易感细胞表面特异性受体相结合。不同细胞表面有不同受体，它决定了病毒的不同嗜组织性和感染宿主的范围，如小RNA病毒衣壳蛋白特定序列能与人及灵长类动物细胞表面脂蛋白受体结合，而腺病毒衣壳触须样纤维能与细胞表面特异性蛋白相结合。有包膜病毒多通过表面糖蛋白结构与细胞受体结合，如流感病毒HA糖蛋白与细胞表面受体唾液酸结合发生吸附；人类免疫缺陷病病毒（HIV）包膜糖蛋白gp120的受体是人Th细胞表面CD4分子；EB病毒则能与B细胞CD21受体结合。无受体细胞不能吸附病毒，也不能发生
感染。细胞含受体数不尽相同，最敏感细胞可含10万个受体。吸附过程可在几分钟到几十分钟内完成。 穿入（penetration）病毒与细胞表面结合后，可通过胞饮、融合、直接穿入等方式进入细胞。胞饮类似吞噬泡，细胞内陷将病毒包进细胞浆内，无包膜病毒多以胞饮形式进入易感染动物细胞内。融合是指病毒包膜与细胞膜融合，包括病毒融合蛋白与细胞第二受体的作用，如HIV 与CCR5的结合。融合后再将病毒的核衣壳释放至细胞浆内。还有少数无包膜病毒在吸附时某些蛋白衣壳的多肽成分发生改变，从而可直接穿过细胞膜。 脱壳（uncoating）病毒脱去蛋白衣壳后，核酸才能发挥作用。多数病毒穿入细胞后，在细胞溶酶体酶的作用下，脱去衣壳蛋白释放病毒核酸。痘病毒脱壳过程复杂，分为两步。先由溶酶体酶作用脱去外壳蛋白，再经病毒编码产生的脱壳酶脱去内层衣壳，方能使核酸完全释放出来。 生物合成（biosynthesis）病毒脱壳后，进入生物合成阶段，即病毒利用宿主细胞提供的环境和物质合成大量病毒核酸和结构蛋白。病毒核酸在细胞内复制的部位因核酸类型不同而不同。除痘病毒外，DNA病毒都在细胞核内复制；除正粘病毒和逆转录病毒外，RNA病毒均在细胞浆内复制。 生物合成一般分早期和晚期两个阶段。早期蛋白合成阶段是病毒早期基因组在细胞内进行转录、翻译而产生病毒生物合成中必需的酶类及某些
干货丨病毒的复制及各类病毒的增殖过程 1 病毒的种类 病毒可分为亚病毒与真病毒两类：前者不具有完整的病毒结构，仅由某种核酸或蛋白质构成；后者通常由核酸及蛋白质外壳构成，部分病毒还具有囊膜结构。不同病毒所含核酸的种类、转录形成mＲNA和合成蛋白质的方式迥异。因此，根据病毒的核酸类型和转录形成mＲNA的方式不同，可将病毒归为六大类：双链DNA病毒、单正链DNA( + DNA) 病毒、双链ＲNA 病毒、单正链ＲNA( +ＲNA) 病毒、单负链ＲNA(－ＲNA) 病毒和逆转录病毒。以下介绍各类病毒的具体增殖步骤。 2 病毒的复制 病毒为颗粒状的非细胞结构，极其微小，通常以纳米为单位，营寄生生活。病毒侵入宿主细胞后，借助宿主细胞提供的核苷酸原料、氨基酸、核糖体及能源系统等，以病毒核酸为控制中心，合成子代病毒所需核酸与蛋白质等成分，最后在宿主细胞内装配成结构完整、具有一定侵染力的病毒粒子，这个过程称为病毒的复制。病毒正常复制周期分为六个阶段：吸附、侵入、脱壳、生物合成、组装和释放。 2.1 吸附 病毒感染宿主细胞的第一步就是吸附。绝大多数病毒的吸附可分为非特异性吸附和特异性吸附两个阶段：前者是指病毒依靠静电作用与宿主细胞接触而结合；后者是指病毒表面蛋白质作为抗原与宿主细胞膜上相应的受体特异性识别并结合。2.2 侵入无囊膜的病毒一般由细胞膜直接包裹吞入从而进入细胞，称为病毒胞饮。有囊膜的病毒除了通过细胞胞饮的方式进入细胞，还可通过囊膜与宿主细胞膜融合的方式，使病毒进入
细胞。2.3 脱壳即病毒内具有感染性的核酸从外壳内释放出来的过程。不同病毒脱壳方式迥异，大多数是在宿主细胞溶酶体作用下脱壳并释放出核酸。脱壳与侵入通常是连续进行的，如某些通过胞饮进入细胞的病毒在细胞壁或细胞膜表面同时进行脱壳和侵入，以膜融合方式入侵的病毒在与细胞膜融合时同时脱去包膜。 2.4 生物合成 病毒核酸进入宿主细胞后，利用宿主细胞的物质首先合成自身复制所必需的复制酶和一些抑制蛋白，然后合成子代病毒的核酸和结构蛋白，不同种类病毒的生物合成方式各不相同。2.5 组装病毒的组装是指新的病毒核酸与蛋白质衣壳装配在一起，形成结构完整、具有一定感染力的子代病毒。ＲNA 病毒和DNA病毒组装的位置具有一定差异，其中绝大多数DNA病毒在宿主细胞的细胞核中完成组装，而ＲNA病毒和痘病毒类一般在细胞质中完成组装。2.6 释放绝大多数无囊膜病毒同步释放，会对宿主细胞造成急性伤害，使得宿主细胞短时间内迅速死亡；而绝大多数有囊膜的病毒则需要经过内质网加工，最后以出芽的方式释放，在一段时间内逐个释出，宿主细胞死亡较缓慢。一个感染细胞通常可以释放出100～1000 个病毒。 3 各类病毒的增殖过程 3.1 双链DNA病毒 腺病毒、疱疹病毒以及痘病毒等病毒均属于双链DNA病毒。 以疱疹病毒为例，说明此类病毒的主要增殖过程：①疱疹病毒包膜上的血型糖蛋白B与宿主细胞膜上的受体特异性识别并吸附；②宿主细胞膜包裹疱疹病毒颗粒，形成吞噬泡，疱疹病毒颗粒通过吞噬作用而进入细胞质，并脱去包膜；③在宿主细胞的溶酶体作用下脱去蛋白质外壳；④病毒DNA 进入宿主细胞的细胞核；⑤在ＲNA 聚合酶的帮助下，以病毒DNA为模板合成早期mＲNA并进入细胞质中；⑥早期mＲNA翻译形成早期蛋白，主
乙肝病毒的复制过程 在医学上，病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA 称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA 聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA 颗粒。 复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步；脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG 及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBv DNA)，HBV 大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着HBv的复制的。 复制的第三步：入核 HBv DNA从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善，形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBv cccDNA)。这个cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝细胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目药物都难以通过这坚韧的核膜，因而对cccDNA 也无可奈何，但cccDNA却掌控着HBv所有的遗传信息，指令着HBv的复制。因此．现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难，这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制，“全部转阴”也只能是一种幻想。 复制的第四步：转录 HBV在这一阶段会以cccDNA为“模子”，像录音带似的把HBv cccDNA上的所有信息全都转录到“信息核糖核酸”(mRNA)上。这个转录过程需要人体内的酶类帮忙，因为所有的
病毒感染细胞实验整体 流程及原理 文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1）几乎可以感染所有类型的细胞
HIV病毒的复制 HIV的复制周期主要由以下五个环节构成： 1、感染。病毒外膜上的糖蛋白gp120识别宿主细胞的CD4受体，吸附于宿主细胞。病毒外膜与细胞膜融合，病毒粒子的遗传物质RNA进入胞浆。 2、逆转录。在逆转录酶RT作用下，单链RNA生成RNA.DNA 杂交链，继而脱下RNA，保留DNA单链，再以DNA负链为模板合成DNA双链。 3、整合。病毒双链DN A 进入细胞核，整合于宿主细胞染色体的DNA链中形成前病毒基因，随后潜伏。 以上1、2、3环节为HIV复制周期的第一期。以下第4、5环节是HIV复制第周期的第二期。 4、转录。在宿主细胞核中，细胞酶系在病毒长末端重复顺序（LTR）指导下将前病毒DNA大量转录成mRNA。后者在宿主内翻译成结构蛋白，调节蛋白和成熟蛋白。病毒RN A与蛋白组成病毒核心。 5、包装。病毒蛋白gag，pol和env前体多肽分裂与病毒RNA结合组成完整病毒粒子。成熟的子代病毒以芽生方式穿透T4细胞释放出来，获得类脂质膜, 再感染其它T4细胞。 逆转录过程需要逆转录酶（RT），RNA和DNA依赖的DNA聚合酶与RnaseH的相互配合，后者降解RNA-DNA杂合分子中的RNA.。在病毒DNA与宿主RNA 整合的时候，需要整合酶的作用，，病毒双链DNA基因组整合入细胞染色体中形成前病毒。当前病毒活化进行转录时，需要RNA聚合酶的催化，使病毒DNA 转录形成RNA. 目前为止抗HIV药物分为以下几类： 1、抗逆转录酶病毒药：包括核苷类药、非核苷类药、蛋白酶抑制药、侵入抑制药、整合酶抑制药 2、免疫调节药物：干扰素、白细胞介素2和丙种球蛋白等,都具有抗病毒、抗细菌感染和增强免疫调节的作用。 抗机会性感染药：
HBV复制过程：HBV基因组虽为双链环形DNA，但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。其过程为：①在由病毒和/或细胞来源的DNA-p作用下，正链首先延伸形成共价闭合环状DNA（Covalently Closed Circular DNA）。②以此为模板，通过宿主肝细胞酶的作用转录成复制中间体。③再以此为模板，通过逆转录酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此双链DNA部分环化，即完成HBV-DNA的复制。HBV突变株研究由于HBV复制方式有其特殊性，即mRNA中间体进行逆转录过程中，由于缺乏校对酶（Proofreading Engymes）易发生HBV-DNA序列内变异。①S区基因突变导致HBsAg亚型改变及血清HBsAg阴性、HBV-DNA阳性乙型肝炎，使临床诊断困难。一些人接种乙型疫苗后产生抗-HBs，但仍可被HBV的S区基因突变株感染，而逃避宿主的免疫反应。②前C基因区突变与HBV感染后免疫及重型肝炎发病有关。一般认为乙型肝炎患者HBeAg转阴，抗-HBe转阳，表示HBV复制活跃程度减弱，临床症状好转。然而，一些患者当HBeAg转阴后，仍有病毒复制及病情进行性发展，其血清中除检出HBsAg和抗-HBe外，还可检出HBV-DNA、抗-HBcIgM，肝内HBcAg阳性，排除其他致肝损害的原因，提示病情变化与HBV有关。其特点为不易自然缓解，常发展为肝硬化，抗病毒治疗反应差。经研究表明，此类患者系感染了前C基因突变HBV突变株。③P区基因突变可致HBV复制减弱或停止。④X区基因突变可使HBxAg合成障碍。近年发现一些HBV感染者抗-HBc始终测不出；有些恢复期患者也测不出抗-HBs，甚至有些患者HBV 标志均阴性，但能检出HBV-DNA，在肝细胞内和肝细胞膜上存有HBcAg和HBsAg。将这类患者血清感染黑猩猩可引起典型的肝炎表现。曾有学者称之为HBV2。近年研究表明，这些患者的血清中HBV-DNA序列分析，发现S区、C区、X区有多个点突变，提示HBV2为HBV的突变株。 ====================================================================== 由于HBV在复制过程中有一个逆转录的中间环节，其中的逆转录酶并不具 有校正修复的功能，因此HBV病毒与其它DNA病毒比较，变异的发生率可高 达l0倍以上，关于HBV变异的研究在近年已有较大的突破，对部分变异位点 的研究结果和解释基本一致，但仍有一些尚未明确的机理性问题需要进一步的 探讨。
乙肝病毒的复制过程 在医学上,病毒的繁殖被称之为“复制”,在复制的过程中,有两个很重要的因素:一个就是催化剂,另一个就是模板。没有这两个因素,乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就就是乙肝病毒DNA(即HBV-DNA)聚合酶。没有这种聚合酶的作用,乙肝病毒的复制就会停止。 乙肝病毒的基因组(HBV-DNA)就是由两条螺旋的DNA 链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状;另一条长度较短的正链,呈半环状。在感染肝细胞之后,这条半环状的DNA链就会以负链为模板,在催化剂──HBV-DNA聚合酶的作用下延长,最终形成完整的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA称做共价闭合环状DNA(即cccDNA),可以把它瞧作就是病毒复制的原始模板。模板形成后,病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板,利用肝细胞基因中的酶与DNA 聚合酶的“催化”,一段基因又一段基因地复制,形成负链与正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。 复制的第一步:黏附 HBV人侵人体后,依靠其外膜(表面抗原,HBsAg)能粘附在肝细胞膜上,当然,粘附的首要条件就是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功,HBv的外膜也就完成了它的使命,甩掉了外膜,HBV钻进肝细胞内。 复制的第二步;脱壳 HBV核心部分来到肝细胞内,在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG),这样,就暴露出了它最核心部分,即乙肝病毒核酸(HBv DNA),HBV大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因,就是它主宰着HBv的复制的。 复制的第三步:入核 HBv DNA从肝细胞浆内进入肝细胞核,在这里它要进一步发育完善,形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBv cccDNA)。这个cccDNA十分了得,它深深藏匿在肝细胞核内,而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目药物都难以通过这坚韧的核膜,因而对cccDNA也无可奈何,但cccDNA却掌控着HBv所有的遗传信息,指令着HBv的复制。因此.现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难,这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制,“全部转阴”也只能就是一种幻想。 复制的第四步:转录 HBV在这一阶段会以cccDNA为“模子”,像录音带似的把HBv cccDNA上的所有信息全都转录到“信息核糖核酸”(mRNA)上。这个转录过程需要人体内的酶类帮忙,因为所有的病毒
病毒感染细胞实验整体流程及原理 杨晓芳于2011年5月11日整理目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较