第二章生物细胞培养基制备过程与设备
所有的生物细胞都要不断地同外界进行物质和能量交换，都要进行新陈代谢，才能表现出生命活动，这时，就需要营养物质。营养物质包括碳源、氮源、微量元素、维生素等。利用生物细胞进行生物加工时，需要根据不同的细胞配制多种多样的培养基，有的细胞能利用淀粉，这时直接向培养基添加淀粉；有的仅能利用葡萄糖，这时就要用纤维素、半纤维素或各种工农业副产物来制备培养基。生物技术产业中大多数都利用纯种培养技术，这就要求对培养基中已有的杂菌进行去除或杀灭。
第一节液体培养基的灭菌
灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法大致有以下几种：化学灭菌法，电磁波、射线灭菌法，干热灭菌法，湿热灭菌法，过滤除菌法，火焰灭菌法。
发酵工业自从采用纯种培养以后，产物的产量和质量都有了很大的提高，同时对防止染菌的要求也更高了。目前的各种培养过程往往都要求在没有杂菌污染的条件下进行，由于培养过程中通常含有比较丰富营养物质，且培养基中常常带有各种微生物，因此很容易受到杂菌的污染，进而会产生各种不良的后果。
（1）由于杂菌的污染，使生物反应中的基质或产物因杂菌的消耗而损失，造成生
产能力的下降；
（2）由于杂菌所产生的一些代谢产物，或在染菌后改变了培养液的某些理化性质，使
产物的提取和分离变得困难，造成收率降低或使产品的质量下降；
（3）杂菌会大量繁殖，会改变反应介质的PH值，从而使生物反应发生异常变化；
（4）杂菌可能会分解产物，从而使生产过程失败；
（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解，而使生产失败等等。
由此可见，培养基灭菌是否彻底直接关系到生产过程的成败，轻则导致所需要的产品产量锐减，质量下降，后处理困难，重则使全部培养液变质，导致成吨的培养基报废，造成经济上的严重损失，这一点对大规模的生产过程更为突出。所以，为了保证培养过程的正常进行，防止染菌的发生，对大部分微生物的培养，包括实验室操作和工业生产，均需要进行严格的灭菌。工业上，培养基、发酵设备一般都采用蒸汽湿热灭菌。
一、湿热灭菌原理和影响灭菌的因素
在发酵工业中，对培养基和发酵设备的灭菌，广泛使用湿热灭菌法。工厂里，蒸汽比较容易获得，控制操作条件方便，是一种简单而又价廉、有效的灭菌方法。用湿热灭菌的方法处理培养基，其加热温度和受热时间与灭菌程度和营养成分的破坏都有关系。营养成分的减少将影响菌种的培养和产物的生成，所以灭菌程度和营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。
（一）灭菌动力学
微生物受热而破坏是指其生活能力丧失，微生物热死灭原因是细胞内的反应。
（1）对数残留定律
微生物受热死亡的原因，主要是因高温使微生物体内的一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性，从而导致微生物无法生存而死亡。微生物受热而丧失活力，但其物理性质不变。在一定温度下，微生物的受热死亡遵照分子反应速度理论。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随活菌数的减少而递减，即微生物的死亡速率与任一瞬时残留的活菌数成正比，如图2-1所示，大肠杆菌的死亡曲线为线性关系，称之为对数残留定律，也即反映为一级化学反应动力学为：
（2-1）
式中——残存的活菌数；
——灭菌时间，s；
——灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；
——活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。
上式通过积分可得：
（2-2）
式中——开始灭菌（t=0）时原有活菌数；
——经时间t后残存活菌数。
上式是计算灭菌的基本公式，灭菌速度常数是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样的温度下K值是不同的，值越小，则此微生物越耐热。
若要求灭菌后绝对无菌，即=0，则从上面公式可以看出灭菌时间将等于无穷大，这是不可能的，
故培养液灭菌后，以在培养液中还残留一定活菌数进行计算。工程上，通常以=10-3个/罐，即杂菌污染降低到被处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度，此数已满足生产要求。
（2-2）式是理论灭菌时间的对数残存规律公式。但实际上蒸汽加热灭菌时间则以工厂的经验数据来确定，通常高温灭菌时间约为15~30s，然后根据发酵类型不同在维持罐维持8~25min。对谷氨酸发酵，培养基粘度低，营养丰富，维持时间可采用8~10min。
90%死灭时间：所定条件为活的微生物90%死灭所需的时间，也称1/10衰减时间。
从公式2-2得：
则
（2-3）
当反应物的浓度为单位浓度时，则反应速度常数在数值上等于反应速度。故反应速度的大小表示微生物对热的抵抗能力的强弱，也说明微生物死灭的难易。值越小，则该微生物越耐热。细菌孢子（芽孢）对热的抵抗力高于营养细胞。
即使对于同一微生物，也受微生物的生理状态、生长条件及灭菌方法等多种因素的影响，其营养细胞和芽孢的比死亡速率也有极大的差异，就微生物的热阻来说，细菌芽孢是比较耐热的，孢子的热阻要比生长期细胞大得多。
（2）温度对死亡速率的影响
微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常数K与温度之间的关系可用啊累尼乌斯公式表示：
（2-4）
或
（2-5）
式中——频率常数，也称阿累尼乌斯常数s-1；
——气体常数，8.314J/mol?K；
——绝对温度，K；
——培养基成分分解所需，J/mol。
该式可绘成图2-2。
绝对温度的倒数[]
图2-2 微生物死亡与温度的关系
在灭菌时，温度T和时间t是两个重要参数，一般而言，提高温度或者延长时间，均可增加对杂菌的杀灭。但通常，我们采取提高温度的措施，而不用延长时间的途径。这主要是由于在培养基中加热灭菌过程中，常会出现这样的矛盾，即加热时杂菌固然被杀死，但培养基中的营养成分，也随之遭到分解和破坏，这是发酵生产中所不希望的。那么，如何既可达到灭菌要求，同时又不破坏或少破坏培养基中的有用成分呢？办法就是采用高的温度和短的时间来进行灭菌。对此，可对式进行分析而获得结论。如把式（2-5）微分，则可得：
（2-6）
经分析该式可见，越大，同样的便得到大的，这表明，随温度的变化大。所以，
是反映微生物热死或营养物受热分解，对温度敏感性的度量。已知微生物在受热死亡时的活化能，一般要比营养成分热分解的活化能大得多，为此，这就意味着当温度升高时，虽然营养物的受热破坏也要增大，但是，微生物死亡速率的增加，要比营养成分破坏速率的增加大得多。基于这一事实，我们便可实现既达到规定的灭菌程度，同时又尽量减少营养成分损失的两全其美的方法，这就是高温、瞬时灭菌法——HTST灭菌法。
生产实践证明，灭菌温度较高而时间较短比温度较低而时间较长要好。据此，可以在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。
二、连续灭菌流程及设备
培养基灭菌应尽量采用高温短时间的连续灭菌。培养基经连续加热、维持和冷却后进入发酵罐。
培养基的连续灭菌，就是将配好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。图2-3为连续灭菌过程中温度的变化情况。由图2-3可以看出，连续灭菌时，培养基可在短时间内加热到保温温度，并且能很快地冷却，因此可在比间歇灭菌更高的温度下进行灭菌，而由于灭菌温度很高，保温时间就相应地可以很短，极有利于减少培养基中的营养物质的破坏。
连续灭菌具有如下的优点：
（1）提高产量。与分批灭菌相比培养液受热时间短，可缩短发酵周期，同时培养基成分破坏较少。
（2）产品质量较易控制。
（3）蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。
（4）适宜采用自动控制。
（5）降低劳动强度。
在连续灭菌过程中，蒸汽用量虽平稳，但气压一般要求高于0.5Mpa（表压）。连消设备比较复杂，投资较大。采用连续灭菌时，发酵罐应在连续灭菌开始前先进行空消，以容纳经过灭菌的培养基。加热器、维持罐和冷却器也应先进行灭菌，然后才能进行培养基连续灭菌。组成培养基的耐热性物料和不耐热性物料可在不同温度下分开灭菌，以减少物料受热破坏的程度，也可将糖和氮源分开灭菌，以免醛基与氨基发生反应而生成有害物质。对于粘度过高或固体成分较多的培养基要实现连消困难较多，主要是灭菌的均匀度问题。设计这类物料的连消设备必须避免管道过长，或尽可能将淀粉质物料先行液化。
以下介绍几种国内外较为常用的连续灭菌流程，由于灭菌过程是加热和冷却的过程，所以这些设备所组成的流程并不是固定的。如采用喷射加热器加热而采用真空冷却有困难，也可采用其它冷却方式（如喷淋冷却器或板式换热器等）。
（一）连消塔——喷淋冷却流程
图2-4是一种连消塔、维持罐、喷淋冷却的连续灭菌流程。配好的培养基用泵打入连消塔与蒸汽直接混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器冷却至一定温度后进入发酵罐。连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配好的料液预热到60~70℃，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126~132℃）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40~50℃后，输送到预先已经灭菌过的罐内。
（二）喷射加热——真空冷却流程
图2-5是一种喷射加热、管道维持、真空冷却的连续灭菌流程。培养基（生培养液）用泵打入喷射加热器，以较高速度自喷嘴喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进入管道维持器，经一定维持时间后通过一膨胀阀进入真空闪急蒸发室，因真空作用使水分急骤蒸发而冷却到70~80℃左右，再进入发酵罐冷却到接种温度。这个流程的优点是：加热和冷却在瞬间完成，营养成分破坏最少，可以采用高温灭菌，把温度升高到140℃而不致引起培养基营养成分的严重破坏。设计得合适的管道维持器能保证物料先进先出，避免过热。但如维持时间较长时，维持罐的长度就很长，给安装使用带来不便，所以如酒精厂的液蒸煮等大多仍采用维持罐。
灭菌温度取决于喷射加热器中加入蒸汽的压力和流量，要保持灭菌温度恒定就需要使蒸汽的压力和；流量以及培养基的流量稳定，故宜设置自动控制装置，如果自动控制的滞后较大，也会引起操作不稳定而产生灭菌不透或过热现象。
另外，由于真空的影响，在蒸发室下面要安装一台出料泵，或将蒸发室置于离发酵罐液面10m以上的高处，否则物料就不能流进发酵罐而进入真空系统，这就带来了不方便，尤其是对于已经灭菌好的培养基来说，出料泵的密封要求很高才能避重新污染。这个问题也许是目前很多工厂不采用真空冷却的原因之一。
（三）板式换热器灭菌流程
图2-6为薄板换热器连续灭菌过程，流程中采用了薄板换热器作为培养液的加热和冷却器，培养液在设备中同时完成预热、灭菌及冷却过程，蒸汽加热段使培养液的温度升高，经维持段保温一段时间，然后在薄板换热器的另一段冷却，从而使培养基的预热、加热灭菌及冷却过程可在同一设备内完成。虽然利用板式热交换器进行连续灭菌时，加热和冷却培养液所需要的时间比使用喷射式连续灭菌稍长，但灭菌周期则较间歇灭菌小得多。由于待灭菌培养液的预热过程同时为灭菌培养液的冷却过程，所以节约了蒸汽及冷却水的用量。
培养基连续灭菌的优点是灭菌的温度较高，灭菌时间较短，培养基的营养成分受破坏的程度较低，从而保证了培养基的质量，同时由于连续灭菌过程不在发酵罐等设备中进行，提高了发酵罐等设备的利用率。当然与间歇灭菌过程相比，连续灭菌过程的不足之处是过程所需的设备较多，操作较为麻烦，染菌机会也相应较多。
培养基采用连续灭菌时，加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进行灭菌，然后才能进行培养基的连续灭菌。同时组成培养基的耐热性物质和不耐热性物质可在不同的温度下分开灭菌，以减少物质的受热破坏程度，也可将碳源与氮源分开灭菌，以免醛基与氨基发生反应，防止有害物质的生成。
（四）设备构造和计算
1．连消塔
又称加热器，是培养基于蒸汽混合加热至灭菌温度的设备。要求在20~30s或更短的时间内将料液加热至130~140℃。生产中一般用0.5~0.8Mpa的活蒸汽与预热后的料液直接接触而加热。
连消塔用内外两根管子套合组成（图2-7），内管开有45°向下倾斜的小孔，孔径一般为6mm，蒸汽由此喷出。孔距应从上到下减少，使蒸汽较为均匀。培养基由塔底进入，与小孔中喷出的蒸汽连续混合后在塔上部流出。培养基在塔内停留时间一般取20~30s；线速度要求<0.1m/s。
这种连消塔比较高大，钻孔、加工、安装等均不便，改革后的连消器如图2-8所示。培养基以较高流速从中间管喷入，蒸汽从管外环隙同时喷入，在器内进行混合，为了增加混合效果，器内设置一块弧形挡板。与近3m高的连消塔比较，尺寸大为减少，其高度仅为0.5m左右，使用效果也很好。此种形式的连消器实际上已接近于喷射加热器。
连消塔计算：
培养液在管间流动，线速度为，则：
（2-7）
式中——培养液流速，m/s；
——培养液流量，m3/h，蒸汽冷凝量使培养液量增加，但对灭菌设备中有关因素的影响是很小的，可以略而不计；
——外管直径，m；
——内管直径，m。
则塔高
（2-8）
式中——连消塔高，m；
——灭菌时间，s。
内管蒸汽喷孔总面积和孔数计算：
根据蒸汽消耗量（m3/h）等于从小孔喷出的蒸汽量（m3/h）得：
则
（2-9）
式中——蒸汽喷孔的总面积，m3；
——蒸汽喷孔的速度，m/s，通常采用25~40m/s
——加热蒸汽消耗量，m3/h。
加热蒸汽喷孔数为：
（2-10）
式中——喷孔数，个；
——喷孔直径，m。
2．维持罐
灭菌系统中的维持设备，主要是使加热后的培养基在维持设备中保温一段时间，以达到灭菌的目的，因此，也可称保温设备。维持设备一般不需另行加热，但必须在维持设备的外壁用绝热材料进行绝热，以免培养基冷却。维持罐为长圆筒形，高为直径的2~4倍，上下封头为球形，如图2-9所示。罐顶部设有人孔1，进料管2由圆筒上部侧面伸入后，在罐内通至下部，使料液自下向上流动，至上部侧面接管3流出，要防止进料管2上部弯头处受料液磨损而使料液短路，引起低温灭菌时间不够而染菌。罐上部留有空间，
以便安装压力表和排汽管。压力表管安装成向下弯，以免管内冷凝污水落入维持管内而污染料液，同时便于观察压力。圆筒中部有温度计测温孔4。罐的有效容积应能满足维持时间为8~25min的需要。停止操作时，料液由管5排尽。维持罐容积由下式计算：
（2-11）
式中——维持罐容积，m3；
——料液体积流量，m3/h；
——维持时间，min，取经验数据为8~25min，不同类型的发酵维持时间不同；
——充满系数，取0.85~0.9。
3．喷射加热器
喷射式加热器（图2-10）的特点是蒸汽和料液迅速接触，充分混合，加热是在瞬时内完成的。简单的喷射式加热器仅是一个喷嘴装置，蒸汽由喷嘴喷出，料液从侧面进入器内而被蒸汽加热。工厂中较常见的是一种在下游具有扩大室的喷射加热器。此种加热器的喷嘴部分与一般喷嘴不同，料液在中间进入，蒸汽则在周围环隙中进入，同时下游有一个扩大室以使料液进入，蒸汽则在周围环隙中进入，同时下游有一个扩大室以使料液在进入加热器时的流速约为1.2m/s左右，蒸汽喷口的环隙面积约为喷嘴外径的一倍，扩大管高度一般为1米左右。此种加热器结构简单，轻巧省料，且在操作过程中无噪声。
4．冷却设备
冷却设备是将已灭菌的培养基加以冷却的设备，通常采用的是喷淋冷却器，也可考虑用套管冷却器。
喷淋冷却器是将水通过喷淋装置均匀地淋在水平的排管上，以冷却管内的培养基。培养基一般由排管下部进入，而由上部排出，流体在管内的流速约为0.3m/s。它具有结构简单，清洗方便的优点，且由于部分淋下的水滴在管表面被高温的管壁所汽化，其传热效率较高，传热系数为300kcal/m2·h?℃左右，被广泛地用于连续灭菌过程中。
套管冷却器是一种内管走热培养基，内外管间的管隙中走冷却水的冷却器。操作时，冷热两流体流向相反，以提高平均温度差，节约用水。若将所制培养基代替冷却水，则培养基可获得预热的作用。此种冷却器与喷淋冷却器相比，消耗钢材较多，且内管有漏洞时不易被发现而引起严重污染，但其热利用较合理，传热系数较高，一般可达400 kcal/m2·h?℃。
三、分批灭菌过程与设备
培养基的分批灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。
规模较小的发酵罐往往采用分批灭菌的方法。这种方法不需要其它设备，操作简单易行，故获得较普遍采用。其缺点是加热和冷却所需时间较长，增加了发酵前的准备时间，也就相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利用率降低。所以大型发酵罐采用这种方法在经济上是不合理的。同时，分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。但是对于极易发泡或粘度很大难以连续灭菌的培养基，即使对于大型发酵罐也不得不仍然采用分批灭菌的方法。分批灭菌仍被许多工厂采用。
（一）分批灭菌操作要点
确保设备的严密度是防止染菌的重要因素。因此，在空罐或实罐灭菌前，发酵罐及附属设备必须全面进行严密度检查，在确实无渗漏情况下才开始灭菌。灭菌时应注意温度与气压是否对应。培养基及发酵设备的灭菌包括分批灭菌（也称实罐灭菌或实消）、空罐灭菌（空消）、连续灭菌（连消）和过滤器及管道灭菌等。
分批灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此分批灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。
要保证分批灭菌的成功，必须有：（1）内部结构合理（主要是无死角），焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象的发酵罐；（2）压力稳定的蒸汽；（3）合理的操作方法。
（二）分批灭菌的操作
图2-11是通用型发酵罐的管道配置示意图。在培养基灭菌之前，通常应先将与罐相连的分空气过滤器用蒸汽灭菌并用空气吹干。实罐灭菌时，先将输料管路内的污水放掉冲净，然后将配制好的培养基泵送至发酵罐（种子罐或料罐）内，同时开动搅拌器进行灭菌。灭菌前先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。各路进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要激烈；各路排汽也要畅通，但排汽量不宜过大，以节约用气量。在保温阶段，凡进口在培养基液面以下的各管道及冲视镜管都应进汽；凡开口在液面之上者均应排汽。无论与罐连通的管路如何配制，在实消时均应遵循“不进则出”的原则。这样才能保证灭菌彻底，不留死角。保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。在引入无菌空气前，应注意罐压必须低于过滤器压力，否则物料将倒流入过滤器内，后果严重！灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。
空罐灭菌（空消）即发酵罐罐体的灭菌。空消时一般维持罐压0.15~0.2Mpa，罐温125~130℃，保持30~45min；要求总蒸汽压力不低于0.3~0.35Mpa，使用汽压不低于0.25~0.3MPa。
（三）分批灭菌的计算
分批灭菌的计算主要是确定灭菌的时间。如果把微生物的热死亡动力学公式与阿累尼乌斯公式相结合，则可得
（2-12）
式中是对灭菌过程的灭菌要求，称为对数灭菌度，是一设计标准。如果杂菌的初始浓度等于N0（个
杂菌/毫升），发酵液总体积为VT（毫升），那么，有时也可写成
（2-13）
式中，为每批发酵液内的初始杂菌总数，该值随操作条件而定，可自和确定；则是灭菌后要求。我们由式2-13可见，如果最终要把杂菌全部杀灭，即=0，那么，该时需要的时间将为∞；如果灭菌后仅存留一个菌，那么这个菌，经过24小时之后，将分裂成272个（如果营养物足够使杂菌20分钟分裂一次），这是一个极大的数字，将会造成染菌，导致发酵的失败。由此可见，如果为
零，则需要无限长的灭菌时间，这是不可能的；如果为1，那么将导致染菌，也不允许。通常，我们可令=10-3，或1/1000。这10-3并非把杂菌分成1000分，而取其1分，实际上，它是指发酵失败的概率为千分之一。也就是说，在每一千次发酵过程中，由于其中有一次因灭菌不当，而残留了一个杂菌，从而导致了发酵的失败。若如此，=106（个/毫升），=10（米3）=107（毫升）及=1/1000，于是
这是整个分批灭菌周期内的总灭菌度。但是，分批灭菌是由加热、保温（或称维持）和冷却等不同阶段组成，这些不同的阶段，均能起到灭菌作用。可是，每阶段所起作用的大小并不相等，作为设计标准
应为各阶段所作贡献的总和，即
（2-14）
其中各阶段的贡献分别是
（2-15）
（2-16）
（2-17）
式中——是初始杂菌总数；
——加热到灭菌温度时杂菌的总数；
——灭菌保温后的杂菌总数；
——从灭菌温度冷却至发酵温度时杂菌的总数；
，，——分别为加热、保温和冷却所需的时间。
其中的因该时温度恒定，故把有关参数（如A、ΔE及T等）代入式2-16后，便可方便地获得。可是，其中的加热和冷却阶段，因是不稳定过程，温度随时间而异，而且温度—时间的关系又相当复杂，故通常难以解决。
Richards提出了一种简易捷算法，可求取加热、冷却阶段内的贡献和。
Richards捷算法是假定当温度超过100℃时，细菌芽孢开始被破坏；并且该破坏程度是随温度升高而增大。经实践证实，这一方法具有较大的准确性，并可使计算大为简化。基于这些假定，Richards对嗜热
脂肪芽孢杆菌被致死的或提出表2-1所示。该表数据适用于温度为101~130℃范围，并且，表中数据是根据每分钟温度变化为1℃时获得。因此，如果温度变化符合这一条件，那么由表2-1便可直接查得或。
表2-1 嗜热脂肪芽孢杆菌在加热和冷却时的
T℃T℃
100 —116 3.989
101 0.044 117 5.034
102 0.076 118 6.341
103 0.116 119 7.973
104 0.168 120 10.010
105 0.233 121 12.549
106 0.316 122 15.708
107 0.420 123 19.638
108 0.553 124 24.518
109 0.720 125 30.574
110 0.932 126 38.080
111 1.199 127 47.373
112 1.535 128 58.867
113 1.957 129 73.067
114 2.488 130 90.591
115 3.154
第二节淀粉质原料的蒸煮与糖化
生物质原料中所含的淀粉存在于原料的细胞之中，受到细胞壁的保护，不呈溶解状态。生物质原料进行蒸煮的目的是使植物组织和细胞膜彻底破裂，淀粉成为溶解状态进行液化；同时对进料进行灭菌；排除原料中的一些不良成分及气味。淀粉质原料通过蒸煮以后，把颗粒状态的淀粉变成了溶解状态的糊精，如果这时的糊精还不能被细胞直接利用，还必须采取添加糖化剂（麸曲、液体曲、糖化酶）的办法，把醪液中的淀粉、糊精转化为可发酵性糖等物质，作为生物细胞的碳源发酵产生酒精。这个将可溶性淀粉、糊精转化为糖的过程，生产中就叫做糖化。淀粉糖化的目的，是通过糖化酶将淀粉、糊精进行水解。糖化的作用也就是把溶解状态的淀粉、糊精转化为能够被生物细胞利用的可发酵性物质（当然也有不发酵性物质生成，这主要是由于转移葡萄糖苷酶等的作用），降低醪液的粘度，有利于酵母的发酵和酵液的输送。
一、连续蒸煮糖化
连续蒸煮糖化工艺与间歇蒸煮糖化工艺不同，前者的蒸煮糖化过程中，料液连续流动，在不同的设备中完成加料、蒸煮、糖化、冷却等不同工艺操作，整个过程连续化。而间歇蒸煮糖化，蒸煮糖化的整个过程都始终处于一个设备中，一锅一锅地糖化，糖化一锅又重换一锅。连续蒸煮糖化一般不需加水，它的浓度就能满足工艺的要求。其余各项工艺指标控制，基本上和间歇糖化相同，糖化时间略偏低，大约为20~30分钟，糖化效率为28~40％。
连续糖化工艺流程如图2-12所示：
连续蒸煮糖化设备有罐式、管式和柱式三种形式。
罐式连续蒸煮糖化，蒸煮温度较低，可节省煤耗，操作容易控制，设备结构简单，制造方便，为大、中型工厂广泛采用。
（一）蒸煮糖化设备
1．罐式蒸煮设备
图2-13所示为罐式连续蒸煮长圆筒形蒸煮罐。它是由长圆筒形封头焊接而成，粉浆用往复泵由下端中心进料口1压入蒸煮罐中，被加热蒸汽罐2喷出的蒸汽迅速加热到蒸煮温度，加热蒸汽管口与粉浆入口管口之间的距离约为200mm，蒸煮罐下封头为球形。此装置目的尽量减少噪音和震动，减少对下封头的磨损。蒸煮管保持压力约为0.3~0.35Mpa（表压），糊化醪从管3流出。为安装安全阀4和压力表5，顶部中心的糊化醪出口管应伸入罐内300~400mm，使罐顶部留有自由空间。为了防止压力表管被醪液堵塞，可将压力表做成垂直安装。从罐中部侧面管6引出部分糊化醪液去制备液体曲。蒸煮罐最易磨损的是下封头。由于该处有加热蒸汽喷入粉浆高速度的转动而与下封头内壁产生了摩擦，故下封头球形比锥形耐磨。长圆筒中下部侧面焊有4个罐耳架7，4个罐耳可以在同一水平上，也可以上下各一对，借以安装在支架的横梁上。在靠近加热位置上方有温度计测温口8。蒸煮时依据该温度自动控制加热蒸汽量。罐下侧有人孔9，用以焊接罐体内部焊缝和检修内部零件。加热蒸汽入口处须安装有止汽阀，以防蒸汽管路压力降低时醪液流失，甚至造成管路上其他装置堵塞。
为了避免过多的热量散失，蒸煮罐须安装良好的保温层。
罐式连续蒸煮的蒸煮罐或后熟器的直径不宜太大，因醪液从罐底中心进入后作返混运动，不能保证醪液先进先出，致使受热时间不均匀，可能有部分醪液蒸煮不透就过早排出，而另有局部醪液过热而焦化，因此罐式连续蒸煮罐数不能太少，宜采用3~6个，但罐数过多则压力降过大，后熟器压力过低，以致醪液压不到最后一个后熟器。故薯干类原料蒸煮压力较低，宜采用3~4个，玉米类原料压力较高，可采用5~6个。
国内外某些工厂先用加热器把粉浆加热到蒸煮最高温度后，再进入连续蒸煮罐，其后各罐不再供给加热蒸汽，使醪液在第一罐内较平稳地流动，减少对罐壁的磨损。
用粉浆加热器提高醪液的蒸煮温度，使蒸煮得到改善，能够提高连续蒸煮设备生产能力10~15%。
蒸煮时仅在粉浆加热器或蒸煮罐底部通入蒸汽，其后各罐均为后熟器，不再加入蒸汽。后熟器的作用是一定温度下，维持一定时间，使糊化醪进一步煮透。
糊化醪随着流动，压力下降，产生二次蒸汽，由最后一个后熟器分离出来，可供粉浆罐顶预热粉浆，故最后一个后熟器也为汽液分离器。如图2-14。罐式连续蒸煮罐和各后熟器几乎是充满醪液的，唯最后一个后熟器上部须留有足够的自由空间，以分离二次蒸汽，汽液分离器内的液位可用自动控制，也可用液位指示器指示液位。用手动控制醪液出口阀门，把醪液控制在50%醪左右的位置上。当蒸煮罐和各后熟器采用相同容积时，每个后熟器所需容积计算如下：
故：
（2-18）
式中——包括加热蒸汽冷凝掖的糊化醪量，m3/h；
——整个蒸煮时间，h，2小时或更长一些时间；
——蒸煮罐或每个后熟器的容积，m3；
——蒸煮罐和后熟器的数目；
——最后一个后熟器的充满系数，约为0.5；
长圆筒形后熟器圆筒部分的直径和高之比约为1：3~1：5。
2．柱式连续蒸煮设备
Ⅰ．流程
柱式连续蒸煮设备是在管式连续蒸煮设备的基础上改建的，比间歇蒸煮提高了出酒率。它的流程如图2-15所示。
柱式连续蒸煮的特点是高温快速蒸煮，预热后的粉浆经泵送入加热器，被高压蒸汽从相对方向喷射进行瞬间高温蒸煮，然后流入缓冲器，再均匀地流入后面几根柱子内，在一定温度下继续蒸煮。第一根柱子内装有锐孔，第二根柱子内装有挡板，料液经过锐孔和挡板缺口时，流速增快，压力发生骤变，原料细胞膜突然膨胀而部分破裂，细胞内容物流出，得到充分蒸煮。但柱子容积不大，料液在里面维持的时间不长，为使原料的淀粉糊化，一般在柱子后面再连接1~2个后熟器，使料液在一定温度下继续维持一定时间，保证淀粉糊化比较彻底。
Ⅱ．设备结构及设计计算
（1）加热器
加热器是利用高压蒸汽加热粉浆，使汽液相对喷射，紧密接触，能在短时间内达到较高的温度。
加热器是三层直径不同的套管，内层和中层管壁上都钻有许多小孔，各层套管都用法兰连接，以便拆卸。形状如图2-16所示。高压蒸汽从内、外层管进入，穿过小孔向粉浆液流两旁喷射，由于高压蒸汽从侧喷射，接触均匀，加热比较全面，故能在很短时间就达到蒸煮温度145℃~150℃。
加热器管壁上小孔开法有三种方式，一种是平开；一种是向上倾斜45°；一种是向下倾斜45°。孔向上倾斜能使蒸汽向上喷射与粉浆形成对流，缺点是增大了输送泵的阻力；孔向下倾斜，则蒸汽与粉浆并流，好处是降低了泵的阻力；平开则加工容易。一般都采取平开或向下倾斜，小孔直径为3~5mm，小孔分列若干排，每排4~8个，均匀分布于管壁四周，排与排之间的距离没有硬性规定，有的取等距，有的前密后稀。
加料器内管两端呈锥形或球形，主要是为了减少液流阻力。上端借进汽管固定在中层管壁上，下端则固定在支架上，这样通汽时才不致摆动。内管底部开3~4个小孔，用以排除积水。
加热器管壁上小孔分布区叫“有效加热段”。粉浆在…有效加热段“停留时间一般很短，为15~25s。为了在这短时间内能达到要求的温度，粉浆在此区域内的流速以不超过0.1m/s为好。
加热器的计算主要是计算“有效加热段”的长度、各层管子的直径、小孔孔径、小孔个数和小孔布置。
例：已知粉浆量为23717kg/s或21.6m3/h，比热为0.853kcal/（kg?K），加热蒸汽压力为7kg/cm2（表压）。试设计计算加热器的主要几何尺寸。
解：①“有效加热段”的长度计算：计算“有效加热段”长度分几个步骤：（1）根据粉浆量和流速计算粉浆流道的截面积；（2）选定内管和中间管的直径，使其环隙截面积等于或接近于计算的粉浆流道的截面积；（3）假定粉浆在“有效加热段”停留时间，再从粉浆量、停留时间和流道截面积算出“有效加热段”长度。
已知粉浆量为23717kg/h，粉浆温度为70℃。假定加热蒸汽压力为7kg/cm2，查饱和蒸汽表得该蒸汽温度为158℃，其热焓为662.3kcal/kg。
由于已知粉浆的比热为0.853kal/（kg?K），则所需加热蒸汽量为
，kg/h
于是粉浆加热后的总量为23717＋3530＝27247（kg/hr），其中干物质百分数为
查表得其比重为1.084，则加热后粉浆的体积为
，m3/h
取粉浆流速为0.1m/s，则粉浆流道截面积＝，m2
选用内管为159×8，中间管为331×10，两管间环隙截面积＝
（m2），与计算的截面积很接近，故所选用的管径恰当。
假定粉浆在“有效加热段”停留时间为20s，则“有效加热段”长度为
，m
再按照外管与中间管之间的环隙截面积等于内管截面积的原则计算外管直径。
，m
②小孔直径和个数计算：小孔个数的计算是根据加热蒸汽消耗量和蒸汽通过小孔的速度算出小孔的总面积，然后确定每个小孔直径，算出每个小孔面积。再从总面积和每个孔的面积计算小孔个数。
蒸汽消耗量已算得为3527kg/h，从饱和水蒸汽表查得在压力7kg/cm2下，饱和水蒸汽的比容为
0.2454m3/kg，则所需加热蒸汽的体积为3527×0.2454＝0.866，m3/h。
取小孔的蒸汽速度为25m/s，则小孔总面积为
，m2
取小孔的蒸汽速度为25m/s，则小孔总数为个。为安全计，增加5％，于是小孔总数＝489×1.05＝519个。
小孔的布置按内管与中间管壁上孔数大致相等的原则，在内管壁上分33排，每排8孔共264孔；中间壁上分22排，每排12孔，共264孔总计小孔528个。
内管和中间管壁上小孔各排的中心距都采取等距，则内管壁上小孔各排的中心距m；
中间管壁上小孔各排的中心距m，（2.2为“有效加热段”长度）。
（2）柱子
①柱式连续蒸煮设备柱子为长圆筒形，直径450~550mm，高约10m，一般用大直径无缝钢管或铸铁管，两端锥顶，锥高约40mm。柱子根数一般为3~5根，每根柱子分若干节，每节长约1m，节与节之间用法兰连接。第一、第三两根柱子内有1~2处管径缩小（由于节与节之间连接处装有两个锥形帽，形成锐孔，锐孔直径约100~120mm）。第二根柱子内装两块倾斜的圆缺形挡板，这两块挡板是交错排列，一个向左倾斜30°，一个向右倾斜30°，板距为柱子全高的1/3。挡板为切去弓形的圆缺板，板的直径比柱子内径略小，切去弓形的宽度约为板直径的1/4。柱子里装置锐孔和挡板都是使料液在流动中突然缩小和扩大，使细胞膜部分破裂，并且发生骚扰，得到充分混合后面两个柱子则不装什么。柱子与柱子用圆弯并联，柱子两端入口直径约为100~120mm。
②柱子的计算柱子的计算主要是几何尺寸的计算，根据料液在柱子里停留时间内的流量来计算。
例：已知糊化醪量为25.13m3/h，试设计计算柱子的几何尺寸和根数。
取糊化醪在柱子里停留时间为23min，则柱子的总容积为
，m3
选用530×15的无缝钢管，每根长10m，则柱子根数为
，根
3．管式连续蒸煮
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
浅谈细胞生物学未来情况 11生科111003015 康明辉 摘要：著名生物学家威尔逊早在20世纪20年代就提出“一切生物学关键问题必须在细胞中找寻”。细胞是一切生命活动结构与功能的基本单位，细胞生物学是研究细胞生命活动基本规律的科学。细胞生物学的研究范围广泛，其核心可归结为遗传和发育问题。遗传是在发育中实现的，而发育又要以遗传为基础。当前细胞生物学的主要发展趋势是用分子生物学及物理、化学方法，深入研究真核细胞基因组的结构及其表达的调节和控制，以期从根本上揭示遗传和发育的关系，以及细胞衰老、死亡和癌变的原因等基本生物问题，并为把遗传工程技术应用到高等生物，改变其遗传性提供理论依据。20世纪90年代以来，分子生物学取得很大进展，这些进展促进了细胞结构和功能调控在分子水平上的研究 关键词：细胞遗传生物学发育 细胞生物学的研究范围广泛，其核心可归结为遗传和发育问题。遗传是在发育中实现的，而发育又要以遗传为基础。当前细胞生物学的主要发展趋势是用分子生物学及物理、化学方法，深入研究真核细胞基因组的结构及其表达的调节和控制，以期从根本上揭示遗传和发育的关系，以及细胞衰老、死亡和癌变的原
因等基本生物问题，并为把遗传工程技术应用到高等生物，改变其遗传性提供理论依据。20世纪90年代以来，分子生物学取得很大进展，这些进展促进了细胞结构和功能调控在分子水平上的研究。 目前对细胞研究在方法学上的特点是高度综合性，使用分子遗传学手段，对新的结构成分、信号或调节因子的基因分离、克隆和测序，经改造和重组后，将基因（或蛋白质产物）导入细胞内，再用细胞生物学方法，如激光共聚焦显微镜、电镜、免疫细胞化学和原位杂交等，研究这些基因表达情况或蛋白质在活细胞或离体系统内的作用。分子遗传学方法和细胞生物学的形态定位方法紧密结合，已成为当代细胞生物学研究方法学上的特点。另一方面，用分子遗传学和基因工程方法，如重组技术、、同源重组和转基因动植物等，对高等生物发育的研究也取得出乎意料的惊人进展。对高等动物发育过程，从卵子发生、成熟、模式形成和形态发生等方面，在基因水平的研究正全面展开并取得巨大进展。自从“人类基因组计划”实施以来，取得了出乎意料的迅速进展。2000年6月，国际人类基因组计划发布了“人类基因组工作框架图”，可称之为“人类基因草图”，这个草图实际上涵盖了人类基因组97％以上的信息。从“人类基因组工作框架图”中我们可以知道这部“天书”是怎样写的和用什么符号写的。2001年2月，包括中国在内的六国科学家发布人类基因组图谱的“基本信息”，这说明人类现在不仅知道这部“天书”是用什么
第一章绪论 （一）名词解释 1.细胞学 2.细胞生物学 3.医学细胞生物学 （二）填空题 1.细胞生物学是从、和三个水平上研究细胞生命活动的科学。 2.细胞是生物体和的基本单位。 3.细胞生物学的发展可分、、和四个阶段。 4.1841 年Remak在观察鸡胚的血细胞时，发现了细胞的分裂；其后Flemming在动物细胞中、Strasburger在植物细胞中发现了分裂。1883 年Van Beneden、1886 年Strasburger分别在动、植物细胞中发现了分裂。 5.1944 年Avery等在微生物的实验中证明了是遗传物质。 6.1953 年和共同提出了DNA 分子的结构模型。 7.1958 年Meselson等利用放射性同位素与梯度离心法，分析了DNA 的复制过程，证明了DNA 的复制是。 8.R.Feulgen于1924年发明了染色法，用于检测细胞核内的。 （三）选择题 1.最早发现细胞并对其命名的学者是 A. R.Hook B. Leeuwenhook C. R.Brown D. W .Flemming E . C.Darvin 2.细胞学说的创始人是 A.Watson and Crick B.Schleiden and Schwann C. W.Flemming D. R.Brown E. R.Hook and Leeuwenhook 3.在1855 年提出“一切细胞只能来自原来的细胞”论点的学者是 A.Remark B.W.Flemming C. R.Virehow D.R.Brown E. Schleiden
4.最早发现细胞直接分裂（无丝分裂）的学者是 A.W.Flemming B.Remark C. R.Virehow D.R.Brown E.Schwann 5.最早在动物细胞中发现间接分裂（有丝分裂）的学者是 A. Strasburger B. W.Flemming C. Remark D. Boveri E. Feulgen 6.最早在动物细胞中发现减数分裂的学者是 A. Van Beneden B. Strasburger C. Flemming D. Remark E. Boveri 7.Van Beneden和Boveri在1883年发现的细胞器是 A.线粒体 B.中心体 C.高尔基体 D.细胞核 E.纺锤体 8.Banda在1897年发现的细胞器是 A.中心体 B.线粒体 C.细胞核 D.高尔基体 E.纺锤体 9.最早提出染色体遗传理论的学者是 A.Schleiden and Schwann B.Watson and Crick C.R.Hook and Leeuwenhook D.Boveri and Sutton E. Van Beneden and Boveri 10.细胞遗传学的创始人是 A.Mendel B.Morgan C. Flemming D. Remark E. Feulgen 11.在1943 年应用高速离心机从活细胞中将细胞核和各种细胞器分离出来, 并研究其生理活性的学者是 A. Feulgen B. Brachet C. Casperson D. Cloude E. Ruska 12.在1924 年首创核染色反应，测定了细胞核内DNA的学者是 A. Cloude B. Brachet C. Feulgen
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
基础细胞培养基通常指基础合成培养基，主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、辅助物质（核酸降解物、氧化还原剂等）。 据不同细胞和研究目的，选用合适培养基,?还可补加新成分。?如杂交瘤中常用DMEM加丙酮酸钠、2-巯基乙醇（相当于胎牛血清可透析组分的作用）。 合成培养基使用时加5-30%血清。 1． 199细胞培养基及其改良品种 1950年Morgan等设计，除BSS外，含有53种成分，为全面培养基，广用于各类细胞培养，广泛用于病毒学、疫苗生产。 2． BME细胞培养基 基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle设计，BSS＋12种氨基酸＋谷氨酰胺＋8种维生素。简单、便于添加，适于各种传代细胞系和特殊研究用，在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMEM等。 3． MEM细胞培养基 低限量Eagle培养基（Minimal Essential Medium），1959年修改，删去赖氨酸、生物素，氨基酸浓度增加，适合多种细胞单层生长，有可高压灭菌品种，是一种最基本、试用范围最广的培养基，但因其营养成分所限，针对生产之特定细胞培养与表达时，并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 4． DMEM细胞培养基及其改良品种 DMEM由Dulbecco改良的Eagle培养基，各成份量加倍，分低糖(1000mg/L)、高糖(4500mg/L)。生长快，附着稍差肿瘤细胞、克隆培养用高糖效果较好，常用杂交瘤的骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。 5． IMEM细胞培养基 IMEM由Iscove's改良的Eagle培养基，增加了几种氨基酸和胱氨酸量。 6． RPMI-1640细胞培养基 Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，针对淋巴细胞培养设计，BSS＋21种氨基酸＋维生素11种等，广泛适于许多种正常细胞和肿瘤细胞，也用做悬浮细胞培养 7．Fischer’s细胞培养基 用于白血病微粒细胞培养。 8． HamF10、F12细胞培养基 1963年、1969年Ham设计，含微量元素，可在血清含量低时用，适用于克隆化培养。F10适用于仓鼠、人二倍体细胞，特适于羊水细胞培养。 9． DMEM/F12细胞培养基 DMEM和F12细胞培养基按照1:1比例混合效果最佳，营养成分丰富，且可以使用较少血清，或作为无血清培养基的基础培养基。 10． McCoy5A培养基 1959年MeCoy为肉瘤细胞设计，
医学细胞生物学实验课教学大纲 (供临床医学专业七年制使用) 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年6月
前言 细胞生物学是生命科学中最重要的基础学科和前沿学科，细胞生物学课程是培养医学生基础理论知识、实践能力、创新能力的关键环节。优秀的细胞生物学课程高等医学院校课程体系建设的重要内容。结合汕头大学医学院人才培养目标，我们将锻造理论与实践、临床与基础重组渗透，能力培养贯穿始终的、特色鲜明的医学细胞生物学课程体系作为本课程建设的目标，力争通过本课程的学习使临床医学专业学生掌握细胞生物学的基本原理、研究方法，掌握相关疾病的分子机制，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践、科学研究奠定良好基础。 实验课教学是理论教学的重要补充，是人才培养的关键环节。在实验教学上我们以科研与教学相结合、科研应用于教学为指导思想，坚持实验内容的先进性和综合性，创造条件改善和提高学生的动手能力，为培养学生基本科研技能奠定基础。力争通过实验课学习使学生掌握医学细胞生物学的基本理论和实验技能，提高学生独立分析问题和解决问题的能力，培养学生学习的主动性，使其具备一定的科研思维和科研能力，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践和科学研究奠定良好基础。 七年制细胞生物学实验课程包括基础性实验-综合设计性实验-科研活动三个层次的实验课课程体系。通过该课程体系对七年制学生实验能力进行全程培养。本教学大纲规定基础性实验和综合设计性性实验的内容。科研活动的内容和要求由学生和教师讨论后自行确定。 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年5月
七年制医学细胞生物学实验课内容 实验项目名称学时层次教学手段 实验一数码互动系统使用及细胞 基本形态观察4 基础实验 数码互动系统讲授 示教讨论 实验二细胞生理活动观察 4 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验三细胞染色体标本制备 与观察4 基础实验 数码互动系统 讲授、示教讨论 实验四细胞的原代与传代培养 6 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验五细胞组分的分离与鉴定>12 综合实验讨论多媒体 实验六细胞骨架对细胞、细胞器的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验七药物对细胞增殖与凋亡 的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验八定位信号与蛋白亚细胞 定位>12 综合实验 讨论 多媒体 大学生科研活动项目科研活动综合应用多种教学手段
培养基配方 1 斜面菌种保存培养基 1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 1.2麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml （视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 2.1平板计数琼脂培养基 将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。 3志贺氏菌检测
3.1 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115℃高压灭菌15min。 3.2 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2ml。
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显
供基础医学院临床17、20班参考使用 医学细胞生物学简答题集锦 第一章绪论 1.简述细胞生物学形成与发展经历的阶段 （1）细胞的发现与细胞学说的建立：R.Hook最早发现细胞并命名为cell，施莱登和施旺建立细胞学说。 (2)细胞学的经典时期：细胞学说的建立掀起了对多种细胞广泛的观察和描述的热潮，主要的细胞器和细胞分裂活动相继被发现。 (3)实验细胞学时期：人们广泛的应用实验的手段研究细胞的特性、形态结构和功能。 (4)分子生物学的兴起和细胞生物学的诞生：各个学科相互渗透，人们对细胞结构与功能的研究达到了新的高度。 第二章细胞的统一性与多样性 1.细胞膜的流动性有什么特点，膜脂有哪些运动方式，影响膜脂流动性的因素有哪些？ （1）膜脂既具有分子排列的有序性，又有液体的流动性；温度对膜的流动性有明显的影响，温度过低，膜脂转变为晶态，膜脂分子运动受到影响，温度升高，膜恢复到液晶态，此过程称为相变。（2）膜脂的运动方式有：侧向扩散、旋转运动、摆动运动、翻转运动，其中翻转运动很少发生，侧向扩散是主要运动方式。（3）影响流动性的因素：脂肪酸链的长短和饱和程度，胆固醇的双重调节作用，卵磷脂/鞘磷脂比值越大膜脂流动性越大，膜蛋白与周围脂质分子作用也会降低膜流动性。此为环境因素（如温度）也会影响膜的流动性，温度在一定范围内升高，流动性增强。2.简述膜蛋白的种类及其各自特点，并叙述膜的不对称性有哪些体现 (1)膜蛋白分为膜外在蛋白、膜内在蛋白、脂锚定蛋白。膜外在蛋白属于水溶性蛋白，分布在膜的两侧，与膜的结合松散，一般占20%-30%； 膜内在蛋白属于双亲性分子，嵌入、穿膜，是膜功能的 主要承担者，与膜结合紧密，占70%-80%。 脂锚定蛋白通过共价键与脂分子结合，分布在膜两侧， 含量较低。 (2)膜的内外两侧结构和功能有很大差异，称为膜的不对称 性，这种不对称决定了膜功能的方向性。 膜脂：磷脂和胆固醇数目分布不均匀，糖脂仅分布于脂 双层的非胞质面。膜蛋白：各种膜蛋白在质膜中都有一定 的位置。膜糖类：糖链只分布于质膜外表面。 3.比较说明单位膜模型与液态镶嵌模型有哪些不同点 单位膜是细胞膜和胞内膜等生物膜在电镜下呈现的三夹 板式结构，内外两层为电子密度较高的暗层，中间是电子 密度低的明层，“两暗夹一明”的结构叫做单位膜，单位膜 仅能部分反映生物膜的结构特点。 流动镶嵌模型强调膜的流动性和膜蛋白分布的不对称性 以及蛋白质与脂双层的镶嵌关系。认为膜蛋白和膜脂均能 产生侧向运动，膜蛋白有的在膜表面、有的嵌入或横跨脂 双分子层。该模型能解释膜的多种性质，但不能说明具有 流动性的细胞膜在变化过程中如何维持膜的相对完整。 第四章细胞连接、细胞黏附和细胞外基质 1.什么是细胞连接，细胞连接有哪些类型 细胞表面可与其它细胞或细胞外基质结合的特化区称为 细胞连接。分为紧密连接、黏着链接和通讯连接。 紧密连接的特点是细胞膜之间连接紧密无空隙，一般位 于上皮细胞间。 黏着链接中，与肌动蛋白纤维相关的有黏着带:分布于上 皮细胞，黏着斑:分布于上皮细胞基部；与中间丝有关的有 桥粒：分布于心肌和上皮，半桥粒：分布于上皮细胞基底 部。 通讯连接分为缝隙连接和突触，缝隙连接几乎存在于所 有类型的细胞之间，突触仅存在于可兴奋细胞之间用来传 到兴奋。 2.什么是细胞外基质，叙述细胞外基质的组成 细胞外基质是指由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白 质和多糖类大分子所构成的网络结构。 （1）纤维成分：如胶原、弹性蛋白。胶原是细胞外基质最 基本成分之一，是动物体内含量最丰富的蛋白，刚性及抗 张力强度最大。 （2）糖胺聚糖和蛋白聚糖：透明质酸是唯一不发生硫酸化 的糖胺聚糖，是增殖细胞和迁移细胞的细胞外基质的主要 成分，透明质酸向外膨胀产生压力，使结缔组织具有抗压 的能力；蛋白聚糖见于所有结缔组织和细胞外基质及许多 细胞的表面，可与多种生长因子结合，可视为细胞外的激 素富集与储存库，有利于激素分子进一步与细胞表面受体 结合，完成信号转导。 (3)层粘连蛋白和纤连蛋白：层粘连蛋白是个体细胞外基质 中出现最早的蛋白，对基膜的组装起到关键作用。纤连蛋 白主要介导细胞黏着，也能促进巨噬细胞和其它免疫细胞 迁移到受损部位。 3.叙述黏着带和黏着斑的区别 粘着带是细胞与细胞间的粘着连接,而粘着斑是细胞 与细胞外基质相连。 ①参与粘着带连接的膜整合蛋白是钙粘着蛋白,而参 与粘着斑连接的是整联蛋白,即细胞外基质受体蛋白; ②粘着带连接实际上是两个相邻细胞膜上的钙粘着 蛋白与钙粘着蛋白的连接,而粘着斑连接是整联蛋白与细 胞外基质中的粘连蛋白的连接,因整联蛋白是纤粘连蛋白 的受体，所以粘着斑连接是通过受体与配体的结合; 第五章小分子物质的跨膜运输 1. 以Na+-K+泵为例说明细胞膜的主动转运过程 Na+-K+泵又称Na+-K+ATP酶，由α和β两个亚基组成，均 为穿膜蛋白。在α亚基的外侧（朝向胞外）有两个K+的结 合位点，内测有3个Na+的结合位点和一个催化ATP水解 的位点。 工作中，细胞内的Na+与大亚基上的Na+位点相结合，同 时ATP分子被催化水解，大亚基改变空间构象，使3个Na+ 排除胞外，同时K+与α亚基外侧面相应位点结合，α亚基 空间结构恢复原状，将2个K+输入细胞，完成循环，每次 循环消耗一个ATP分子，3个Na+出胞，2个K+入胞。 第六章胞质溶胶、蛋白酶体和核糖体 1.核糖体有几种，合成的蛋白质在功能上有什么不同 核糖体分为游离核糖体和附着核糖体。 分布于细胞质基质中的核糖体是游离核糖体，主要合成 细胞本身所需的结构蛋白。附着在内质网膜和核膜表面的 是附着核糖体，主要合成外输性蛋白质。 第七章内膜系统与囊泡运输 1.内质网有哪些类型，在细胞中的作用是什么 内质网主要由脂类和蛋白质组成，是单层膜结构，分为 粗面内质网和光面内质网。 粗面内质网主要呈囊状，表面有核糖体附着，主要功能 是合成、加工修饰、分选转运一些蛋白质，提供核糖体附 着的支架。 光面内质网不合成蛋白质，是脂类合成和转运的场所， 并参与糖原的代谢，是细胞解毒的场所（肝细胞），SER特 化成肌质网可作为肌细胞储存钙离子的场所。 2.叙述高尔基体的组成，及主要功能 高尔基体是一种膜性囊泡复合体，由扁平囊泡、小囊泡、 大囊泡组成。 高尔基体是细胞内蛋白质运输分泌的中转站，是胞内物 质加工合成的主要场所，参与糖蛋白的加工合成、蛋白质 的水解加工、胞内蛋白质分选和膜泡定向运输的枢纽。 3.简述分泌蛋白的运输过程 ①核糖体阶段：合成并转运分泌蛋白；②内质网阶段： 运输并粗加工分泌蛋白；③细胞质基质运输阶段：分泌蛋 白以小泡的形式脱离粗面内质网并移向高尔基复合体与其 结合；④高尔基体加工修饰：分泌蛋白进一步在高尔基复 合体内进行加工，并以囊泡的形式释放到细胞质基质；⑤ 储存与释放：释放时，囊泡浓缩发育为分泌泡，与质膜融 合，释放到体外。 4.以肝细胞吸收LDL为例，说明受体介导的胞吞作用的过 程 肝细胞需要利用胆固醇合成生物膜时，细胞合成LDL受 体并分散嵌入细胞膜，当LDL与受体结合后，细胞膜向内 凹陷形成有被小窝。LDL受体集中在有被小窝内不断内陷， 进入细胞，脱离细胞膜形成有被小泡。 有被小泡脱去网格蛋白被摸与其它囊泡融合形成内体， 内体内LDL与受体分离，受体返回细胞膜，LDL被溶酶体 酶降解。如果游离胆固醇过多，LDL受体和胆固醇就会暂 停合成，这是一个反馈调节的过程。 5.叙述信号肽假说的内容 新合成的蛋白质分子N端含有一段信号肽，该信号肽一 经合成可被胞质中的信号识别颗粒（SRP）识别并结合，通 过信号肽的疏水性引导新生肽跨脂双分子层进入内质网腔 或直接整合在内质网膜中。 信号肽具有决定蛋白质在胞内去向或定位的作用。 第八章线粒体 1. 为什么说线粒体是一个半自主性的细胞器? 线粒体有自己的DNA(即mtDNA)，存在线粒体核糖体， 通过自己的蛋白质合成系统可以进行mtDNA的复制转录 翻译。 然而mtDNA的信息量少，只能合成近10%的线粒体蛋白， 绝大多数线粒体蛋白质仍依靠核基因组进行编码，再转运 进线粒体中；构成线粒体的蛋白质合成系统的许多酶仍依 靠核基因编码合成。 故线粒体是一种半自主性细胞器。 2.线粒体的半自主性有哪些体现 线粒体有自己的mtDNA，是动物细胞质中唯一含有DNA 的细胞器。有自己的核糖体和蛋白质合成系统，供mtDNA 复制转录翻译。遗传密码相较其它细胞有差异。有自己的 物质转运系统，指导线粒体蛋白运输进线粒体，不与细胞 质交换DNA和RNA，也不输出蛋白质。 3.画图显示线粒体的结构，并表明各部分名称（答案略） 4.说明线粒体基粒的结构组成和功能 基粒又称ATP酶复合体，由头部、柄部、基部组成； 头部又称偶联因子F1，具有酶的活性，能催化ADP磷酸 化生成ATP；柄部是一种对寡霉素敏感的蛋白质，能抑制 ATP的合成；基部又称偶联因子F0，起到连接F1与内膜的 作用。 5.叙述化学渗透假说的内容 线粒体内膜是完整的、封闭的，内膜中的电子传递链是 一个主动转移氢离子的体系，电子传递过程像一个质子泵， 将氢离子从内膜基质泵至膜间隙，由于膜对氢离子不通透， 形成膜两侧的浓度差，质子顺浓度梯度回流并释放出能量， 驱动结合在内膜上的ATP合酶，催化ADP磷酸化合成ATP。 第九章细胞骨架 1.何谓细胞骨架?细胞骨架有哪些类型和功能? 细胞骨架是指真核细胞质中的蛋白质纤维网架体系，细
细胞生物学实验汇总
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实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【方法步骤】 1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体 3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。 4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性 （1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起） （2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 ①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺 ⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇 ⑨0.17M 丙酮 【实验结果】 1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。对照组未凝血，实验组凝血。 2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。
VOLAB细胞生物学实验室规划设计 一、细胞生物学实验的定位与实验内容 细胞生物学是当今生命科学中的重要基础学科和前沿学科，对于学生们一个入 学考试的基本要求，通过综合考虑， VOLAB对于生物细胞实验室规划设计更胜 一筹，实现了实验室规划设计时的创新和科研能力。实现了现代化实验室设计 的一些基本原理。 细胞生物学教学内容量大面广，对学生的知识、能力和素质具有直接和长远的 影响。教学内容要反映当前国际生命科学的发展，细胞生物学发展日新月异， 新内容层出不穷。因此，要求学生牢固掌握细胞的基本结构和功能及各细胞器 间的关系的基本知识，并且能够了解细胞生物学的热点领域中的研究进展和未 来的发展趋势，包括细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、基因表达 与调控等内容。 细胞生物学实验室设计应根据理论教学大纲，让通过显微镜了解各种细胞器的 的结构和功能，通过基础训练使学生掌握细胞化学显示技术、染色体技术、细 胞培养技术以及细胞器分离技术。通过综合设计实验培养学生对细胞生物学的 研究兴趣和勇于探索科学真理精神，使学生能够从生命现象中发现细胞生命活 动的内在本质和规律，能够运用已学到的细胞生物学知识去研究和探索生命科 学中与细胞生物学有关的课题，最终达到提高学生分析问题与解决问题的能力 和创新能力的目的，为本科生今后从事生命科学的研究与深造打下坚实的基础。 本科细胞生物学实验根据不同专业方向的要求，实验学时一般在24～48学时之间，细胞生物学实验内容的选择既要考虑对细胞生物学理论知识进行验证，巩 固和加强基础理论知识的理解，又要熟悉细胞生物学研究的一些基本方法，培 养细胞生物学实验设计和科研能力；更重要的是使学生能够通过综合设计实验 加强学生的创新思维能力。因此，必须强调实验室设计内容的先进性，综合性 实验内容的典型性，设计性实验内容的创新性。 细胞生物学实验主要包括三个部分，第一部分主要是显微镜技术和细胞形态学 观察以及部分细胞化学技术，第二部分为细胞生物学基本实验技术，第三部分 为综合设计实验，特别是设计内容可以让学生自由选题，开展与细胞生物学相 关的课题研究，鼓励学生进入教师的科研课题，为学生提供更好的实验环境。
关于医学细胞生物学实验教学的几点体会 发表时间：2017-09-15T11:57:15.953Z 来源：《临床医学教育》2017年8月作者：张云齐 [导读] 医学细胞生物学是医学与细胞生物学结合的一门学科，是医学专业的基础课程，也是一门实验性很强的学科，为医学生学习生理、生化、微生物、临床检验等奠定重要的基础。 武汉中原医院武汉市 430000 【摘要】医学细胞生物学是一门重要的基础医学类课程。由于其内容繁杂、概念抽象，学生难以掌握，教学难度较大。应本着边实践边研究的原则，理论和实验教学相结合，在实验教学中从教学内容及教学手段和考核方法等方面进行研究和探讨，提高学生主动学习的积极性和兴趣，从而提高教学质量，培养高素质的医学人才。 【关键词】医学细胞生物学实验教学教学改革教学方法 医学细胞生物学是医学与细胞生物学结合的一门学科，是医学专业的基础课程，也是一门实验性很强的学科，为医学生学习生理、生化、微生物、临床检验等奠定重要的基础。医学细胞生物学实验课独立于理论教学体系，又与理论教学密切相关，在理论知识的验证和理解方面有着理论课无法代替的作用，因此医学细胞生物学教学必须注重学习能力与创新能力的培养，要力求培养学生独立思考、独立操作的能力，敏锐的观察能力，以及科学分析、归纳、总结问题的能力，培养高素质、综合能力强的人才，是新形势下实验教学改革的一项重要而艰巨的任务。我们经过总结医学细胞生物学理论与实验教学中的经验，对临床、药学等专业的医学细胞生物学实验教学改革进行了一些尝试和摸索，有了一些体会，现从实验内容、实验教学方法和考核方法等方面进行总结。 一优化实验教学内容培养医学生科学素质 根据医学细胞生物学实验的教学目的，我们在强调细胞生物学实验基本操作的基础上，结合学理论知识及学科知识的更新与进展，以及科研工作的实际需要，完善了实验内容体系，选择注重结合临床医学知识，增加探索性和综合性的实验，共开设有24个学时，6个实验。医学细胞生物学是一门实验性很强的学科，理论课上的概念、原理和规律都需要通过实验推导和论证，实验教学是医学细胞生物学课程的主要组成部分之一，实验内容是对细胞生物学理论的验证和补充。例如。通过对细胞有丝分裂各个时期细胞内形态结构的观察，能够使学生对有丝分裂这一动态过程有更直观和深刻的理解。 医学细胞生物学作为生命科学的前沿学科，新的技术和手段不断涌现，并且许多方法在医学领域都得以应用。因此实验教学的内容本身必须不断更新，除了经典的细胞生物学实验内容外，其他如光学显微镜技术、电子显微镜技术、细胞的有丝分裂与减数分裂、细胞化学技术、细胞器的观察与显示等新的实验内容应尽可能地增添进来，以涵盖细胞生物学前沿知识和技术方法。近年来，我们根据实验条件的改善逐步增加了细胞生理的一些实验内容，如细胞吞噬和细胞融合等，并且计划继续增加有关免疫荧光细胞染色内容，如细胞的原代与传代培养、细胞增殖和细胞凋亡的诱导，以及观察绘制细胞生长曲线等。这些实验旨在培养学生实验设计能力和综合分析能力，使学生能够用所学过的理论知识和实验技术解决实际问题，培养学生的创新意识，这是高校培养创新人才的重要环节之一。 二运用多元化实验教学方法激发学生的学习兴趣 在重视基础实验教学的基础上，改变传统灌输式的教学，建立以学生为中心的教学模式，灵活运用多种教学方法和手段，鼓励学生发现、思考和探索，培养并激发学生兴趣，增进教学效果。应用启发式教学、PBL教学模式和开放式教学等多种方法组合加强对实验课程的监控，在某些综合性、验证性实验课中，采用实验与课堂分析讨论相结合的形式，充分调动学生的主观能动性，使学生在构建广博而灵活的理论知识基础之上，能真正地掌握一些细胞生物学最基本的实验技术。 1.启发式教学法 采用启发式教学，引导学生积极思考，培养学生思维能力。例如，在讲授细胞蛋白质分布和显示实验时，可以向学生提出以下问题：蛋白质种类有哪些、分别有什么化学性质、根据其化学性质采用什么样的方法进行显色才能确定蛋白质在细胞中分布位置等。这样，一方面调动了学生的学习积极性，另一方面，鼓励学生运用理论知识进行积极思考，加深对实验原理的理解，掌握实验方法。 2.PBL式教学法 PBL式教学是近年来兴起的一种新式教学模式，是在实验教学的相关环节中以问题为中心展开讨论的一种教学方法。PBL模式实验教学能促进师生间的互动交流，激发学生的自主学习兴趣，提高学生对某一方面知识、资料的查找和自我观点的表达，是增强学生综合素质的有效手段，是现代教育中颇具潜力的一种教学模式。教师在实验课的课前、课中和课后有计划有步骤地向学生提出问题，学生学习时以一个问题为起点，由此带出一系列相关的基础知识的问题。其中，问题设计和选择的好坏直接关系到最终的教学效果。我们对生物技术专业学生进行了探索研究性实验教学，收到了良好的效果，具体为：带教教师布置相关实验课题，以每4～5位同学自由组成小组后通过图书馆和上网查阅相关的参考文献后，由其中一位同学做好PPT在实验课堂上演示实验设计方案，带教教师予以点评及修正，其他同学参与讨论。这样可以充分调动学生的学习积极性，培养学生主动分析问题、小组成员间分工协作、查阅相关文献资料、运用所学知识解决实际问题的能力。PBL模式实验教学打破了传统的以学科为基础，以教师为中心，以课堂讲授为主的教学模式，是将医学细胞生物学和其他临床或基础学科相结合的一种教学方法，能与多种教学模式相融合，是一个自学、讨论、再自学、再讨论的学习过程，学生成为学习和教学的主体。将PBL模式融入到细胞生物学实验教学后，发现学生的自学能力及独立分析解决问题的能力明显提高，同学们能更深入地学习和理解细胞生物学的相关实验内容，同时也增强了学生书面材料的整理归纳能力及口头表达能力等。 3.开放式教学 所谓开放式实验教学，指的是实验资源、实验内容、实验时间、教学方法和教学评价等对学生开放，充分发挥学生的主体作用，提倡其自主学习，提高其动手能力和创新能力的实验教学模式。对进行开放式实验教学的实验室应实行全天候开放制，使学生能够合理利用时间，自行安排实验计划，随时可以到实验室进行实验，大大丰富了教学的多元化和多样性，满足了不同层次学生学习的需求。开放式实验教学可由学生自己选定实验内容，制订实验步骤，选择仪器设备，处理、分析实验结果和实验数据等，在此过程中教师可以为学生提供解答实验中出现的问题等方面的服务，主要是起一个把关作用。在开放式实验教学中，教师的主导作用应着重于启发、引导，充分发挥学生的积极主动性；教师应指导学生放手去做，鼓励学生多尝试。在教学评价方面，对学生实验能力的评价，不能只重视实验的结果，更要重视实验的过程，特别是实验过程中学生所表现的独立分析问题、解决问题的能力及创新意识等。除以上几种教学方式之外，我们还对五年制临床本科专业学生进行了双语实验教学，提高学生的英语学习能力，掌握必要的专业词汇，为学生英文文献查阅提供了扎实的基