提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展
肖生科1,2 王磊2 陈毓荃1
(1西北农林科技大学生命科学学院,杨凌 712100;2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,结合具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。
关键词: 巴斯德毕赤酵母 酵母表达系统 基因表达
The Study on Improving Expression Levels of H eterologous
G ene in Pichia pastoris
Xiao Shengke1,2 Wang Lei2 Chen Yuquan1
(1College of L if e Sciences,Northwest Sci2Tech U niversity of A gricult ure and Forest ry,Yangli ng 712100;
2Biotechnology Research Instit ute,Chi nese Academy of A gricult ural Sciences,Beiji ng 100081)
Abstract: As a eukaryote expression system,Pichia pastoris has been widely used in genetic engineering,which has many merits in the gene expression,protein process and secretion.The gene expression is influenced by a number of factors,such as the structure of gene,secretion signal peptides,methanol concentration,induction phase,temperature, PH,and promoter etc.These factors make some heterologous genes express unstably or express a little.This article ana2 lyzes these factors and reviews how to im prove expression levels of heterologous genes in Pichia pastoris.
K ey words: Pichia pastoris Y east expression system G ene expression
动物、植物、微生物作为生物反应器为外源基因的表达提供了理想的环境,是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容,也是生命科学研究领域的热点之一[1]。大肠杆菌被誉为是外源蛋白质表达的“工厂”,其具有易操作性,生长速度快,培养条件简单等优势。但是,大肠杆菌是低等的原核生物,不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所———内质网和高尔基体。虽然许多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达,但有些表达的产物缺乏天然的生物活性或结构。哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低,产业化生产造价昂贵,不易普遍推广使用[2]。酵母是单细胞低等真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性,同时又具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统,还能分泌外源蛋白到培养液中,利于纯化[3]。
1 利用巴斯德毕赤酵母表达外源基因的优缺点
酿酒酵母(S.cerevisiae)是首先被用来作为外源基因表达的宿主菌,然而其表达重组蛋白有一定的局限性,使其产业化应用受到了限制[1]。出芽酵母(Kl uyverom yces lactis)表达外源基因时与酿酒酵母相似,但表达量偏低,也不利于推广应用和规模化生产。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲基营养型酵母,其乙醇氧化酶启动子(AOX)已被分离、克隆,这种酵母已经发展成为外源蛋白表达非常成功的宿主[4]。人们已在巴斯德毕赤酵母中已成功表达了多种外源蛋白,如IGF21和人血清蛋白已通过临
生物技术通报
?综述与专论? B IO TECHNOL O G Y BULL ETIN 2004年第2期
床试验;乙肝表面抗原在南非已作为小单元疫苗投放市场[4];人重组白细胞介素11(rhL211)[5]、人血管内皮生长因子受体Flt2l胞外区223loop[6]、血管生成抑制因子(K4K5)[7]、抗Ⅳ型胶原酶单链抗体[8]等医药用蛋白均成功表达。
与其他表达系统相比,巴斯德毕赤酵母有以下诸多方面的优点:①在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源,但不存在象细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题[9]。②在缺少葡萄糖的情况下,巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一的碳源生长[10]。表达实际上是利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子,从而启动乙醇氧化酶的表达,在有乙醇氧化酶存在的条件下进一步催化甲醇的代谢,进行重组蛋白质的表达。③具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境,使生产的蛋白具有天然的高级结构及生物学活性。④有两个基因编码乙醇氧化酶基因———A O X1、A O X2。其中A O X1基因的表达主要受较高水平的甲醇诱导和调节。巴斯德毕赤酵母既保持了酿酒酵母的优点,还能大幅度提高外源蛋白的产量[9]。⑤许多在大肠杆菌中不能表达的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中得到了有效的表达,其方便的操作和低廉的成本使毕赤酵母表达系统极具市场潜力。⑥表达分泌的蛋白质常被O2糖基化或N2糖基化,其中主要是在蛋白质氨基酸序列的Asn2X2SerΠThr位点处进行N2糖基化,以高甘露糖型的糖基化形式存在,寡糖链的长度一般为8～14个甘露糖残基[9]。与酿酒酵母相比较,巴斯德毕赤酵母在表达蛋白质过程中是适度的糖基化修饰,使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白。此外,如果是糖蛋白,还经高尔基复合体对糖链的进一步剪切,使表达蛋白的糖链不含α123甘露糖,避免了酿酒酵母中的免疫原性问题,使表达的糖蛋白更适于治疗用途[10]。
尽管巴斯德毕赤酵母在表达外源蛋白有以上优势,但是外源基因在表达过程中受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,使外源蛋白的表达随环境条件的变化而不稳定,甚至一些蛋白的表达量会很低或不表达。因此,通过对这些可能影响外源基因表达的各种因素进行系统的分析,得出提高外源蛋白表达量的可能途径就具有重要的理论和实践意义。
2 提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达量的途径
2.1 优化基因内部结构
外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达量高低首先受到外源基因的内部结构的影响,也是表达成败的首要因素。可以通过以下几种途径优化基因内部结构以实现外源蛋白的表达。①优化mRNA5′端非翻译区(5′U TR)的核苷酸序列和长度,mRNA的非翻译区对蛋白表达的影响主要表现在mRNA的翻译水平上。A O X1mRNA的5′U TR 长114nt,富含A+U。目的蛋白mRNA应尽可能具有与A O X1mRNA相近,最好是相同的5′U TR。一般地,目的基因编码序列的第一个A TG应尽可能接近,最好处于A O X1A TG的位置[11]。Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5′U TR相同后表达水平提高50倍以上[12]。同时,一个适当长度的5′U TR可极大地促进mRNA有效地翻译。②起始密码子旁侧序列改造:如果起始密码子周围容易形成RNA二级结构序列,将会阻止翻译的进行,通过RNA折叠分析可找到可能阻碍翻译正常起始的二级结构,然后利用替代密码子重新设计并调整翻译起始区及其旁侧序列,对基因进行改造[13]。③A2T序列改造:目的基因的特性对表达的影响被认为是一种种属特异性的现象[14]。有些基因内部富含A2T序列,可在转录的过程中提前终止而导致仅产生低水平或截短的mRNA[11],给基因的表达带来困难,因此在不改变翻译蛋白质密码子的条件下去掉A2T序列,除去mRNA中可能形成终止结构的区域,使目标蛋白得到表达。④基因人工合成:在不改变氨基酸组成的前提下,将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子,可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。在酵母中表达量较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子[15]。在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍[16]。⑤氨基酸序列改造:蛋白质氨基酸序列中如果含有高度复杂的胱氨酸结
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构基序,这种结构可能是影响合成效率的因素之一,因此可改变这部分的碱基,消除复杂的胱氨酸结构基序[17]。
2.2 分泌信号的改造
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分为胞外和胞内两种表达情况,表达的蛋白要分泌到胞外必须经过信号序列的引导[17]。信号肽与目标蛋白相融合,从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到胞外。最常用的信号肽是来源于酿酒酵母的A因子信号肽和巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽,其中以A 因子信号肽最为成功,也是使用最广泛的信号肽,它能促进多种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[4]。但有时在表达一些蛋白的过程中,A因子信号肽用就不能引导外源蛋白分泌或不能有效地分泌到胞外,而使胞外目标蛋白的浓度极低,给后面的分析和检测带来不便。因此,改造信号序列,引导目标蛋白高效的胞外分泌也可提高目的蛋白的表达量。
信号肽对不同的异源蛋白分泌效率会有很大的差异,有些外源蛋白甚至不能被A因子和酸性磷酸酶信号肽分泌,需要新的信号肽才能使外源蛋白分泌[18]。有些信号肽的分泌效率还受胞内mRNA的积累水平、培养条件和诱导条件的影响[19]。在A因子中间插入EEAEAEAEP K共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高2倍以上[10]。有报道,利用菊粉酶的信号肽(ISP)序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了β2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列在巴斯德毕赤酵母能够很好地引导重组蛋白分泌到细胞外,分泌效率不低于A因子信号肽[20]。
2.3 调整甲醇诱导的浓度和诱导时间
大多巴斯德毕赤酵母表达系统是利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子来进行外源蛋白表达的[17]。甲醇的浓度直接影响细胞的生长和蛋白质的表达。研究发现,不同的甲醇浓度导致不同的蛋白表达量。有报道,酵母中外源蛋白在甲醇浓度为0.7%(VΠV)的条件下表达量较高,并且随甲醇的浓度的提高(<3%)能显著地提高蛋白的表达量[17]。利用摇瓶诱导表达过程中甲醇容易挥发,浓度逐渐减少从而使蛋白的表达量下降,因此,诱导培养期间维持甲醇的浓度将直接关系到表达量多少。此外,诱导时间也影响表达量的高低,在诱导期间,分别按24hr、36hr、48hr、72hr、96hr不同时间取样分析,发现外源蛋白随着时间的延长其表达量逐渐增加,但在72hr 表达量已接近最高,过多的诱导时间其表达量的提高并不显著。
2.4 选择合适的培养温度
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白适宜的温度为30℃,温度达到32℃时所有的蛋白表达都会停止[17]。在酵母生长或高量表达时会释放出大量的热量,因此,整个发酵过程中进行温度的调节,热交换,加热、冷却装置等都是必不可少的。另外,一些蛋白质对培养温度要求较高,必须在合适的温度条件下才能得到较好的表达。如鲱鱼的抗冻蛋白在23℃时表达量最高并且减少了错误折叠的积累,在其他温度条件下则不表达或表达量极低[21]。一般情况下,巴斯德毕赤酵母表达期间的温度不应高于30℃,但不排除特殊蛋白质的特殊表达条件。
2.5 选择高表达的启动子
巴斯德毕赤酵母表达最常用的启动子为乙醇氧化酶AOX1,AOX2启动子是甲醇诱导型启动子[17]。如果外源蛋白不能表达或表达量过低,可以选择其他强启动子进行表达。如P G AP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是一种组成型启动子[22]。使用P G AP 在发酵时不需要甲醇诱导,不需更换碳源,工艺简单,而且产量更高,所以成为替代PAox1的最强有力的启动子[11]。Doring等分别用p G APZ B和p PICZ B来生产兔肾肽载运蛋白(rPEPTZ)和小人肠肽转运蛋白(hp EPTZ),前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍,看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时P G AP比PAox1更理想[15]。另外,PFLD1(依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动子)[23]是以甲醇或甲胺为单一碳源的诱导型启动子,也是一种高水平表达的启动子。
2.6 筛选高拷贝转化子
一般情况下,转化子所含的表达盒的拷贝数越高,其外源蛋白的表达水平也越高。多拷贝整合有利于充分发挥表达潜力。最近的研究显示,在1～8整合拷贝数范围内,乙肝表面抗原(HbsAg)表达量随基因剂量的增加而成比例升高[24]。获得高拷贝转化子的方法有:(1)利用同尾酶向载体中多次插入
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2004年第2期 肖生科等:提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展
首尾相连的表达盒,构建一个含多拷贝表达盒的载体[11]。研究报道,获得最高含有8个乙肝表面抗原(HbsAg)表达盒重复序列的载体,将其整合入宿主菌株GS115基因组,同时去除A O X1基因,构建Muts型,可引起HBsAg的mRNA稳定增加,从而使HBsAg蛋白表达量增加[25];(2)使用一种包含巴斯德毕赤酵母的HIS4基因和细菌的卡那霉素抗性基因Tn903Kanr基因的载体。细菌的卡那霉素抗性基因使巴斯德毕赤酵母菌能抗G418药物,抗性越强,拷贝数越高[26]。(3)使用含细菌Shble基因的载体,它包含Zeocin抗性基因,可直接根据抗药性进行筛选。理论上表达量会随基因拷贝数的增加而上升,但也有少数例外,即拷贝数增加对表达产生负效应[11]。高拷贝低表达的原因可能在于mRNA翻译、蛋白折叠效率的低下,而对于一些分泌效率低的蛋白,过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制。
2.7 阻止外源蛋白降解
外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的过程中同时伴随着一定量的蛋白酶的表达。因此,表达的外源蛋白就存在被降解的可能,在一定程度上影响蛋白质的表达量,同时,还给目的蛋白的纯化带来难度。为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采用以下几种方法:①改造巴斯德毕赤酵母表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定[15]。②培养基中添加蛋白胨或酪蛋白水解物等物质作为蛋白酶的底物[27]。
③由于巴斯德毕赤酵母能忍耐较宽的p H范围(p H3.0～7.0),因此可调节溶液p H值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解[15]。研究表明:某些可溶性的膜结合蛋白在p H5.0的条件下表达量最高。此外,在培养基中加入少量的TritonX2114或蛋白酶抑制剂可提高表达量[9]。④突变外源蛋白基因的个别位点,改变其蛋白序列中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏[27]。⑤降低甲醇诱导表达时的培养温度[15],Mei M等通过将诱导表达时的温度由30℃降至25℃,半乳糖氧化酶表达量提高4倍[28]。
2.8 选择合适的酵母菌生长密度
一般来讲,在诱导培养过程中,酵母菌生长的密度越高,菌体的生物量越大,则总的表达量亦应该越高。但是,密度越高培养基中氧和营养供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性都会对菌体产生影响[15]。因此,高密度并不一定意味着高表达。此外,培养基的组成及生长状况也与表达量有关,如在表达mEGF时,在BMM Y培养基中单拷贝转化子表达量为20μgΠL,而在不含蛋白胨和酵母提取物的基本培养基中表达量少于1μgΠL[29]。
综上所述,巴斯德毕赤酵母表达系统是一个较好的被广泛使用的真核表达系统,具有许多优点,但是由于表达的外源蛋白质的复杂性和多样性,以及外源基因与酵母基因组重组的情况及表达调控的途径还不十分清楚的情况下,使得特定外源基因的高效分泌表达不可能一蹴而就。随着对巴斯德毕赤酵母研究和认识的进一步深入,相信人们会利用该表达系统高效生产出人类所需要的大多数活性蛋白,在基因工程产品产业化、商品化进程中,发挥越来越大的作用。
参考文献
1 马兴元,谭建华,朱平,等.中国兽医学报,2003,23(1):98～101. 2 Heckney RC.TrendsBiotech,1994,12(11):456～463.
3 BruelC,Cha K,ReevesPJ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97
(7):.3004～3009.
4 华慧,周思翔,王正荣.外国外医学生物医学工程分册,2003.26
(3):112～117.
5 朱剑昆,许志详,黄伟达,等.中国医学科学院学报,2001,23(2): 127～131.
6 马骊,王小宁,张智清,等.分子与细胞免疫学,2001,2:61～65.
7 官孝群,王跃祥,吴良成,等.生物工程学报,2001,17(2):126～130.
8 阎锡蕴,汤健,刁爱坡.微生物学通报,2001,28(1):48～52.
9 G eoff,PLin,Cereghino,et al.Current Opinionin Biotechnology, 2002,13:329～332.
10 熊爱生,彭日荷,李贤,等.生物化学与生物物理学报,2003,35
(2):154～160.
11 李洪钊,李亮助,孙强明,等.微生物学报,2003,43(2):288～292.
12 Sreekrishna K,Barr KA,HoardSA,et al.Y east,1990,6(special is2 sue):S4471.
13 Sreekrishna K,BrankampRG,Kropp KE,et al.G ene,1997,190:55～62.
14 ClareJJ,ScorerCA,BuckholzRG,et al.Methods MolBiol,1998, 103:2091.
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化:与野生型对照相比,在生长了35天之后,表达V Hb的转基因烟草植株平均干重增加80%～100%,叶绿素和尼古丁分别增加30%～40%和34%。转基因烟草中叶绿素水平增加,可能是由于V Hb增加了A TP和氧的供应量,它们均参与叶绿素生物合成中的几步反应。因为已知增加叶绿素的含量会导致增加植物的生长,所以在表达V Hb的转基因植株中增加的叶绿素含量至少会部分促进转基因植株的生长。另外,由于V Hb与氧亲和力适度并位于整个胞质溶胶中,从而可以使细胞中有较稳定的氧浓度。除此之外,V Hb还可能有其他一些功能,例如:清除氧自由基、作为一种末端氧化酶、还原过氧化物酶以及抑制种子中不饱和脂肪酸的氧化等,这些可能也有助于增加转基因植株的生长。
综上所述,v gb基因在各种细胞中表达,不同程度地促进了细胞的生长,并提高了它们利用能量的效率,如大肠杆菌中的蛋白质合成量明显增加,而碳源的消耗和产酸量没有提高。vgb基因在多种原核与真核生物中表达效果良好,表明它在溶氧为限制条件的生物反应器中,尤其在工业化的大规模、高密度微生物和动、植物细胞培养方面具有巨大的应用前景。
参考文献
1 Hardison RC.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:5675～5679.
2 Tyree B,Webster DA.J Biol Chem,1978,253:6988～6991.
3 Wakabayashi S,Matsubara H,Webster DA.Nature,1986,322: 481～483.4 Dikshit K L,et al.Nucleic Acids Research,1990,18:4149～4155. 5 Khosla C,Bailey J E.J Molec Biol,1989,210:79～89.
6 Dikshit K L,Webster DA.G ene,1988,70:377～386.
7 Khosla C,Bailey J E.Nature,1988,331:633～635.
8 Bailey J E,Sburlati A,Hatzimanikatis V,et al Biotechnol Bioeng, 1996,52:109～121.
9 K aur R,Pathania R,Sharma V,et al.Applied and Environmental Microbiology,2002,68(1):152～160.
10 Khosla C,Bailey J E.Mol G ene G enet,1988,214:158～161. 11 Khosla C,Bailey J E.J Bacteriol,1989,171:5995～6004.
12 Verderber E,et al.J Bacterology,1997,179(14):4583～4590. 13 Hart RA,K allio PT,Bailey J E.Appl and Environ Microbiol, 1994,60(7):2431～2437.
14 Boeman S,Webster DA.J G en Appl Microbiol,1982,28:35～
43.
15 Tsai PS,K allio PT,Bailey J E.Biotechnol Prog,1995,11:288～293.
16 Magnolo SK,Leenutaphong DL,DeModena JA,et al.BioΠTechn2 ology,1991,9:473～476.
17 吴奕,等.生物工程学报,1996,12(2):177～182.
18 章银梅,等.遗传学报,2000,27(2):183～188.
19 Chen R,Bailey J E.Biotechnol Prog,1994,10:360～364.
20 Khosravi M,Webster DA,Stark BC.Plasmid,1990,24:190～194.
21 Liu SC,Webster DA,Stark BC,Appl Microbiol Biotechnol,1995, 44:419～424.
22 Tsai PS,Hatzimanikatis V,Bailey J E.Biotechnol Bioeng,1996, 49:139～150.
23 K allio PT,Bailey J E.Biotechnol Prog,1996,12:31～39.
24 Chen W,Hughes DE,Bailey J E.Biotechol Prog,1994,10:308～313.
25 Brewin NJ,Flavell RB.Nature Biotechnol,1997,15:222～223.
(上接第26页)
15 聂东宋,梁宋平,李敏.吉首大学学报(自然科学版),2001,22
(3):112～116.
16 姚斌,张春义.中国科学(C辑),1998,28(3):237～243.
17 https://www.doczj.com/doc/8b7911148.html,.
18 Brierley RA.MethodsMolBiol,1998,103:149～1771.
19 ScorerCA,ClareJJ,McCombieWR,et al.R Biotechnology,1994, 12:181～184.
20 韦宇拓,甘凤琼,苏华波,等.广西农业生物科学,2001,22(1):40～44.
21 LiA,XiongF,LinQ,d’AnjouM,DaugulisAJ,Y angDSC,HewCL:.
Protein Expr Purif,2001,21:438～445.
22 Waterham H R,Digan M E,K outz PJ,et al.G ene,1997,186
:37～44.
23 Shen S,Sultar G,Jeffries T W,et al.G ene,1998,216:93～102.
24 VassilevaA,ChughDA,SwaminathanS,et al.Protein Expr Purif, 2001,21(1):71～80.
25 ShenS,Sultar G,JeffriesTW,et al.G ene,1998,216:93～102.
26 MenendezJ,G aniaB,Hidalgo Y.Biothchniques,2000,29(5):1094～1099.
27 齐连权,陈薇,来大志,等.中国生物工程杂志,2002,22(6):45～
47.
28 Mei M,WhittakeR,JameS W,et al.Protein Expression and Purifi2 cation,2000,20:105～111.
29 Clare JJ,Romanos MA.G ene,1991,105:205～212.
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001 文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略 聂东宋,梁宋平,李 敏 (湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081) 摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达. 关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达 中图分类号:Q75 文献标识码:A 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略. 1 外源基因本身的特性对表达的影响 1 1外源基因的A+T组成 外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50% 收稿日期:2001-08-05 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392) 作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
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毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策 作者：丁镌， 宋跃芬， 袁野， 刘娣 作者单位：丁镌,宋跃芬(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨,150030)， 袁野(中国刑警学院警犬技术系,辽宁,沈阳,110034)， 刘娣(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨 ,150030;黑龙江省农科院,黑龙江,哈尔滨,150086) 刊名： 畜牧与兽医 英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2007,39(2) 被引用次数：1次 参考文献(9条) 1.Li A;Xiong F;Lin Q Low temperature increases the yiede of biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(3) 2.Potter K L;Zhang W;Smith L A Production and purification of the heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin,serotype A,expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(3) 3.Inan M;Meagher M M The effect of ethanol and acetate on protein expression[外文期刊] 2001 4.Brierley R A Secretion of recombinant human insulin-like growth factor I (IGF-1) 1998 5.Dring F;Klapper M;Theis S Use of the glyceroldehyde 3phosphate dehydrogenase promoter for production of functional mammalian membrane transport proteins in the yeast Pichia Pastoris[外文期刊] 1998(2) 6.Goodrick J C;Xu M;Finnegan R High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia Pastoris expression system[外文期刊] 2001(06) 7.Scorer C A;Buckholz R G;ClareJ J The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastori[外文期刊] 1993 8.Monteino R;Garcia R;Quintero O Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 1998(02) 9.隋少飞;陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通讯 2004(03) 引证文献(1条) 1.王希辉.岳寿松.胡敬东.黄亦钧.陈金龙.王婷婷.范忠玲.赵宏坤鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[期刊论文]-微生物学报 2010(9) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/8b7911148.html,/Periodical_xmysy200702022.aspx
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
V o l .30N o.62004212 华 东 理 工 大 学 学 报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金 E -ma il :qye @ecust .edu .cn 收稿日期:2003212208 作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为 发酵工程。 研究简报 文章编号:100623080(2004)0620723204 重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响 谢静莉1, 周庆玮2, 杜 鹏2, 甘人宝2, 叶 勤13 (1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237; 2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) 摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。 关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:A Effect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astoris X IE J ing 2li 1 , ZH OU Q ing 2w ei 2 , DU P eng 2 , GA N R en 2bao 2 , Y E Q in 13 (1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience , Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina ) Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t S pheno type ),feeding w ith glycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on . Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on 3 27
第28卷第1期 农业科学研究2007年3月 Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007 文章编号:167320747(2007)0120068204 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展 魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴 润1,陈溥言3 (1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.甘肃农业大学,甘肃兰州 730071; 3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京 210095) 摘 要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述. 关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展 中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A 目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统. 1 巴斯德毕赤酵母菌株 一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2]. 2 Pichi a p astoris表达载体 载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志. 2.1 启动子 Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择. 2.2 选择标记 选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选. 2.3 信号肽序列 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的 收稿日期:2006205220 作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.
文章编号:100128751(2002)0620246205 巴斯德毕赤酵母表达系统 唐元家 余柏松 综述(中国医药集团四川抗菌素工业研究所, 成都610051) 摘要: 巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。 关键词: 巴斯德毕赤酵母; 外源蛋白; 表达中图分类号: Q816 文献标识码: A 收稿日期:2001209227 修订日期:2002206215 作者简介:唐元家,男,生于1975年,在读硕士研究生,主要从事基因工程药物的研究。 余柏松,男,生于1957年,硕士,研究员,主要从事生物药物的研究及开发。 基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示 了广阔的前景。到目前为止,已发展了多种蛋白质表达系统,比如大肠埃希氏菌表达系统,酵母表达系统,高等真核细胞表达系统等。长期以来,人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点,如遗传背景和生化特性清楚,容易操作,生长迅速,营养要求简单等。但这一系统本身也存在若干缺陷:(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工,如剪切、糖基化、形成二硫键等;(2)表达的蛋白多形成不溶性包含体,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;(3)背景蛋白很多,纯化麻烦;(4)表达量一般不是很高。从1979年开始,为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点,发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母,它具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。1981 年Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕 。 此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白,但酿酒酵母系统也具有局限性,如缺乏强有力的启动子, 分泌效率差,表达菌株不够稳定,表达质粒易于丢失等。有鉴于此,人们发展了新一代的酵母表达系统———巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统,即甲醇酵母表达系统。 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,有许多其它蛋白表达系 统所不具备的优点。(1)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2) 作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行加工折叠和 翻译后修饰,。比如,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TI MP ),虽然获得了大量重组蛋白,但是由于重组蛋白形成包含体,难以使TI MP 分子内的6对二硫键正确折叠配对,始终未能得到有活性的全长分子。李克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正 确折叠的TI MP 21,重组蛋白的表达量达40mg/L 〔2〕 ;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;(4)表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子(EG F )的表达量为714mg/L ,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量为450mg/L ,表达量提高约60倍。许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L 以上水平,如 破伤风毒素C 片段表达量达12g/L 〔3〕 ,Heva brasiliensis 羟腈裂合酶的表达水平高达22g/L 〔4〕 ;(5)在巴斯德毕 赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞 外。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少和培养基中不含其他的蛋白质,这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分,因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化,如表达的重组水蛭素 (HIR ),仅经过二步层析纯化,纯度高达97%以上〔5〕 ,表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和 凝胶过滤三步纯度即可达到99%〔6〕 ;(6)外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上,这样得到
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略 1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理 在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。 根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）。 表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶 Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathway Enzyme Type Gene Zymogen form Vacuole PrA Aspartic PEP4 Yes PrB Serine PRB1 Yes CpY Serine PRC1 Yes CpS Metallo-( Zn2+) CPS1 Unknown ApI Metallo-( Zn2+) LAP4 Yes ApCo Metallo-(Co2+) DAP2 No DPAP-B Serine SEC11 Unknown Secretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 No DPAP-A Serine STE13 Unknown,predict no Yeast as partyl protease ш Aspartic Y AP3 Unknown,predict yes 酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解。 在P.pastoris生长和表达外源蛋白过程中，由于碳源从葡萄糖或甘油到甲醇的改变，甲醇代谢酶系（AOX,FAD,DHAS等）和过氧化氢体逐步积累，同时，相应的蛋白酶也产生了。由于细胞器胁迫的影响，过氧化氢体一部分在基质中自噬降解，大部分过氧化氢体转运到液泡中得到降解。 P.pastoris中位于与细胞膜结合的胞内蛋白酶类可分为蛋白质水解酶（内切酶）和多肽外切酶，由蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶类组成。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前体经过酶切活化而成，按照其作用活性位点又分为4类，丝氨酸类蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸类蛋白酶和天冬氨酸类蛋白酶。丝氨酸类蛋白酶最适pH值比较高，又叫碱性蛋白酶，而天冬氨酸类蛋白酶需要低的pH范围，又叫酸性蛋白酶。主要的液泡内蛋白酶有以下几种：蛋白酶A