猪常见病原实验室检查及分离培养方法
金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后LH、右前RF、右后RH编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 （2）泄殖腔拭子 以灭菌短棉签采集鸡泄殖腔拭子或采集一段盲肠后蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入泄殖腔2-3厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅速带回实验室处理。 首次分离时，将样品在6.5%NaCl营养肉汤中，45℃，18-24小时预增菌进行选择性培养后，将上述培养物以划线方式接种在肠球菌选择性培养基（叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基，BEA）上，37℃，培养18-24小时，从选择性培养基上挑取灰色，半透明，1-2mm大小的单菌落，用脑心浸液（BHI）肉汤37℃培养18小时左右。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80 ℃（长期）或-20 ℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在BEA琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 需要注意的是由于BEA琼脂颜色的变化导致假阳性的发生，因此，可以将肠球菌疑似菌株在BEA琼脂上进行二次筛选，提高分离准确率。
临检实验室建设标准与要求 一、高通量测序（NGS）实验室简介 1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。NGS是下一代测序技术(N EXT G ENERATION S EQUENCING)即高通量测序技术的简称。高通量测序技术是 对传统S ANGER测序（称为一代测序技术）革命性的改变,可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,也称为深度测序 (D EEP SEQUENCING)。 1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污 染导致检测结果准确性下降；另外NGS技术要求高、影响因素多，实验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 二、NGS实验室临床应用的基本条件 2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。 2.2检测设备必须符合标准NGS实验室设置要求：高通量测序仪及配套服 务器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。 2.3检测人员必须通过专门的技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门 颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。NGS实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文
件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。 2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。 三、NGS实验室建设基本要求 3.1主体结构 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。 3.2标准的各区分隔和气压调节 将检测过程分成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个检测实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。 可打开缓冲区和PCR扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。 3.3消毒 在每个实验区和缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在各区还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。 3.4机械连锁不锈钢传递窗
骨髓检查的临床应用 首都医科大学北京安贞医院左大鹏 骨髓细胞学检查是一种特殊的临床检验，是血液细胞形态学研究和血液病诊断的主要方法，其重点是发现血液细胞量和质的异常，并结合临床和血象等资料所分析的结果，作出明确的诊断。骨髓细胞学检查主要用于（适应证）： 1 、诊断造血系统疾病； 2 、诊断某些感染性疾患； 3 、协助诊断恶性肿瘤骨髓转移； 4 、协助诊断某些代谢障碍性疾病，如 Niemann-Pick 病（可在骨髓中找到其特殊细胞）。 一、血细胞发育过程中形态演变的一般规律 所有血细胞均起源于骨髓中的多能造血干细胞，在骨髓微环境和各种造血因子作用下发育成不同类型的细胞。血细胞在骨髓中的发育成熟一般要经过原始、幼稚和成熟三个阶段。红细胞系统、粒细胞系统又可人为地分为原始细胞、早幼细胞、中幼细胞和晚幼细胞四个具体阶段。淋巴细胞和单核细胞只分为原始、幼稚和成熟三个阶段。巨核细胞在发育中的阶段命名为原始巨核、幼稚巨核、颗粒巨核和产板巨核。 PPT4 显示的是血细胞发育示意图，可以看出造血功能干细胞最后发育成红细胞、粒细胞（包括中性、嗜酸、嗜碱）、单核细胞、血小板、淋巴细胞。 PPT5 用图表显示骨髓血细胞的发育规律（从原始 - 幼稚 - 成熟过程）。 PPT7 显示的是红细胞发育中各阶段形态变化规律示意图。可以看到从原红到早幼红到中幼红到晚幼红、网织红到成熟红细胞，细胞体的变化，核的变化，核仁及染色体的变化。 二、血细胞的正常形态学特点
（一）红细胞系统各阶段细胞形态学特点 1 、原始红细胞 直径 15- 20um ，多为圆形或微椭圆形边缘常有瘤状突起，胞核多呈圆形，约占细胞直径的 4/5 ，位于中央或稍偏于一侧，染色质为粗颗粒状，核仁 1-2 个，胞浆量少呈油墨蓝色，胞浆中不含颗粒。 PPT8 的图片显示的是原始红细胞。 2 、早幼红细胞 直径 10—18um ，细胞形态与原红相同，胞核变小，核染色质开始聚集，常出现部分的浓染区域，核仁模糊或消失，胞浆量增多，呈深蓝色，局部可有少量血红蛋白产生。 PPT9 显示的是早幼红细胞。 3 、中幼红细胞 直径 8-15 μ m ，圆形。胞核圆形或椭圆形，约占细胞体积的 1/2 。核染色质凝集成索条状或块状，其中有明显空隙。核仁消失。由于血红蛋白的形成，胞浆可呈不同程度的嗜多色性。 PPT10 显示的是中幼红细胞。 4 、晚幼红细胞 直径 7-10 μ m ，圆形。胞核圆形，居中或偏位，占细胞体积的 1/2 以下。核染色质聚集成数个大块或凝缩成紫黑色团块状。胞浆量多，染成浅灰或成熟红细胞色。 PPT11 显示的是晚幼红细胞。 （二）粒细胞系统各阶段细胞形态学特点
实验室常用器材使用方法及注意事项
实验室常见仪器使用方法及注意事项 一、常见的仪器 （一）初中化学实验常见仪器 反应容器可直接受热的：试管、蒸发皿、燃烧匙、坩埚等能间接受热的：烧杯、烧瓶、锥形瓶（加热时，需加石棉网） 常存放药品的仪器：广口瓶（固体）、细口瓶（液体）、滴瓶 （少量液体）、集气瓶（气体） 用加热仪器：酒精灯 计量仪器：托盘天平（称固体质量）、量筒（量液体体积） 仪分离仪器：漏斗 取用仪器：药匙（粉末或小晶粒状）、镊子（块状或较大颗粒）、胶头滴管（少量液体） 器夹持仪器：试管夹、铁架台（带铁夹、铁圈）、坩埚钳其它仪器：长颈漏斗、石棉网、玻璃棒、试管刷、水槽 不能加热：量筒、集气瓶、漏斗、温度计、滴瓶、表面皿、广口瓶、细口瓶等 1、试管 （1）、用途： a、在常温或加热时，用作少量试剂的反应容器。 b、溶解少量固体。 c、收集少量气体的容器 d、用于装置成小型气体的发生
器。 （2）、注意事项： a、加热时外壁必须干燥，不能骤热骤冷，一般要先均匀受热，然后才能集中受热， 防止试管受热不均而破裂。 b、加热时，试管要先用铁夹夹持固定在铁架台上（短时间加热也可用试管夹夹持）。 试管夹应夹在的中上部（或铁夹应夹在离试管口的1/3处）。c、加热固体时，试管口要略向下倾斜，且未冷前试管不能直立，避免管口冷凝水倒流 使试管炸裂。 d、加热液体时，盛液量一般不超过试管容积的1/3（防止液体受热溢出），使试管与桌面 约成45°的角度（增大受热面积，防止暴沸），管口不能对着自己或别人（防止液体喷出伤人）。反应时试管内的液体不超过试管容积的1/2。 2、烧杯用途：①溶解固体物质、配制溶液，以及溶液的稀释、浓缩 ②也可用做较大量的物质间的反应 注意事项：受热时外壁要干燥，并放在石棉网上使其受热均匀（防止受热不均使烧杯炸裂）， 加液量一般不超过容积的1/3（防止加热沸腾使液体外溢）。
第七章临床实验室检查 一.单选题 1.下列哪一项无网织红细胞增多 A.溶血性贫血 B.出血性贫血 C.缺铁性贫血 D.再生障碍性贫血 E.感染性贫血 2.下列哪一项属于核右移 A.外周血中性粒细胞增多 B.中性粒细胞五叶核＞5% C.外周血杆状核细胞增多 D.外周血三叶核细胞增多 E.出现早、中、晚幼粒细胞 3.不属于血常规检查的项目是 A.红细胞计数 B.白细胞计数 C.血红蛋白测定 D.血小板计数 E.白细胞分类计数 4.下列哪一项属于相对性红细胞增多 A.高原生活 B.剧烈体力劳动 C.大汗淋漓 D.新生儿 E.真性红细胞增多症 5.贫血伴轻度黄疸最可能是 A.脾亢 B.溶血性贫血 C.急性白血病 D.再生障碍性贫血 E.生理性贫血 6.白细胞减少常见于 A.病毒感染 B.化脓菌感染 C.烧伤 D.大出血 E.慢性白血病 7.哪项血象改变是诊断白血病的主要依据 A.白细胞异常增多 B.红细胞减少 C.血红蛋白减少 D.血小板减少 E.大量原始和幼稚型白细胞 8.生理性红细胞和血红蛋白减少见于 A.剧烈活动后 B.妊娠中、晚期 C.新生儿 D.早期高原生活 E.哺乳期 9.外周血中性粒细胞增多见于 A.肺炎球菌性肺炎 B.脾亢 C.伤寒 D.再生障碍性贫血 E.流行性感冒 10.血小板增加可见于 A.溶血性贫血 B.再生障碍性贫血 C.原发性血小板减少性紫癜 D.播散性血管内凝血 E.脾功能亢进 11.外周血中性粒细胞减少见于 A.肺炎球菌性肺炎 B.心绞痛 C.急性心梗 D.急性溶血 E.伤寒 12.嗜酸性粒细胞增多见于 A.肺结核 B.支气管哮喘 C.肺癌 D.上呼吸道病毒感染 E.长期使用糖皮质激素 13.嗜酸性粒细胞减少见于 A.荨麻疹 B.伤寒 C.寄生虫病 D.缺铁性贫血 E.急性大出血 14.下列哪种情况血沉不增快 A.肺结核进展期 B.风湿活动 C.恶性肿瘤 D.心绞痛发作 E.心梗 15.网织红细胞减少见于 A.溶血性贫血 B.脾切除术后 C.正常新生儿 D.再生障碍性贫血 E.失血性贫血 16.血小板增多见于 A.急性白血病 B.脾亢 C.DIC D.巨幼红细胞性贫血 E.急性大出血 17.绝对性红细胞增多见于 A.剧烈呕吐 B.严重腹泻 C.口服利尿剂 D.糖尿病酮症酸中毒 E.慢性肺源性心脏病 18.中性粒细胞胞浆中见粗大的分布不均的蓝黑色颗粒，需考虑 A.阿米巴痢疾 B.疟疾 C.严重化脓性感染 D.白血病 E.晚期活动性结核病
常见血液病实验室检查常规 贫血 一、初诊患者 1.一般常规：血常规、血型、尿常规、大便常规+OB、大便虫卵、ECG、ESR 2.血液学：白细胞分类(镜下)、网织红细胞、嗜酸细胞计数、血型、骨髓涂片（Bm铁染色）、 骨髓活检、NAP（中性粒细胞碱性磷酸酶积分）、血浆游离血红蛋白，结合珠蛋白， Coombs试验、Ham试验等 3.血生化：肝功能(包括ALP、BIL)、LDH、肾功能、尿酸、血糖、血清铁蛋白、血清铁、 总铁结合力、运铁蛋白饱和度（血铁饱和度） 4.血清学：乙肝五项、EBV抗体、输血相关病毒或微生物抗体检查 5.影象学：腹部B超(包括腹腔淋巴结、肝脾)、胸、腹CT，必要时全胃肠钡餐造影 6.骨髓(Bm)涂片、活检，细胞因子四项，纤维四项 7.免疫功能: 淋巴细胞亚群、免疫球蛋白（Ig）检测，必要时查各种自身抗体 8.基因检查：TCR基因重排、IgH基因重排 二、复诊患者 复查初诊时异常项目和可疑项目。 巨幼细胞贫血（Megaloblastic Anemia） 一、初诊患者 1．常规：血象(包括红细胞指数)及网织红细胞。中性粒细胞分叶计数。大便常规+OB、大便虫卵。 2．血液学检查：骨髓穿刺涂片、活检检查，血浆游离血红蛋白，结合珠蛋白，Coombs试验、Ham试验、NAP等。
3．生化检查：肝功能(包括ALP、BIL)、LDH、肾功能、尿酸、血糖， 4．血清学检查：内因子阻断抗体测定(疑维生素B12缺乏时) 5．影像学检查：胃肠道钡餐或胃镜检查。 二、复诊患者 复查初诊时异常项目和可疑项目。 缺铁性贫血（Iron Deficiency Anemia） 一、初诊患者 1．常规：血象(包括红细胞计数)及网织红细胞，嗜酸粒细胞计数，大便常规+OB、大便虫卵。2．生化检查：血清铁蛋白，血清铁+转铁蛋白，运铁蛋白饱和度，血清可溶性转铁蛋白受体(必要时) ，肝、肾功能。 3．血液学：骨髓涂片及铁染色(与测定血清铁蛋白等价)，红细胞铁蛋白(必要时)，NAP，血红蛋白电泳，血浆游离血红蛋白，结合珠蛋白、HbF（抗血清铁蛋白碱血红蛋白）。4．影像学：胃肠道钡餐或胃镜检查。妇科检查(月经过多的患者)。 二、复诊患者 复查初诊时异常项目和可疑项目。 溶血性贫血（Hemolytic Anemia） 一、初诊患者 血常规+RBC形态、网织红细胞、WBC+DC，肝、脾、胆B超，肝肾功能、血胆红素、LDH。尿常规+镜检，尿Rous试验，血红蛋白电泳，血浆游离血红蛋白，结合珠蛋白、HbF。 血细胞CD55、CD59，溶血象，红细胞脆性试验。 骨髓涂片、活检。怀疑自免贫（AIHA）做各种自身抗体检查，如ANA、抗dsDNA、抗ENA。 二、复诊患者
常用实验室检查 ［血液检查］ 1.红细胞计数（RBC）正常值：成年男性为（4.0—5.5）×1012/L；女性为（3.5—5.0）×1012/L。 2.血红蛋白（Hb）正常值：成年男性为120—160g/L;女性为110—150g/L。 3.红细胞与血红蛋白病理性增多常见于慢性肺心病患者。 4.红细胞与血红蛋白降低均称为贫血，其中血红蛋白的降低值对贫血程度判断更重要。 5.红细胞生成减少见于缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血等患者。 6.红细胞破坏过多见于各种溶血性贫血，如遗传性球型红细胞增多症，阵发性睡眠性血红蛋白尿、免疫性溶血性贫血等。 7.白细胞计数（WBC）正常值：成人为（4.0—10.0）×1012/L。 8.白细胞分类计数（DC）中性粒细胞（包括杆状核、分叶核）占50％—75％。 9.白细胞及中性粒细胞增多最常见于急性感染（尤其是化脓菌感染）；急性失血、急性溶血、急性中毒、组织严重损伤或坏死、恶性肿瘤等疾病均可引起白细胞及中性粒细胞增多。10.白细胞及中性粒细胞减少多见于病毒感染和部分格兰阴性杆菌感染（如伤寒、流感）；再生障碍性贫血、脾功能亢进、电离辐射、使用某些化学药物等均可引起白细胞及中性粒细胞减少。 11.外周血液中中性粒细胞不分叶核粒细胞增多（>5％）即为核左移；核左移常见于急性化脓菌感染、急性失血、急性中毒及急性溶血反应等患者。 12.外周血液中中性粒细胞核分叶5叶以上者增多（>3％）即为核右移；核右移常见于巨幼细胞性贫血、恶性贫血、慢性感染、尿毒症等患者。 13.嗜酸性粒细胞增多见于变态反应性疾病，如支气管哮喘、药物过敏反应等。 14.淋巴细胞增多见于病毒感染、结核感染及慢性淋巴细胞性白血病等。 15.血小板计数（PC或PLT）正常值：（100—300）×109/L。 16.女性月经期的第1日可引起血小板生理性减少。 17.血小板病理性减少常见于再生障碍性贫血、急性白血病、特发性血小板减少性紫癜（ITP）、脾功能亢进、弥散性血管内凝血(DIC)等患者。 18.网织红细胞的增减可反映骨髓造血功能的盛衰；网织红细胞增多见于各种增生性贫血，网织红细胞减少见于再生障碍性贫血等患者。 19.测定红细胞沉降率（血沉）时，标本中应加入的抗凝剂为3.8％的枸橼酸钠0.4ml。 20.血沉病理性增快见于各种急慢性炎症、组织损伤、恶性肿瘤等患者。 ［尿液、粪便检查］ 21.做尿常规检查尿标本可随时留取新鲜尿液100ml左右，但以晨尿最好。 22.正常成人每天尿量为1000—2000ml；超过2500ml为多尿；少于400ml为少尿；少于100ml 为无尿。 23.每升尿内含有血量超过1ml即出现淡红色，称肉眼血尿；尿液离心沉淀后每高倍视野平均见到3个以上红细胞称为镜下血尿。 24.肉眼血尿或镜下血尿常见于泌尿系统炎症、肾结核、肾结石、肾肿瘤等。 25.新鲜尿液若呈白色或黄色混浊为脓尿或菌尿；尿液离心沉淀后每高倍视野平均见到5个以上白细胞为镜下脓尿。 26.脓尿或菌尿、镜下脓尿常见于泌尿系统感染，如肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎等。 27.尿液呈深黄色且震荡后出现黄色泡沫为胆红素尿；胆红素尿见于阻塞性黄疸和肝细胞性黄疸患者。 28.尿液呈酱油色多见于血红蛋白尿；血红蛋白尿见于各种原因引起溶血的患者。 29.尿液呈乳白色为乳糜尿；乳糜尿见于丝虫病、肾周围淋巴管阻塞的患者。
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
一、血液检查： （一）红细胞计数和血红蛋白测定 红细胞：男（~）×1012/L 血红蛋白：男120~160g/L 女（~）×1012/L 女110~150g/L 新生儿（~）×1012/L 新生儿170~200/L 临床意义： 1.红细胞及血红蛋白减少：婴幼儿、15岁以前的儿童、部分老年人、妊娠中晚期；各种原因所致的贫血。 2.红细胞及血红蛋白增多：剧烈呕吐、大面积烧伤后；高原、剧烈运动；阻塞性肺气肿、发绀型先天心脏病及红细胞增多症等。 （二）白细胞计数及白细胞分类计数 白细胞：成人（4~10）×109/L；新生儿（15~20）×109/L；6个月~2岁（11~12）×109/L。 白细胞分类计数：类型/百分数/绝对值 1.中性粒细胞（N）：①杆状核（st）：0~5 ~ ②分叶核（sg）：50~70 2~7 2.嗜酸性粒细胞（E）：~5 ~ 3.嗜碱性粒细胞（B）：0~1 0~ 4.淋巴细胞（L）： 20~40 ~4
5.单核细胞（M）： 3~8 ~ 临床意义： ①白细胞计数增多与减少主要受中性粒细胞数量的影响。 1.中性粒细胞增多：新生儿、妊娠、分娩、高温、严寒、饱餐、剧烈运动等；急性感染（主要原因）、严重组织损伤及血细胞破坏、急性大出血（可作为内出血诊断指标）、急性中毒、白血病、骨髓增生疾病及恶性肿瘤。 2.中性粒细胞减少：感染（革兰阴性菌、病毒、原虫等）、血液疾病、理化损伤、单核-吞噬细胞系统功能亢进、自身免疫疾病。 3.核左移：常见于化脓性感染、急性失血/中毒/溶血反应及白血病。 4.核右移：主要见于造血功能减退。 ②嗜酸性粒细胞增多：变态反应性疾病、寄生虫病、皮肤病、血液病、恶性肿瘤、传染病。 ③嗜碱性粒细胞增多：变态反应疾病、血液病、恶性肿瘤等。 ④淋巴细胞。 1.淋巴细胞增多：4~6天的婴儿至6~7岁儿童；病毒\杆菌感染、淋巴细胞性恶性组织病等。 2.淋巴细胞减少：主要见于接触放射线、应用肾上腺皮质激素、先天\获得性免疫缺陷综合征等。 ⑤单核细胞增多：感染、血液病等。
病原菌分离方法 一、实验原理： 植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。 二、实验用具： 酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等 三、实验前的准备工作： 1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml （1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。 （2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。 （3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌 30min。 2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。 四、实验步骤： 1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。 2、取样，病斑大小约20个（含病缘线） 3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定） （2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装 (3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸） （4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基 约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培 养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝
临床常用实验室检查正常值 血液检查 红细胞成年男性（4.0~5.5）×1012/L 女性（3.5~5.5）×1012/L 新生儿（6.0~7.0）×1012/L 血红蛋白成年男性120~160g/L 女性110~150g/L 新生儿170~200g/L 白细胞成人（4~10）×109/L 新生儿（15~20）×109/L 6个月~2岁（11~12）×109/L 白细胞分类N 50~70% E 0.5~5% B0~1% L20~40% M3~8% 血小板（100~300 ）×109/L 红细胞比容男0.4~0.5 女0.37~0.48 红细胞平均指数MCV82~92fl MCH27~31pg MCHC320~360g/L 出血时间Duke法 1~3min 凝血时间试管法 4~12min 凝血酶原时间11~13s 网织红细胞0.5%~1.5% 平均1%新生儿2%~6% 红细胞沉降率男0～15mm/h 末女0～20mm/h末 尿液检查 颜色淡黄色 尿量1000~2000ml/24h 平均1500ml/h 比重最大变动范围 1.003~1.030以上 一般变动范围 1.015~1.025 晨尿 1.020左右 尿沉渣检查 红细胞 0~偶见/HP 上皮细胞 0~少量/HP 白细胞＜5/HP 透明管型 0~偶见/LP 12小时沉渣计数（Addis计数） 白细胞＜1000000 /12h 红细胞＜500000/12h 管型＜5000/12h 1小时尿细胞计数 白细胞男＜7×104/h女＜14×104/h
红细胞男＜3×104/h女＜4×104/h 中段尿培养菌落形成单位（CFU） 杆菌：＞105CFU肯定为感染 球菌：＞103CFU肯定为感染 尿葡萄糖定性（—）定量斑氏法 0.1~0.9g/d 尿蛋白定性（—）定量＜150mg/24h 尿蛋原 稀释试验＜1∶20 定量 0~5.9mol/L（0~3.5mg/d） 尿酮体试验定性（—） 尿胆红素试验定性（—） 尿妊娠试验定性乳胶法（—） 粪便检查 颜色：黄褐色量100~300g/日细胞（上皮细胞或白细胞）0~偶见/HP，食物残渣、大量植物细胞、淀粉颗粒、肌纤维等。隐血试验阴性。 血清蛋白测定 总蛋白60~80g /L 白蛋白40~55g/L 球蛋白20~30g/L A/G比值 1.5：1~2.5：1 甲胎蛋白（α-FP，AFP）0~25μg/L （0~25ng/ml）血清C反应蛋白（CRP） 单向免疫扩散法〈8mg/L 尿素氮成人3.2~7.1 mmol/L 儿童1.8~6.5 mmol/L 尿酸119~238μmol/L 肌酐全血88.4~176μmol/L 血清男性53~106μmol/L 女性44~97μmol/L 血糖（空腹） 全血（Folin-吴法）4.4~6.7（80~120 血清（邻甲苯胺法）3.9~6.4 mmol/L(70~110 mg/dl） 血钾（K+）4.1~5.6 mmol/L（4.1~5.6 mEq/L） 血钠（Na+）135~144 mmol/L（135~144 mEq/L） 血钙（Ca2+） 2.2~2.7 mmol/L
常见实验室检查的临床意义及注意事项 一、常见的临检项目： 1.血常规：血常规主要检测血液中的细胞成分，包括红细胞，血红蛋白，白细胞，血 小板4大类，共20项。 看血常规主要看4项，红细胞计数RBC，白细胞计数WBC,血小板计数PLT，血红蛋白含量Hb。 （1）红细胞及血红蛋白： 血红蛋白红细胞数 成年男性：120-160g/L 4.0-5.5×1012/L 成年女性：110-150g/L 3.5-5.0×1012/L 新生儿：170－200g/L 6.0-7.0×1012/L 红细胞↑及血红蛋白↑ 成男：>6.0×1012/L >170g/L 成女：>5.5×1012/L >160g/L 红细胞↓及血红蛋白↓ 成男：<4.0×1012/L <120g/L
成女：<3.5×1012/L <110g/L 红细胞及血红蛋白病理性增高，常见于肺心病、先心病、脱水、真性红细胞增多症等；病理性降低则见于贫血、失血、白血病等。 （2）白细胞计数：正常值：成人：4.0-10.0×109/L 儿童：5.0-12.0×109/L 白细胞分类：中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞?中性粒细胞：50%-70% 粒细胞减少症：<1.5×109/L 粒细胞缺乏症：<0.5×109/L 粒细胞增高见于急性化脓性细菌感染、出血、损伤、心梗、粒细胞白血病等； 粒细胞降低见于伤寒、再障、急性粒细胞缺乏症、脾功能亢进、某些抗癌药物等； ?淋巴细胞：20%-40% 淋巴细胞增高见于病毒感染、结核、淋巴细胞白血病、淋巴瘤等；淋巴细胞降低见于细胞免疫缺陷病、放射病等； ?嗜酸性粒细胞：0.5%-5% 增多：过敏性疾病、寄生虫病等；降低：伤寒、副伤寒等； ?嗜碱性粒细胞：0-1% 增多：慢粒、嗜碱性粒细胞白血病等； ?单核细胞：3%-8% 增多：伤寒、单核细胞白血病、淋巴瘤等； （3）血小板计数：血小板计数正常值100-300×109/L 减少见于急性白血病、再障、脾亢、DIC等；增多一般见于原发性血小板增多症、慢粒、真性细胞增多症等； 2.网织红细胞：参考值：百分数0.005-0.015 增多：骨髓红细胞系增生活跃，见于溶血性贫血、急性失血等；减少：骨髓造血功能减低，常见于再障。 3.有核红细胞：需要空腹抽血。正常成人外周血中不能见到，在出生1周之内的新生儿外周血中可见到少量。成人外周血中出现有核红细胞均属病理现象，结果阳性可能疾病：先天性红细胞生成异常性贫血、小儿遗传性椭圆形红细胞增多症、新生儿溶血病，增多增生性贫血、红白血病、恶性贫血、癌肿。
实验室常用蒸发浓缩方法 氮吹仪 原理：将氮气快速、连续、可控地吹向加热样品的表面，使待处理样品中的水分迅速蒸发、分离，实现样品无氧浓缩。 应用：农残分析，药物筛选，液相、气相、质谱分析前处理。 优点： 干燥速度快 缺点： 样品温度高 样品处理量少 存在将样品中物质吹到实验室中的风险，必须在通风橱中操作 需要消耗氮气，增加额外成本 可燃溶剂存在爆炸危险 整个过程需要监控 旋转蒸发仪 原理：基本原理即是减压蒸馏，可降低液体的沸点，那些在常压蒸馏时未达到沸点就会受热分解、氧化或聚合的物质就可以在分解之前蒸馏出来，“旋转”可以使溶剂形成薄膜，增大蒸发面积。另外，在高效冷却器（一般是冷凝管）作用下，可将热蒸汽迅速液化，加快蒸发速率。 应用：萃取液的浓缩，有机物提取，色谱分离接收液的蒸馏。 优点： 蒸发速度相对较快 样品量大 控制水浴温度可控制热量输入 真空度可控制 整个过程可见，好控制 缺点： 只能处理单一样品 需要清洗玻璃装置 密封件寿命有限，需要定期更换 样品会泄露到空气中，造成污染
离心浓缩仪 原理：负压降低溶剂沸点，冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行，离心力可保证样品沉积在管底，不会产品气泡和交叉污染。 应用：DNA/RNA的浓缩，药物代谢物的浓缩，液相色谱的前后处理，免疫球蛋白的浓缩等。 优点： 安全 样品处理量大 多种离心管可选择 样品沉积在离心管底部，好回收 最大程度减少发泡与交叉污染 可通过红外方式提高加热效率 精确控制真空度 蒸发温度低 可通过编程实现多组分分离 缺点： 速度较慢 蒸发过程可见程度有限 冷冻干燥机 原理：预冻样品中的水分，在真空状态下直接升华，可利用冷阱捕获蒸发出来的气体，使蒸发过程快速进行。 应用：菌种、疫苗、蛋白、核酸、药物等对温度和氧敏感性生物样品的干燥，冻干后的样品易于保存和运输。 优点： 安全 水分去除率非常高
第四章植物病原菌分 离与纯化 植物病原菌 一、植物病原菌分离流程 二、分离的准备 ?分离的准备工作 无菌室操作前保持清洁无菌 接种工作准备 培养基的准备 ?分离材料选择 以收获的材料从病健交界处采样 果实腐烂从开始腐烂处分离 根腐和枯萎层可能从离土较远处分离
有些枯萎如野火病被固定在局部，从病斑边缘分不到等 有些材料污染严重时可先接种再分离：即将病组织接种到健康材料等 发病后分离 ?组织表面消毒 ⑴升汞：1‰ ◆升汞1g HCl(浓)25ml 水1000ml ◆升汞先溶于盐酸中，加水后稀释，也 可用NaCl 5g/L 代替盐酸，但易沉淀 ◆作用：盐酸，NaCl增加溶解度，HCl 能增强杀菌能力。 ◆处理时间：30’S-30min不等，常3 －5min；所需时间因材料不同而异， 消毒后灭菌水3－5次 附在组织表皮的气泡，含使消毒剂不能与寄生表面直接通气影响消毒 效果，除气泡抽气、70％酒精浸2 －3秒
⑵漂白粉 ◆常用表面消毒剂适用于病组织表面消 毒，也可处理种子 ◆成分：漂白粉10g，水140ml，过滤后使 用。 ◆最好现配现用，放久失效，有效成分 CaClO次氯酸钙 ◆好的消毒液易使有色纸褪色，且产生氯 气有强烈臭味。 ◆一般3－5min，时间长短因材料不同而 不同。处理种子5－10min，长的可达20 －30min。 优点：杀菌能力强，具有挥发性，不会遗留在组织上影响分离结果，其杀菌能力小于升汞。 （3）酒精：70％，浸很短时间（几秒到1min）灭菌水洗。 ◆较大的材料在酒精中浸或棉花 擦，然后在火焰烧去。 ◆幼嫩的病组织，表面用药剂消毒 时可能会同时杀死其中的病原真
常用化验检查结果的临床意义 Ⅰ血细胞分析 ⑴血红蛋白（Hb）：新生儿170~200g/L； 成年：男性120~160g/L女性110~150g /L； 老年（70岁以上）：男性94.2~122.2g/L； 女性86.5~111.8g /L ⑵红细胞（RBC）：新生儿（6.0～7.0）×10＊12/L 男性（4.0～5.5）×10＊12/L 女性（3.5～5.0）×10＊12/L ⑶白细胞（WBC)：成人（4.0～10.0）×10＊9/L 新生儿（15.0～20.0）×10＊9/L 6个月至2岁（11.0～12.0）×10＊9/L ⑷血小板（PLT）：（100～300）×10＊9/L ⑸网织红细胞计数（RET）: 0.5%-1.5% ⑹白细胞分类计数(DC) 百分率绝对值 中性杆状核粒细胞0.01～0.05 （1％～5％）（0.04～0.5）×10＊9/L 中性分叶核粒细胞0.50～0.70 （50％～70％）（2.0～7.0）×10＊9/L 嗜酸性粒细胞(EOS) 0.005～0.05 （0.5％～5％）（0.02～0.5）×10＊9/L 嗜碱性粒细胞(BASO) 0～0.001 （0％～1％）（0～0.1）×10＊9/L 淋巴细胞(LYMPH) 0.20～0.40 （20％～40％）（0.8～4.0）×10＊9/L 单核细胞(MONO) 0.03～0.08 （3％～8％）0.12～0.8）×10＊9/L
⑺血细胞比容（Hct）： 男性：0.40～0.50L/L（40～50容积％），平均0.45L/L 女性：0.37～0.48L/L（37～48容积％），平均0.40L/L ⑻平均红细胞体积（MCV）：80～100fl ⑼平均红细胞血红蛋白（MCH）：27～34pg ⑽平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）：320～360g/L（32％～36％） ⑾红细胞体及分布宽度（RDW）: ＜14.5% 红细胞增多见于：（1）严重呕吐、腹泻、大面积烧伤及晚期消化道肿瘤患者。多为脱水血浓缩使血液中的有形成分相对地增多所致。（2）心肺疾病：先天性心脏病、慢性肺脏疾患及慢性一氧化碳中毒等。因缺氧必须借助大量红细胞来维持供氧需要。（3）干细胞疾患：真性红细胞增多症。 红细胞减少见于：（1）急性或慢性失血。（2）红细胞遭受物理、化学或生物因素破坏。（3）缺乏造血因素、造血障碍和造血组织损伤。（4）各种原因的血管内或血管外溶血。 血红蛋白临床意义：贫血、白血病、产后、手术后、大量失血、钩虫病等减少。缺铁性贫血时尤为明显。肺气肿、肺心病、先天性心脏病、严重呕吐、腹泻、出汗过多、大面积烧伤、慢性一氧化碳中毒及真性红细胞增多症等时增高（长期居住高原者生理性增高）。
法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法 原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基 二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。 方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于 0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl 5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。 评述： 1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。目前，我们一切 纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。 2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制 PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA 扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。 因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。 3、清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。检材参考加入量 0.5×0.5cm血斑150ul-200ul 二步法精斑100ul 毛根10ul 烟头30-50ul 4、对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一 段时间，补加适量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。 5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。 6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。 7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100 pH
有机实验室常用仪器与使用 旋转蒸发仪 旋转蒸发仪，主要用于在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂。尤其对萃取液的浓缩和色谱分离时的接收液的蒸馏，可以分离和纯化反应产物。旋转蒸发仪的基本原理就是减压蒸馏，也就是在减压情况下，当溶剂蒸馏时，蒸馏烧瓶在连续转动。结构:蒸馏烧瓶可是一个带有标准磨口接口的梨形或圆底烧瓶，通过一高度回流蛇形冷凝管与减压泵相连，回流冷凝管另一开口与带有磨口的接收烧瓶相连，用于接收被蒸发的有机溶剂。在冷凝管与减压泵之间有一三通活塞，当体系与大气相通时，可以将蒸馏烧瓶，接液烧瓶取下，转移溶剂，当体系与减压泵相通时，则体系应处于减压状态。使用时，应先减压，再开动电动机转动蒸馏烧瓶，结束时，应先停机，再通大气，以防蒸馏烧瓶在转动中脱落。作为蒸馏的热源，常配有相应的恒温水槽。 催化氢化装置 催化氢化是有机化学实验中的一项重要内容之一。这一反应的具体内容是气态氢在催化剂存在下，与有机化合物进行加成或还原反应，从而生成新的有机化合物。它的优点是： （1）有些反应，如碳碳不饱和键的加氢，应用其他方法比较复杂和困难，而应用催化氢化反应，则可以方便的达到目的。 （2）它对醛酮，硝基及亚硝基化合物都能起还原作用，生成相应的醇和胺，不需要任何还原剂和特殊溶剂。氢气本身极其便宜，因而成
本低操作方便。 （3）反应完毕后，只需滤去催化剂，蒸发掉溶剂即可得到所需产物，后处理方便，产品纯度、收率都比较满意。 根据氢化时选用的压力不同，可将催化氢化分为常压氢化，低压氢化（4-5atm）及高压氢化（＞6atm）。而高压氢化则需要非常特殊的装置，（由于有较高压力），这些已超出本书的范围，但不论是在任何压力进行氢化，都不得使用明火，包括电火花。 催化氢化装置：主要包括氢化用的圆底烧瓶，气压计，量（贮）气管和平衡瓶。贮气管的体积一般在100mL到2L之间，可根据反应的规模大小选择合适的贮气量；在平衡瓶里所装的液体通常是水或汞。在反映过程中，氢气的压力大小可以通过平衡瓶的高度来调节。反应结束后，再通过平衡瓶来测量参加反应的氢气的体积。气压计可以保证在反应前后，氢气都在相同的压力下（一般为1atm）进行体积测量。 压缩气体钢瓶 在有机化学实验中，有时会用到气体来作为反应物。如氢气、氧气等，也会用到气体作为保护气，例如氮气、氩气等，有的气体用来作为燃料，例如煤气、液化气等。所有这些气体都需要装在特制的容器中。一般都是用的压缩气体钢瓶。将气体以较高压力贮存在钢瓶中，既便于运输又可以在一般实验室里随时用到非常纯净的气体。由于钢瓶里装的高压的压缩气体，因此在使用时必须严格注意安全，否则将会十分危险。