摘要：指纹图谱技术在食品的质量控制中起着重要的作用。本文主要介绍了高效液相色谱指纹图谱在蜂蜜研究中的应用，以期为蜂蜜的鉴定、质量控制及标准的制定等方面工作奠定基础。
关键词：蜂蜜高效液相色谱指纹图谱
蜂蜜是一种传统的天然保健食品。它是由蜜蜂采集植物的甜味分泌物，通过蜂蜜自身的消化，转化作用及蜜蜂通过气流干燥作用，使水分从花蜜中含６０％以上降低到２０％以下。一般蜜蜂从采集花蜜到酿制为成熟蜜，正常情况下需要３～５ｄ时间［１］［２］。
糖类是蜂蜜的主要的成分，其中有单糖、双糖、低聚糖和多糖，单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的５５％～７５％，而双糖和三糖的含量因蜜源种类的不同而变化。此外，蜂蜜还含有多种蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及人体所必须的矿物质及微量元素，营养十分丰富［２］［３］。多年来的科学研究与医学临床都证明，蜂蜜具有促进食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高肌体免疫能力，促进儿童生长发育等功效；它不仅对婴幼儿、运动员、老人及体弱多病者、重体力劳动者、高强度脑力工作者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对治疗烧伤、烫伤、溃疡愈合、促进伤口愈合及心血管病的辅助治疗等方面来说有很好的疗效［４］｛５］。
蜂蜜作为一种营养丰富、易被人体吸收的天然食品在国内外市场上深受消费者欢迎。为规范蜂蜜市场，保证消费者的利益，我国于１９８２年和２００２年分别颁布了蜂蜜行业标准和推荐性国家标准；但是目前就蜂蜜质量来说，全国各地在蜂蜜生产、流通中仍存在很多不规范的环节，更甚的是出现许多人为掺杂假使的行为，而当前的国家标准不能满足快速、准确的检测需要。
高效液相色谱指纹图谱技术已经广泛的应用于食品行业，特别是药物化学中的中药指纹图谱已经取得了重大的进展。在蜂蜜市场较为混乱且没有准确、快捷的检测方法的情况下，期望建立蜂蜜的高效液相色谱指纹图谱成为必然的趋势。
１．指纹图谱的含义
“指纹（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）”识别技术起源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学。作为一种综合、宏观的和可量化的鉴别手段的指纹图谱，是指经过适当的处理后，采用一定的分析手段如光谱或图谱，得到能够标示该样品特征的色谱或光谱的谱图或图象。在完整地呈现出色谱的特征“面貌”的前提下，表达了对照品与待测样品指纹图谱的相似性，用以产品真伪鉴别，评价其质量的均一性和稳定性。
蜜源植物的花蜜是蜂蜜的主要来源，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此，同一种类的单一花蜜在成分上也具有相似性。同时，经采集、酿造后的成熟蜂蜜其成分除糖类的含量有明显变化外，来源于蜜源植物的次生代谢物质等微量活性成分一般不会发生较大的变化，这使指纹图谱技术应用于蜂蜜种类和真伪鉴别成为可能。借助于现代分析技术对蜂蜜中主要特征功效成分信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，这就是蜂蜜指纹图谱的内涵［１８］。
２．指纹图谱的种类
指纹图谱已广泛的应用于食品品种和质量的鉴别，其根据测定方法的不同，大体分为色谱指纹图谱、光谱指纹图谱和ＤＮＡ指纹图谱。其中，以高效液相色谱指纹图谱应用最为广泛。
２．１色谱指纹图谱
色谱技术种类繁多，是获得指纹图谱的最常用的方法。其中，高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是应用最多的一种方法，６０％～７０％的有机物均可应用，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，是所有光谱色谱分析中最适合绘制指纹图谱的方法。近２０多年来，随着仪器和柱技术、样品预处理技术的发展成熟及仪器的日益普及，ＨＰＬＣ作为食品中的营养成分、功能因子、食品添加剂及污染物的一种快速、准确、易于自动化的检测手段，在食品分析中的应用发展很快；高效液相色谱－质谱（ＭＳ）联用，能够将未知成分的各峰进行归属；当前，高效液相色谱已经用于蜂蜜某些糖分的定量与定性的常规分析；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面也有很多的报道［６］。
薄层色谱（ＴＬＣ）法出现于１９５６年，具有操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑斓
蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展
西南大学食品学院王文静
的彩色图像，直观易辨的特点；气相色谱（ＧＣ）法适合于挥发油及其制剂的指纹图谱的研究和应用；高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）法可鉴别大分子物质，是近年发展起来的新的分析技术，从根本上解决了ＨＰＬＣ的柱效问题，它集ＨＰＬＣ与电泳技术的优点于一身，使组分的分析范围更广、更灵敏。
２．２光谱指纹图谱
光谱指纹图谱包括：红外（ＩＲ）指纹图谱、紫外（ＵＶ）指纹图谱、核磁共振谱（ＮＭＲ）指纹图谱、质谱（ＭＳ）ＥＩ－Ｓ图谱等。红外光谱（ＩＲ）是纯物质组分鉴定的权威方法；紫外光
谱（ＵＶ）特征的差异，在一定程度上反映了供试样品化学成分的差异。紫外和红外光谱具有加和性，对于混合物来说，其鉴别专属性差，分辨率低，需借助计算机模式识别技术或模糊数学方法进行处理。
２．３ＤＮＡ指纹图谱
随着现代分子生物学的发展，物质鉴别的手段从宏观形态拓展到微观的遗传物质ＤＮＡ领域。由于同种生物体具有相同的ＤＮＡ序列，可依据其差异来鉴定生物物种［９］。此项技术已经成功的应用于中药材和苹果品种的鉴定研究。
３．高效液相色谱指纹图谱的研究进展
３．１食品领域高效液相指纹图谱的应用
在过去的几十年中，指纹图谱在食品领域的其他的产品质量控制中已取得了研究性进展。２００４年，魏永生等［７］发表了青海油菜蜂花粉黄酮类化合物的含量研究一文。此研究采用正交试验设计，研究得出青海油菜蜂花粉中黄酮类化合物的最佳提取条件——
—９５％的乙醇作为溶剂，以１０倍总量的乙醇用量，水浴热回流提取。试验还分别采用ＨＰＬＣ法和比色法测定了黄酮类化合物的含量，研究结果表明，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素为对照品，采用ＨＰＬＣ法，测定出黄酮类化合物平均含量为３．１９４％；以芦丁为对照物，采用比色法，测定出总黄酮平均含量为３．７０％。
２００５年８月，魏新军［８］发表采用高效液相色谱建立了保健酒的石油醚－乙醚提取物的指纹图谱。通过分析比较色谱指纹图谱中的相对保留值α和相对面积Ｓｒ，对不同批次的保健酒进行对比研究，并确定出标准图谱（见图１）。结果表明，该法简便可靠，对保健酒的质量控制效果明显。
２００５年１０月，朱丽敏［９］着重以食用油、橙汁和奶制品为例，阐述了气味指纹分析法对食品所建立的新型质量控制和风味的研究方法。分析结果表明，该分析技术具有以下优点：满意的分析灵敏度和重复性，而且该分析方法无需样品前处理。
图１中国劲酒指纹图谱
２００５年，吴继红［１０］对果汁特征理化指标指纹图谱及指纹图谱信息解析技术等相关问题进行论述，对建立科学合理的控制和评价果汁质量、果汁防伪方法等方面的研究工作进行初探。
周萍等［１１］从蜂胶的功效成分－黄酮类化合物着手测定了真品蜂胶、杨树胶和搀假蜂胶的ＨＰＬＣ指纹图谱。结果表明，真品蜂胶含有１９个特征峰中的１８个特征峰，缺６号峰；杨树胶含有１９个特征峰中的１７个特征峰，缺７号和１１号峰；搀了杨树胶的搀假蜂胶，含有６号峰，而７号峰和１１号峰的峰面积显著降低，为蜂胶真伪的有效鉴别提供依据。
３．２蜂蜜高效液相指纹图谱的研究进展
卢太白等［１２］通过对１０种不同来源、不同种类蜂蜜样品品质的理化性质检测与掺假鉴别测试得出：总糖、还原糖的检测方法仅适合对来源可靠的真蜂蜜检测，不适用于掺假手法繁多的掺假蜂蜜检测。而国标检测食品中还原糖、蔗糖的方法为化学法，无法将果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖区分开来，且测定结果常常比实际结果偏高，因此一些学者提出高效液相指纹图谱指纹图谱在蜂蜜质量鉴别中的应用，而目前我国这方面的研究很少，并主要集中于糖类的研究。
１９９３年，张存洁［１３］采用ＭｉｒｃｏＰａｋ－ＮＨ２（３００×４㎜）键合柱，示差折光检测器，乙腈－水（７５：２５）体系，流速为２．０ｍｌ／ｍｉｎ，通过中途改变检测灵敏度，一次进样同时检测蜂蜜中的四种糖份，整个色谱分析在８分钟内完成对果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的最小检出量分别为１２０×１０－３ｍｇ、１００×１０－３ｍｇ、２２×１０－３ｍｇ和４４×１０－３ｍｇ；分析变异系数小，平均添加回收率高。
１９９５年，Ｇｏｏｄａｌｌ［１４］采用高效液相色谱法，以麦芽四糖为内标物分析了９１种蜂蜜样品，从中发现了５０种低聚糖。实验结果表明，各种蜂蜜的低聚糖色谱图均有其特
征，根据它们的特征和各种低聚糖的定性及相对定量结构可以鉴别蜂蜜的类型和真伪。
范崇阳等［１５］在高效液相色谱测定蜂蜜中的糖类的研究一文中采用氨丙烷基硅胶柱，乙腈－水为流动相，以鼠李糖作内标，用示差折光检测器测定（见图２、图３）。实验发现：在实验条件下，用乙腈－水（４：１）能分离蜂蜜中的各种糖分，其中包括一些还未被鉴定出的可能属于双糖的未知峰，它的位置在蔗糖和麦芽糖之间；水溶样品对保留时间和峰高稍有影响，试样和标准可采用等容积进样消除这一误差。
图２Ａ，标准溶液２组２０微升图３Ａ，Ｂ同图２
Ｂ，１０％蜂蜜（紫云英Ｆ００５）２０微升流动相：乙腈－水（３：１）流动相：乙腈－水（４：１），流速：２．２毫升／分
流速：２．２毫升／分峰序同图２
峰序：１，果糖２，葡萄糖３，蔗糖４，麦芽糖５，未知
２００１年吴艳华［１６］等人在《应用技术》中发表采用液相色谱法，蜂蜜样品经水解后，以鼠李糖作为内标，差示折光检测器检测，可以快速、灵敏、准确的直接分离和测定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量，为蜂蜜指纹图谱的建立奠定基础。
２００２年高燕红［１７］在《中国卫生检验杂志》中发表用高效液相色谱法测定食品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖在４．００×１０－３ｍｇ／ｍｌ～２０．０×１０－３ｍｇ／ｍｌ范围内线性良好，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖的回收率分别为９７．５％、９５．１％、１００．９％、９８．３％，方法重现性好、结果准确，并明确指出此方法可用于鉴别蜂蜜产品的真假。
２００６年西北大学的曹炜［１８］等人在《中国蜂业》中发表的ＨＰＬＣ指纹图谱在蜂蜜种类识别中的应用研究一文中综述了指纹图谱在蜂蜜研究中的可行性和现实意义。
２００６年ＣｒｉｓｔｉａｎｅＢ．Ｃａｎｏ［１９］等对高效液相色谱分离蜂蜜中糖分的流动相配比进行优化设计，研究结果表明，乙腈－水流动相中加入乙酸乙酯，促进糖类化合物的分离，以便蜂蜜中某些成分的定量分析；并推荐在蜂蜜样品糖类化合物的分离研究中使用乙腈－水－乙酸乙酯体积比为５０：１０：４０流动相。
近年来国外对蜂蜜的成分的研究表明，蜂蜜中存在微量的生物活性物质，如黄酮类化合物、酚酸类物质。不同的单花蜂蜜，其特征成分存在很大的差异，采用指纹图谱技术研究不同蜂蜜中的微量生物活性物质和和非活性物质，可以有效区分不同蜜源的植物来源的蜂蜜，而且可以应用于蜂蜜的质量控制中，尤其在鉴别蜂蜜种类、判别真假蜂蜜中。
１９９３年，Ｔｏｍａｓ－Ｂａｒｂｅｒａｎ等［２０］在ＲＰ－ＨＰＬＣ上分析了蜂蜜中的２０种黄酮甙元，试用了甲醇－水和乙腈－水的多种洗脱体系，但发现没有一种溶剂体系能分析所有这些黄酮。
１９９９年，Ｒｏｄｅｒｉｃｋ等［２１］研究新西兰和北爱尔兰产地的蜂蜜的抗菌成分时发现，不同种类的蜂蜜其酚酸的色谱图有很大的差异，同类蜂蜜（麦卢卡蜜）的色谱图则具有很多的相似性。
２０００年Ｉｓａｂｅｌ等［２２］采用色谱技术从小桉树蜜中鉴定出多种黄酮类化合物，其中发现五羟黄酮和毛地黄黄酮可作为桉树蜜的标记物，８－甲氧基－坎菲醇和坎菲醇可作为迷迭香蜜的标记物。
２００４年Ｌ．Ｙａｏ等研究了与澳大利亚桉树蜜的蜜源有关的７种酚酸。同年还研究出没食子酸和香豆酸可用于不同产地的金娘科桃金娘属植物蜂蜜的鉴别［２３］。
２００６年，ＤａｎｉｅｌａＫｅｎｊｅｒｉｃ等［２４］研究了两个季节的４０种克罗地亚洋槐蜜的黄酮类化合物的ＨＰＬＣ图谱（图４）。结果表明，虽然季节对黄酮类化合物的含量有影响，但是单一物质的百分比保持不变（图５），而且发现干燥和高温可以促成黄酮类化合物的积累。
图４克罗地亚洋槐蜜中黄酮类化合物的ＨＰＬＣ指纹图谱
摘要：介绍一种用发酵法生产即食米粉的方法。
关键词：米粉、发酵米粉、即食米粉。
１引言
方便面的极大普及使人们自然会联想到米粉，如何生产出象方便面一样用开水冲泡若分钟后即可食用的即食米粉已成为一个重要的研究项目。
即食米粉有两项重要技术指标：１复水性、２吐浆率，这两项指标对即食米粉的品质有很大的影响。人们总希望即食米粉的复水时间短，吐浆率低。
传统的发酵米粉，在米粉米粉制作前，先将大米发酵，然后进行米粉的制作。发酵法生产出的米粉具有易熟、吐浆率低的特点，这两点对即食米粉是非常重要的，为此我们研制了一种采用发酵法生产即食米粉的工艺。
２原料及工艺流程
２．１原料
早籼米、晚籼米。
２．２工艺流程
发酵菌种
↓早籼米、晚籼米→配比→洗米→除砂→过滤→磨浆→板框过滤→发酵→制胚→预蒸→揉粉（１）→揉粉（２）→揉粉（３）→挤丝→蒸丝→时效→搓散→成型→烘干→包装
即食发酵米粉工艺探讨江西省粮油科学技术研究所潘少鹏
图５不同年份克罗地亚洋槐蜜中各种黄酮类化合物的含量百分比随着对蜂蜜中黄酮类化合物研究的不断深入，许多单花蜜中的黄酮类化合物被检测出来，由于不同来源的蜂蜜其含量存在一定的差异，因而为蜂蜜指纹图谱的建立和应用提供了可能和意义。然而，建立每一种蜂蜜黄酮类化合物的指纹图谱需要做大量的工作，尤其是样品的采集对准确、有效的建立指纹图谱非常重要。
４．蜂蜜指纹图谱的发展前景
在作为保健品频繁的出现于消费市场的同时，蜂蜜也是目前我国食品检测合格率最低的品类，既有生产加工环节问题，也有原料环节的问题。鉴于高效液相色谱法研究的指纹图谱较多，其应用的广泛性、检测的精确性，有望成为蜂蜜质量研究的最主要的检测方法，为生产商的安全生产、各级检验部门的质量抽查，为消费者安全、放心的食用蜂蜜提供更有效的保护技术。
采用高效液相色谱分析技术建立单一花蜜的指纹图谱，是未来蜂蜜产品检测的主要凭证，将大力推动蜂蜜市场的规范化、品质化、国际化。
国外的学者研究了蜂蜜中某些氨基酸的抗氧化性，证明脯氨酸的含量随着蜂蜜种类的不同而不同，既可作为蜂蜜中总氨基酸水平的尺度标准，也可作为蜂蜜品质的另一标准；有些情况下，也标志着蜂蜜的成熟度和掺假度。因而，除糖类和黄酮类化合物，氨基酸也可作为鉴别蜂蜜质量的主要指标之一，成为一个新的研究方向。另外，酚酸与脱落酸高效液相指纹图谱也将作为鉴别蜂蜜种类的主要手段。
如何建立百花蜜的指纹图谱，国外已经开展了一些探索性的研究。我国拥有丰富的蜜源，其中许多单花蜜具有地域特色，但是我们对其中含有的活性成分的研究很欠缺。因而在未来的研究中，需要我们做大量的基础工作，确定有效成分，收集产地、采收期及酿造加工方法等资料，建立系统、全面的蜂蜜指纹图谱库，经过十几年甚至几十年的研究积累，采用指纹图谱来控制蜂蜜质量的想法才能真正得以实现，使之更好的为人类的健康服务。
参考文献（略）
中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)
关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知 国药管注[2000]348号 2 年 8 月 1 5 日 发 布 各省、自治区、直辖市药品监督管理局：为加强中药注射剂质量管理，我局在《关于加强中药注册管理有关事宜的通知》(国药管注［2000］157号) 中要求“中药注射剂应固定药材产地，建立药材和制
剂的指纹图谱标准，具体要求另行发布”。据此，我局在组织专家论证的基础上制定了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，现予发布，并就有关事宜通知如下：一、新的中药注射剂指纹图谱标准复核，临床试验用药品，其药材和制剂的指纹图谱标准由省级药品检验所复核；生产用药品，其制剂的指纹图谱标准由中国药品生物制品检定所进行二次复核。二、已批准生产的中药注射剂，其质量标准若缺乏内在质量控制指标和无严格工艺条件，应提高和完善并起草试行标准，在此基础上制订药材和制剂的指纹图谱标准，试行标准起草管理要求同《中药仿制药品试行标准管理规定》，此项工作由国家药典委员会组织实施。三、已批准多家生产的中药注射剂，各生产厂家可根据实际情况单独或联合起草药材和制剂的指纹图谱。联合起草工作由国家药典委员会牵头组织进行。四、已批准生产的中药注射剂，其药材和制剂的指纹图谱标准复核由省级药品检验所进行，需二次复核的品种由国家药典委员会组织完成。五、制定指纹图谱所需的对照品(单一化合物或提取物)，由生产单位向中国药品生物制品检定所提供对照品原料及有关技术资料，经标
定合格后统一发放。附件：《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》国家药品监督管理局二○○○年八月十五日中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。(一)指纹图谱的检测标准包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下： 1.名称、汉语拼音按中药命名原则制定。 2.来源 包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固
中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。 一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求 中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。 (一)指纹图谱的检测标准 包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下： 1.名称、汉语拼音 按中药命名原则制定 2.来源 包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药应固定产地和炮制、加工方法。供试品的取样参照《中国药典》2000年版中规定的中药材的取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。 3.供试品的制备
应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析中药材与注射剂指纹图谱的相关性。 4.参照物的制备 制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。 5.测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据中药材所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定；以光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定。 6.指纹图谱及技术参数 （1）指纹图谱 根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，其指纹图谱的记录时间一般为1小时；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱方法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。对
中药指纹图谱的研究现状与进展 一、中药指纹图谱的含意 中药指纹图谱借用了法医学中的指纹鉴定的概念，通常是指借助于现代分析及检测技术来表达中药（主要是次生代谢产物）化学信息特征的指纹图谱，包括含中药材（原料药材）指纹图谱；中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱和中药制剂指纹图谱。中药指纹图谱是组分群体的特征图谱，能全面反映中药所含化学成份的种类与数量，进而反映中药材及产品的质量。它是一种十分可行的质量控制模式，运用整体性与模糊性的基本属性，即物种特征的唯一性和同种个体间的相似性，为中药材和中成药提供综合的、宏观的和可量化的质量评价，可使中药质量评价过程更加科学化、标准化。 二、中药指纹图谱的属性 中药指纹图谱是以各种分析技术为依托的质量控制模式，通过特定条件下完整图谱的整体信息来鉴别真伪，同时，在定量操作的前提下，用所得到的量的信息来估量被测样品的量的差别。 中药指纹图谱有两个基木属性：整体性和模糊性。所谓整体性，是指要把所得指纹图谱作为一个整体进行评价，而不是孤立地看其中单一峰的有无、高低来判断药材或成药质量；而模糊性是指个体样品本身就存在着差异，难以精确地进行测量，绝大多数的指纹图谱本身就存在模糊性，不能保证所得的指纹图谱中每个峰都没有重叠，而且也不能保证所得的图谱包含了样品的所有特征，只要能固定图谱中关键部分就可对样品进行质量控制。 三、中药指纹图谱的起源、发展与构建 中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。最先发展起来的，目前最主要和常用的是中药化学指纹图谱。中药化学指纹图谱首推色谱方法和联用技术。光谱最常用的是红外光谱(IR)，色谱最常用的是薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)，近来又出现了X-射线粉末衍射指纹图谱。现代指纹鉴定始于19世纪末的犯罪学和法医学。每个人的指纹在微小的细节构造上各有不同，可以以此鉴别每个人的特征。指纹图谱技术应用于植物药质量控制，是从20世纪70年代色谱技术的发展开始的。人们大量采用薄层色谱(TLC)方法，将植物中化学成分展载于由各种担体铺成的薄层板上，根据薄层板上的斑点的位置、大小、颜色、数目进行定性鉴别，这种薄层鉴别方法具备了指纹图谱的特征。20世纪70年代及80年代，出现了薄层扫描仪，日本和我国部分学者用薄层扫描仪得到复方成药扫描图作为色谱指纹图谱，尝试应用于药材及成药的分析。20世纪80年代及90年代，高效液相色谱技术得到发展，同时植物药中化学成分的分离鉴定，活性成分的不断阐明，高效液相色谱广泛应用于中药的定性、定量分析。随着HPLC—MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。中药指纹图谱的发展概要见图1。 构建指纹图谱的步骤通常包括:样品采集、方法建立、数据分析、样品评价和方法检验。样品采集是指采集足够多反映样品质量的标本；方法建立是指选取适当的方法建立指纹图谱并进行考察；数据分析是对所得数据进行处理找出共性与异点，确定评价指标；样品评价是指按所确定指标对样品进行质量评价找出孰优孰劣；方法检验是指在方法确立后的一段长时间内对更多未知样品进行检测，进一步考察方法的可行性。指纹图谱的构建与评价流程见图2。
DNA指纹图谱法的基本操作：从生物样品中提取DNA（DNA一般都有部分的降解），可运用PCR 技术扩增出高可变位点（如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 三. 实验材料和试剂 1. DNA样品 2.化学试剂和溶液 （1）DNA样品反应缓冲液：100mM Tris，200mM NaCl，20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 （2）EcoRⅠ限制性内切酶 （3）PstⅠ限制性内切酶
（4）电泳缓冲液（50×TAE） Tris 242g 冰醋酸57.1ml EDTA（0.5mol/L pH 8.0）100ml 使用时用蒸馏水稀释50倍。 （5）样品缓冲液（DNA sample loading dye） 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 40%（W/V）蔗糖 （6）溴化乙锭（EB）10mg/ml （7）琼脂糖agarose（电泳级） （8）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢDNA markers 3. 仪器设备和消耗品 电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器（10μl，200μl，1000μl）、离心管、一次性枪头（200μl，1000μl）。 四. 实验步骤 1. DNA样品的制备 采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜；利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37孵化数小时，消化蛋白质分离DNA；使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA；用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀DNA。
万方数据
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中药指纹图谱的不同方法特点及应用 作者：赵德玉， 毕桂宏 作者单位：辽阳市中医院,辽宁,辽阳,111000 刊名： 中华中医药学刊 英文刊名：CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 年，卷(期)：2007,25(3) 参考文献(21条) 1.ROY Upton高效薄层色谱在美国草药典中的应用[期刊论文]-中药新药与临床药理 2001(03) 2.谢培山中药色谱指纹图谱鉴别的概念、属性、技术与应用[期刊论文]-中国中药杂志 2001(10) 3.钱浩泉;李彩君;谢培山高良姜及其近缘植物挥发油成分的气相色谱指纹图谱研究[期刊论文]-中药新药与临床药理 2001(03) 4.凌大奎气相色谱保留指纹谱用于中药材鉴别的研究 1995(04) 5.苏薇薇中药指纹图谱及计算机信息处理[期刊论文]-世界科学技术-中医药现代化 2001(03) 6.丁建弥用随机扩增多态DNA(RAPD)技术鉴定野山人参[期刊论文]-中成药 2001(01) 7.徐朝辉同种不同产地牛蒡子DNA指纹图谱特征研究[期刊论文]-中草药 2001(06) 8.袁湘林基体辅助激光解析电离飞行时间质谱用于中草药黄芪的鉴别的研究[期刊论文]-药物分析杂志 2001(01) 9.孙素琴;白雁道地山药红外指纹图谱和聚类分析的鉴别研究[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2003(02) 10.秦海林何首乌和掌叶大黄唐古特大黄的1H-NMR指纹图谱解析 1999(11) 11.秦海林核磁共振氢语法鉴别黄连的研究[期刊论文]-药学学报 1999(01) 12.秦海林核磁共振氢语法鉴别黄连的研究[期刊论文]-中草药 2000(01) 13.周俊国中药蛇床子的粉末X衍射分析[期刊论文]-中草药 1999(01) 14.胡平;罗安国;王如期中药菟丝子的高效毛细管电泳法鉴别 1997(07) 15.张朝辉;范国荣;徐国钧12种海马、海龙药材高效毛细管电泳法鉴别 1998(05) 16.沈平女襄高速逆流色谱(HSCCC)技术与色谱指纹谱[期刊论文]-中成药 2001(05) 17.Fang xingchun;Yin xia;xiang Bingren Classification of Chinese TriditionalMedicine-Shanyao Pyrolysis/High Resolution GC/Pattern Recognition 1990(02) 18.粟晓黎;林瑞超;王兆基中药鬼臼毒性成分HPLC/UV指纹图谱分析方法研究及与威灵仙、龙胆HPLC图谱比较[期刊论文]-中成药 2000(12) 19.施超欧;陶萍丹参注射液主要成分HPLC及LC-MS定性分析[期刊论文]-世界科学技术-中医药现代化 2001(05) 20.颜王贞;林巧玲黄连薄层扫描指纹图谱研究 1993(06) 21.李信炯黄连薄层扫描指纹图谱研究 1987(01) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/856076599.html,/Periodical_zyyxk200703091.aspx
黄连中生物碱成分及药理作用研究进展 发表时间：2016-05-25T09:19:25.937Z 来源：《医师在线》2016年1月第2期作者：王双燕石宝堂[导读] 生物碱是含负氧化态氮原子，存在生物有机体中的环状化合物，常表现出较强的生物活性[1]。 （ 1云南经济管理学院云南 650106 2昆明医科大学海源学院云南 650106） 【摘要】黄连中生物碱主要包括黄连碱、巴马汀、表小檗碱、药根碱，具有抗菌、抗炎、降血脂、降血糖、减肥、抗焦虑、抗肿瘤、保护胃黏膜等多种药理学作用，在心脑血管病、痴呆、糖尿病、感染性疾病的治疗，具有广阔的发展潜力。【关键词】黄连；生物碱；药理作用；研究进展 生物碱是含负氧化态氮原子，存在生物有机体中的环状化合物，常表现出较强的生物活性[1]。黄连是常用中药材，属毛莨科黄连属，始载于《神农百草经》，其根茎呈连珠状且色黄而被称为“黄连”，有清热燥湿、泻火解毒功效[2]。中药药理学研究是当前药学研究的热点领域，本文对黄连中生物碱成分及药理作用研究进行概述。 1 黄连中生物碱成分研究进展 小檗碱又称黄连素，被广泛应用于中药制剂，黄连是提取小檗碱的主要药材，目前已开发出多种制剂。黄连素是一种氮杂环化合物，在生物系统中可经氨基酸合成，熔点145℃，小檗碱以季铵型、醛型、醇型三种不同形成存在，其中前者最多。黄连碱主要来源于黄连根茎，是一种常见的异喹啉生物碱，在乙醇溶液中可以浅黄色针状结晶形式存在，其硫酸盐为黄色晶体，不溶于水和乙醇。巴马汀又被称为黄藤素，是黄连中特殊的生物碱，主要存在于黄连根茎部位，熔点198-201℃，易溶于热水，但在有机溶液中不易溶解，经氢化可生产延胡索乙素。药根碱属四氢异喹啉生物碱，组成与黄连素基本相同，熔点208～210℃，碘化物呈红黄色，易溶于水、乙醇，硝酸盐为黄棕色针状晶体，分解温度228～229℃。 2 黄连中生物碱药理作用研究进展 黄连中生物碱含量丰富，具有较好的抗菌作用，为天然的抗菌药物，长期以来被用于感染性疾病治疗；近年来还被用于防治老年痴呆性疾病[3]。随着现代医学的发展，黄连素的药理作用研究越来越深入，为黄连价值开发奠定了基础。 2.1 抗菌作用 黄连中的四种生物碱均有一定的抗菌作用，为一种广谱抗菌药物，研究证实对革兰氏阳性和阴性菌，如伤寒杆菌、肠炎沙门氏杆菌、金葡萄球菌、大肠杆菌、等都有一定的抑制作用。小檗碱最早被用于临床抗感染，其对大肠杆菌、霍乱弧菌具有较强的抑菌活性。体外研究证实其对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、哈氏弧菌也有较高的抑菌活性，但对停乳链球菌几乎无抑制作用[4]。小檗碱对许多致病菌都有不同程度抑制作用，但大多数研究也局限于体外实验阶段，其抑菌作用主要可能通过抑制拓扑异构酶I以及拓扑异构酶Ⅱ活性影响细菌DNA 合成发挥作用。黄连碱具有抑制A型单胺氧化酶作用，对白色念珠菌具有较强的抑菌活性，对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用，其与真菌具有很高的亲和力，使其较易进入菌体细胞内，破坏细菌正常生理功能。巴马汀其对金黄色葡萄糖球菌、肺炎克雷伯菌、痢疾杆菌都有一定的抑制作用，已被用于妇科炎症、呼吸道感染、结膜炎的治疗。表小檗碱抑菌作用尚不清楚，可能存在潜在的抗菌作用。药根碱抑菌活性最小，但其抗菌方面研究空间仍较广阔。小檗碱药理研究较多，部分学者试图通过对小檗碱进行结构修饰以提高其抗菌活性，并取得一定成效，研究证实在小檗碱9位去甲基引入酰氧基或苯氧丁基，可增强其抗菌活性。但基团的引入对小檗碱抗菌活性提高不具有普遍性。 2.2 抗糖尿病作用 糖尿病是胰岛β细胞受损或完全破坏而不能正常代谢引起的疾病，血糖升高是糖尿病的主要症状。Hep G2细胞属于肝胚胎瘤细胞株，和人体肝细胞表型十分相似，βTC3细胞属于胰岛素瘤细胞株，具有分泌胰岛素功能。实验发现，小檗碱可促进Hep G2中葡萄糖消耗，且呈现明显的剂量依赖，在5～100μmol/l范围内，小檗碱作用量与细胞葡萄糖消耗量呈正相关，但不会影响细胞功能[5]。小檗碱还可通过降低醛糖还原酶活性改善糖尿病。实验研究证实黄连复合生物碱由于黄连生物碱的相互协同作用，可增进降糖效果，小檗碱降糖活性次之，黄连碱再次之，巴马汀最差。药物可能通过蛋白质磷酸化及其级联信号传导等多个靶位点，调控信号传导，触发胰岛素抵抗，进而降低血糖。 2.3 抗肿瘤作用 恶性肿瘤已成为死亡三大因素之一。研究发现，药根碱对黑色素瘤新生血管具有明显的抑制作用[6]。此外，含有小檗碱的黄连药材可作为食道癌治疗的药物之一。一项体外研究证实，小檗碱非毒性剂量可降低人肺癌细胞A549中的MMP-2、uPA水平，调节金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-2）和尿激酶型纤溶酶原激活抑制剂（PAI）抑制肺癌细胞转移。在卷烟中添加黄连生物碱可使患者获益[7]。黄连中生物碱具有抗炎作用，可预防细胞突变。 2.4 抗心血管疾病 药用黄连用于治疗心脑血管病，对抗心力衰竭、抑制心肌炎、改善急性脑供血与供氧不足等疾病。小檗碱可调节心肌缺血、修正心衰，这可能与其作用于心肌周围阻碍血管，减少血液阻力，减轻心脏负荷有关。黄连解毒汤可改善脑部循环。药根碱具有明显的调脂作用，可上调LDLR蛋白表达，促进胆固醇转化为胆汁酸，提高胆汁酸排泄率，降低血胆汁酸含量。巴马汀可明显诱导巨噬细胞释放炎性因子NO，发挥抗炎作用。 3 小结 新药的研发并非一朝一夕之事，黄连中生物碱种类不多，但其药理学作用较复杂，体外研究、动物实验证实具有抗菌、抗炎、降血脂、降血糖、减肥、抗焦虑、抗肿瘤、保护胃黏膜等多种药理学作用，但对于临床研究仍较为肤浅。今后，应积极开展临床研究，结合临床实践研制相关衍生物，寻找更具有开创性、制剂意义的药理作用。 【参考文献】 [1] Manske R H F. The Alkaloids: Chemistry and Physiology, Vols. 1-20, New York, Academic Press, 1950-1979. [2]中华人民共和国卫生部药典委员会中华人民共和国药典[M]，化京:人民卫生出版化化学工业出版化2010, 285. [3]李亚娜，陶庆春.中药抑菌的研究现状及思考[J].国际检验医学杂志，2014， 35(2): 198-200.
DNA指纹图谱分析实验 一. 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、?肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA?指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA 指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，?如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。
中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (草案) 为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下。需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。 一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求 中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制(如醋制、酒制、炒炭等)，则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。 (一)指纹图谱的检测标准 包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下： 1.名称、汉语拼音 按中药命名原则制定。 2.来源 包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药应固定产地和炮制、加工方法。供试品的取样参照《中国药典》2000年版中规定的中药材的取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。 3．供试品的制备 应根据中药材中所令化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析中药材与注射剂指纹图谱的相关性。
4．参照物的制备 制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所合成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。 5．测定方法 包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据中药材所合化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定；以光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定。 6．指纹图谱及技术参数 (1)指纹图谱 根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，其指纹图谱的记录时间一般为l小时；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱方法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。对于化学成分类型复杂品种，必要时可建立多张指纹图谱。 指纹图谱的建立：根据10批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数，制定指纹图谱。 (2)共有指纹峰的标定 采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间。根据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰。 (3)共有指纹峰面积的比值 以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰(要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰)的峰面积作为1，计算其它各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。中药材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于土20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于土25％；单峰
摘要：指纹图谱技术在食品的质量控制中起着重要的作用。本文主要介绍了高效液相色谱指纹图谱在蜂蜜研究中的应用，以期为蜂蜜的鉴定、质量控制及标准的制定等方面工作奠定基础。 关键词：蜂蜜高效液相色谱指纹图谱 蜂蜜是一种传统的天然保健食品。它是由蜜蜂采集植物的甜味分泌物，通过蜂蜜自身的消化，转化作用及蜜蜂通过气流干燥作用，使水分从花蜜中含６０％以上降低到２０％以下。一般蜜蜂从采集花蜜到酿制为成熟蜜，正常情况下需要３～５ｄ时间［１］［２］。 糖类是蜂蜜的主要的成分，其中有单糖、双糖、低聚糖和多糖，单糖中的葡萄糖和果糖占蜂蜜总糖的５５％～７５％，而双糖和三糖的含量因蜜源种类的不同而变化。此外，蜂蜜还含有多种蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素及人体所必须的矿物质及微量元素，营养十分丰富［２］［３］。多年来的科学研究与医学临床都证明，蜂蜜具有促进食欲、改善肠胃功能、促进消化吸收、镇静安神、提高肌体免疫能力，促进儿童生长发育等功效；它不仅对婴幼儿、运动员、老人及体弱多病者、重体力劳动者、高强度脑力工作者来说是一种直接有效的营养补充来源，而且对治疗烧伤、烫伤、溃疡愈合、促进伤口愈合及心血管病的辅助治疗等方面来说有很好的疗效［４］｛５］。 蜂蜜作为一种营养丰富、易被人体吸收的天然食品在国内外市场上深受消费者欢迎。为规范蜂蜜市场，保证消费者的利益，我国于１９８２年和２００２年分别颁布了蜂蜜行业标准和推荐性国家标准；但是目前就蜂蜜质量来说，全国各地在蜂蜜生产、流通中仍存在很多不规范的环节，更甚的是出现许多人为掺杂假使的行为，而当前的国家标准不能满足快速、准确的检测需要。 高效液相色谱指纹图谱技术已经广泛的应用于食品行业，特别是药物化学中的中药指纹图谱已经取得了重大的进展。在蜂蜜市场较为混乱且没有准确、快捷的检测方法的情况下，期望建立蜂蜜的高效液相色谱指纹图谱成为必然的趋势。 １．指纹图谱的含义 “指纹（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ）”识别技术起源于１９世纪末２０世纪初的犯罪学和法医学。作为一种综合、宏观的和可量化的鉴别手段的指纹图谱，是指经过适当的处理后，采用一定的分析手段如光谱或图谱，得到能够标示该样品特征的色谱或光谱的谱图或图象。在完整地呈现出色谱的特征“面貌”的前提下，表达了对照品与待测样品指纹图谱的相似性，用以产品真伪鉴别，评价其质量的均一性和稳定性。 蜜源植物的花蜜是蜂蜜的主要来源，由于同种蜜源植物具有整体的遗传相似性，因此，同一种类的单一花蜜在成分上也具有相似性。同时，经采集、酿造后的成熟蜂蜜其成分除糖类的含量有明显变化外，来源于蜜源植物的次生代谢物质等微量活性成分一般不会发生较大的变化，这使指纹图谱技术应用于蜂蜜种类和真伪鉴别成为可能。借助于现代分析技术对蜂蜜中主要特征功效成分信息以图形（图像）的方式进行表征并加以描述，这就是蜂蜜指纹图谱的内涵［１８］。 ２．指纹图谱的种类 指纹图谱已广泛的应用于食品品种和质量的鉴别，其根据测定方法的不同，大体分为色谱指纹图谱、光谱指纹图谱和ＤＮＡ指纹图谱。其中，以高效液相色谱指纹图谱应用最为广泛。 ２．１色谱指纹图谱 色谱技术种类繁多，是获得指纹图谱的最常用的方法。其中，高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）是应用最多的一种方法，６０％～７０％的有机物均可应用，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，是所有光谱色谱分析中最适合绘制指纹图谱的方法。近２０多年来，随着仪器和柱技术、样品预处理技术的发展成熟及仪器的日益普及，ＨＰＬＣ作为食品中的营养成分、功能因子、食品添加剂及污染物的一种快速、准确、易于自动化的检测手段，在食品分析中的应用发展很快；高效液相色谱－质谱（ＭＳ）联用，能够将未知成分的各峰进行归属；当前，高效液相色谱已经用于蜂蜜某些糖分的定量与定性的常规分析；反相液相色谱在类黄酮成分分析方面也有很多的报道［６］。 薄层色谱（ＴＬＣ）法出现于１９５６年，具有操作简单，展开剂组成灵活多样，色谱后衍生方便，可以提供色彩斑斓 蜂蜜高效液相色谱指纹图谱的研究进展 西南大学食品学院王文静
国家药品监督管理局 二○○○年八月十五日 为了加强中药注射剂的质量管理，确保中药注射剂的质量稳定、可控，中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，需制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。 一、注射剂用中药材指纹图谱研究的技术要求 中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如原药材需经过特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。 (一)指纹图谱的检测标准包括名称、汉语拼音、拉丁名、来源、供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。有关项目的技术要求如下： 1.名称、汉语拼音按中药命名原则制定。 2.来源包括原植、动物的科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等，矿物药包括矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。动、植物药材均应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法，矿物药应固定产地和炮制、加工方法。供试品的取样参照《中国药典》2000年版中规定的中药材的取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。 3.供试品的制备应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于仅提取其中某类或数类成分的中药材，除按化学成分的性质提取各类成分制定指纹图谱外，还需按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱，用以分析中药材与注射剂指纹图谱的相关性。 4.参照物的制备制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。 5.测定方法包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据中药材所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定；以光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定。 6.指纹图谱及技术参数 (1)指纹图谱根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，其指纹图谱的记录时间一般为1小时；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱方法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。对于化学成分类型复杂品种，必要时可建立多张指纹图谱。指纹图谱的建立：根据10批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数，制定指纹图谱。
中药指纹图谱和特征图谱的区别是什么?各有什么意义? 区别:中药材或中成药经过适当处理后 , 利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图谱及其数据 , 称为中药指纹图谱。它可以较全面地反映中药所含化学成分的种类与数量 , 进而反映中药的质量和中医用药所体现的整体疗效 ; 现阶段中药的有效成分大多尚未明确 , 中药指纹图谱的整体性和模糊性正好符合中药质控的要求 , 较之单一成分或指标成分的质控方法 , 更具有科学性和全面性;中药特征图谱是指中药材经过适当的处理后 , 采用一定的分析手段和仪器检测得到 , 能够标识其中各种组分群体特征的共有峰的图谱。它是一种综合的、可量化的鉴别手段 , 可用于鉴别中药材的真伪 , 评价中药材质量的均一性和稳定性。中药特征图谱可分为化学 (成分特征图谱和生物特征图谱。 意义:中药材多为植物的干燥器官 , 由于复杂的自然环境、社会状况以及我国历史上科技发展不平衡等多种原因 , 造成了中药材在应用方面的复杂性。同一名称的中药材可能来自不同基源的植物。同一基源的中药材由于产地不同、采收季节和生长年限不同而存在差别。一些中药材 , 特别是名贵药材 , 常可见到伪品与正品相混淆。由于以上因素的存在 , 使得不同来源的同种中药材其化学组成有可能相同 , 也有可能不同 , 这就必然影响到中医的临床疗效和中药的实验研究 , 并影响以其为原料生产出的中成药的化学组成 , 从而影响其质量和疗效。此外 , 我国中成药品种繁多 , 中成药生产过程中各工艺环节的稳定性等多种因素对产品的化学组成也具有重要的影响。从现有的中药内在质量控制现状来看 , 还存在很多问题需逐步解决。其中 , 最突出的问题之一就是中药整体化学特征的表征。因此建立中药指纹图谱对于更加客观地从整体上评价中药的内在质量具有重要意义。同样,建立准确有效的鉴别中药材方法——中药特征图谱,对于我国中药资源丰富 , 但长期以来 , 缺乏系统的整理和归类 , 导致中药商品混乱 , 中药材同名异物、同物异名的现象屡有发生 , 甚至出现有以假充真 , 以次充好的情况具有重要意义。
黄连HPLC指纹图谱研究进展 姓名：方功学号：211134****班级：中药专硕3班 摘要：中药质量标准现代化的模式将是中药化学指纹图谱配合有效成分含量测定和必要的检查项目,较全面地整体控制中药质量，中药指纹图谱研究是中药质量标准现代化研究的关键技术。本文就黄连HPLC 指纹图谱研究的情况进行归纳综述。 关键词：黄连中药指纹图谱 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用HPLC指纹图谱控制质量。我国自2000年8月国家药品监督管理局颁发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求( 暂行) 》以来, 中药指纹图谱的研究已经成为中药研究的热点。高效液相色谱法( HPLC) 也在中药成份分离、分析中获得了广泛的应用, 特别是三维高效液相色谱近年来发展迅速, 使得HPLC在中药质量控制中占有重要地位, 被认为是目前检测中药指纹图谱的首选方法。 1.中药HPLC指纹图谱定义 中药HPLC指纹图谱系指中药材或中成药经适当处理后, 采取HPLC分析手段, 得到能够标示该中药材或中成药特性的共有峰的图谱。指纹图谱一般包含两层含义:（1）必须反映出该药材(或成药)有别于其他任何物质;（2）对于中药材,指纹图谱还能反应出产地和采收期不同而造成的差异; 对于中成药, 则能反映出同一产品不同批次间的质量差异, 差异越小说明药材(或成药) 的稳定性越好。 2.黄连HPLC指纹图谱的构建 2.1黄连HPLC法分离模式 黄连HPLC法分离模式有反相色谱法( RPC) , 正相色谱法( NPC) , 梯度洗脱法, 离子交换色谱法, 分子排阻色谱法( SEC) , 手性HPLC法等。RPC比较简单方便, 柱性能较好, 是应用最广泛的HPLC法。在HPLC方法建立时, 应首先试用RPC, 若初步试验证明样品不适合使用RPC分离, 则改为NPC。离子交换色谱法现在主要用于生物来源样品, 如氨基酸、肽、核酸等。SEC是获得聚合物分子量及其分布的基本方法,《中国药典》2000年版规定多糖的分子量分布测定采用这种方法。手性HPLC可用于具有不同物理化学性质的非对应异构体的分离方法[1]。 2.2 黄连HPLC指纹图谱方法构建 2.2.1 色谱条件的选择 选择色谱条件时, 首先应考虑到物质成份能在液相色谱中完全显示, 即特征峰数要尽量地多,且分离度要好, 主要的指标成份、活性成份或用于定量的成份的分离度应能达到有效的分离。进样量也应适宜, 应使最小成份特征峰的面积能达到4～5位数以上。能用等度洗脱就不用梯度洗脱, 即使用梯度洗脱也应尽量采用线性梯度。在保证专属性、重复性的前提下, 以选择简单实用, 便于实施的试验条件; 如果能用通用柱, 就不用特殊色谱柱; 为了使指纹图谱规范化, 最好能根据指纹谱评价的实际, 选择标准色谱柱。除此, 还应使系统适用性试验、稳定性试验、精密度试验等方法学考察内容符合HPLC指纹图谱的要求。 2.2.2 检测器的选择 HPLC指纹图谱中应用较多的有紫外检测器( UVD) , 二极管阵列检测器( DAD) , 荧光检测 器( FD) , 电化学检测器( ECD) , 蒸发光散射检测器( ELSD) ,示差折光检测器( RID) , 液谱联用技术等。
方法 1 参照物的选择及溶液制备绿原酸为金银花的主要成分，而且所选择的金银花药材供试品溶液提取方法很容易将绿原酸提取出来，在色谱图中容易辨认，所以选择绿原酸作为参照物。参照物溶液的制备方法：取绿原酸对照品适量，加50％甲醇配制成每毫升含0.06 mg的溶液，即得。 2 检测波长及流动相的选择根据文献报道，绿原酸类化合物是金银花的主要活性成分，经测定绿原酸参照物溶液和金银花药材提取液在327 nm处均有最大吸收，因此，选择327 nm 为测定波长。在用同一浓度的样品溶液、色谱柱、流速（0.7 ml/min）、检测波长和HPLC 仪器的条件情况下，通过对多种溶剂系统进行考察，最后确定的最佳流动相为甲醇-0.1%磷酸（40∶60），流速为0.7 ml/min，检测时间30 min。 3 提取方法的选择金银花中主要有效成分为绿原酸、异绿原酸，它们是奎宁酸和咖啡酸的酯，其中绿原酸含量高，是金银花及其相关制剂的活性指标成分。参照文献资料［4，5］，经对多种提取溶剂研究，结果表明，以50%甲醇溶液作为提取溶液进行超声提取，能将金银花中绿原酸类成分充分提取，提取液中有效成份不需要进一步提取分离与富集，可以直接进样分析。 4 供试品溶液的制备取金银花药材，置硅胶干燥器中干燥24 h，研细，取约0. 5 g，精密称定，置100 ml具塞锥形瓶中，加50％甲醇50 ml，超声处理30 min，用微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，置50 ml量瓶中，用50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 5 测定法及数据处理分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录30min的色谱图。用中国药典委员会推荐的“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”（版本2004A）进行数据处理，将多个批次的色谱图进行比较，得到可全面反映多个色谱图特征的金银花药材的对照指纹图谱。以此模式为基准，计算每个色谱图与之相比较的相似度（范围应在0.90～1.99之间）。
药指纹图谱建立的原则和步骤 中药指纹图谱建立的原则和步骤 （一）建立指纹图谱的一般原则 中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。唯此，才能保证指纹图谱的标准化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。 1.系统性是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映其中的皂苷类成分；银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。 2.特征性是指指纹图谱中反映的化学信息（如保留时间）应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。 3.稳定性是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。 （二）建立指纹图谱的一般步骤 1.方案设计与思路 （1）研究对象的确定 在调研有关文献、新药申报资料(质量部分和工艺部分)及其它研究结果的基础上，尽可能的详尽地了解药材、中间体及成品中所含成分的种类及其理化性质，综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品和中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。 例如，黄芪含黄酮、皂苷及多糖三类有效组分，黄芪多糖注射液及其中间体的指纹图谱则以多糖为研究对象，黄芪原药材的指纹图谱应把黄酮、皂苷及多糖作为研究对象。 复方注射剂应根据君臣佐使的原则，以君药、臣药中的有效成分作为指纹图谱的研究对象，佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助、补充研究。 （2）研究方法的选择 研究方法应根据研究对象的物理化学性质来选择。大多数化合物可采用HPLC。例如黄芪中黄酮、皂苷、多糖等。挥发性成分应采用GC。例如鱼腥草中的鱼腥草素、土木香中的土木香内酯、异土木香内酯和二氢土木香内酯等。某些有机酸经甲酯化后亦可用GC分析。采用上述方法难以分离检测的成分，可考虑使用TLC和CE。 一个中药制剂的指纹图谱可以同时采用多种方法进行研究。选择方法时，还需考虑药品检验系统复核时的设备、技术等因素。 （3）研究内容 根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》(暂行)的规定，