荧光定量PCR仪校验规程
1目的
荧光定量PCR仪是复杂精密仪器，其校准工作需由专业工程师进行。除与仪器厂家达成协议定期校准以外，以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。
2范围
新购置、使用中、检修后的荧光定量PCR仪。
3校准用试剂
标准化荧光PCR试验试剂及102、103、104、106标准品。
4校准方法
4.1分析室内质控图，及时发现系统误差。经过分析排除了试剂和人员误差后，确定仪器是否出现了检测偏差需要校准。
4.2确定仪器需校准后，进行仪器状态效验试验
4.2.1准备标准化试剂及标准品
4.2.2在仪器处于校准状态下，用标准化试剂对102、103、104、106标准品进行扩增实验，分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。
4.2.3绘制标准曲线，观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和102标准品是否检出。
4.2.4当仅有102标准品未检出时，检查实验全过程。再次上机检测102标准品。
4.2.5当102标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时，先排除实验的人员、试剂因素，再重复实验。如结果依然，联系厂家立即进行仪器校准。
4.3仪器经过校准后，重复该实验。
5.校验周期
一年。
6.参考文件
JJF 1071国家计量校准规范编写规则
JJF 1001 通用计量术语及定义
GBT/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定7.记录表格
《测试设备校验记录表》
荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是 一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
1.目的 规范ABI 7500荧光定量PCR仪操作，保证安全操作，延长仪器寿命 2.范围 适用于ABI 7500荧光定量PCR仪 3.职责 操作人负责本规程实施，部门负责人监督实施。 4.规程 4.1 实验程序运行： 4.1.1首先打开电脑，进入操作系统后，打开ABI 7500荧光定量PCR仪电源。双击桌面上7500 software V2.0.6。弹出Login对话框，默认的User Name为GUEST，点击Login as GUEST，点击OK运行软件。 4.1.2进入界面，选择Advanced Setup。 4.1.3点击Experiment Properties。在Experiment Name栏输入实验名称。 4.1.4点击Plate Setup，点击Define Targets as Samples。设定Target Name的Reporter 为FAM。
4.1.5点击Assign Targets and Samples。设定96孔板。 4.1.5点击Run Method。设定反应程序。 4.1.6点击Reaction Setup设定反应体系。
4.1.7点击Run菜单，点击START RUN。开始运行PCR反应。 4.1.8点击Analysis开始分析实验数据。点击Amplification Plot，可以看到扩增曲线。点击Plate Layout的View Well Table可以看到CT值。 4.2 ABI7500荧光定量PCR仪使用及维护注意事项 4.2.1 实验室的环境： a.电源：UPS或稳压器。 b.通风：仪器的通风应该没有阻挡。 c.温度：实验室应该配有空调。 d.湿度：20-80%。 e.空间：易于操作，安全。 4.2.2 关闭并打开计算机和仪器电源开关: 如果主机和计算机一直在开机使用，每周应该进行一次以下操作：关闭主机电源开关，关闭计算机，然后重新打开计算机和仪器电源开关。 4.2.3 使用不脱毛的布块擦拭仪器表面:重要！切勿使用有机溶剂清洁ABI7500荧光定量PCR仪。每周一次。 4.2.4 执行背景校正（Background calibration）:使用背景校正板。每月一次。 4.2.5 执行纯荧光校正（Pure Dye Calibration）:使用纯荧光反应板。每半年一次。
第1包：实时荧光定量PCR仪参数 1仪器性能 1.1检测模式：HybProbe杂交探针、SimplProbe单探针、染料模式、水解探针、 分子信标、蝎型探针、高分辨率熔解曲线（HRM）等 1.2线性范围：1-1010个拷贝 1.3检测灵敏度：可检测单拷贝基因 1.4模块规格：支持96孔模块与384孔模块 1.5★模块互换：用户可自行更换并升级至384模块，自行手动更换后无需校准 1.6重复性：样品检测C V≤0.15% (50nmol/l荧光浓度) 1.7精密度：≤1.5倍拷贝数差异，置信度≥99.8% 2硬件配置 2.1温控系统 2.1.1★温控模块：采用新型半导体温控模块。 2.1.2★模块设计：所有样本对应的温控模块一体化成型。 2.1.3★温控模块平均温控速率> 6.5 ℃/s 2.1.4样本平均温控速率> 4.5℃/s 2.1.5温度准确性：≤0.1 ℃（37-99 ℃） 2.1.6★温度均一性(Tm)：±0.1 ℃（37-99 ℃） 2.1.7熔解曲线温度分辨率≤ 0.02 ℃ 2.1.8★高分辨率熔解曲线反应时间：<10分钟 2.1.9反应体积：96孔板为10-100ul，384孔板为5-20ul 2.1.10反应时间：40个循环反应：≤60分钟(96孔标准检测) ；≤40分钟(384孔 标准检测) 2.2光学系统 2.2.1光源：新型固态光源 2.2.2★单个光源寿命：> 10000小时 2.2.3检测通道数≥6通道 2.2.4★检测系统：冷CCD
2.2.5所有样本同时激发并采集数据，孔间无时间差 2.2.6光路设计： 2.2.6.1激发滤光片与检测滤光片可自由组合，提供至少20种不同的组合的 检测模式 2.2.6.2采用有效消除光学边缘效应的技术设计 2.2.6.3全固定光路设计，激发光源与检测系统在工作中无需移动，保证系 统稳定性 3软件 3.1颜色补偿功能：具备 3.2软件：具有定性定量（绝对定量、相对定量）、自动报告熔解温度、自动报告 基因分型结果、高分辨率熔解曲线分析等功能，配套的运行和结果分析软件，能 够针对观察到的扩增情况随时增加循环数目，实时动态监测，扩增和检测同时进 行 3.3数据导出：Excel ,TXT, PDF, XML, GIF, PNG, BMP, JPEG 4试剂 4.1配套耗材：开放平台，可使用市面上国产或进口的各品牌试剂及第三方提供的8 连板、96孔板和384孔板 4.2支持的荧光染料种类：包括但不限于FAM?、SYBR?、Fluorescein、SYPRO? Orange、VIC?、JOE?、TET?、HEX?、TAMRA?、Texas Red?、Alexa Fluor 633、 LC Cyan 500、Fluo 3、ResoLight、EvaGreen、LC Green、Cy3、Cy5、Yellow555、 LC Red610、ROX、SYPRO Ruby、LC Red640、Snarf 1、Acid Fuchsin、Cy5.5、 LC Red670、LC Red705等 5仪器配置 5.1主机，配套96孔和384孔模块 5.2除标配外，另配光源寿命> 10000小时的原厂新型固态光源一个 5.3操作手册（中英文版本） 5.4软件安装光盘
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：
（3）Ct值： CT值的重现性：
5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC
荧光定量PCR系统采购要求 一、技术参数要求： 1仪器性能 1.1检测指标：成功区分起始模板为1000和2000个拷贝的浓度差，置信 度>99.8%； 1.2检测模式：染料模式、水解探针、简单探针、分子信标、高分辨率熔解 曲线（HRM）等； 1.3线性范围：2-500个拷贝； 1.4检测灵敏度：可检测单拷贝基因； 1.5检测紧密度：≤1.5倍拷贝数差异，置信度≥99.8%； 1.6反应时间（40个循环）：≤40分钟； 1.7荧光染料校正，无需ROX等被动染料校正。 2硬件配置 2.1 温控系统： 2.1.1温控模块：银质半导体温控模块； 2.1.2 控温范围：40-98℃； ★2.1.3模块平均温控速率：≥6.8 ℃/s； 2.1.4样本平均温控速率：≤6.0℃/s； 2.1.5温度准确性: ±0.25 ℃； ★2.1.6温度均一性（Tm）: ±0.2℃； 2.1.7熔解曲线温度分辨率：0.04 ℃； 2.1.8 梯度PCR功能：可用于梯度PCR实验； 2.1.9 样本容量：96孔板； 2.2光学系统 ★2.2.1光源：高强度白色固态光源； 2.2.2 激发波长：390-710 nm，连续不间断； 2.2.3激发/检测通道数量：4通道；
2.2.4：光路边缘效应：96孔重复实验，Ct值的SD值<0.2； ★2.2.5检测系统： CCD 2.3控制系统 2.3.1控制界面：含有内置触控屏，可脱机运行； 2.3.2支持通过USB控制仪器运行程序和存储数据； 2.3.3数据接收方式：与PC连接后，电脑直接同步获取数据； 2.4 分析软件功能 2.4.1 支持的荧光染料种类开放：包括但不限于FAM?、SYBR?、Fluorescein、 SYPRO? Orange、VIC?、JOE?、TET?、HEX?、TAMRA?、Texas Red?、Alexa Fluor 633、ResoLight、EvaGreen、LC Green等。 2.4.2分析模式：具有定性定量（绝对定量、相对定量）、自动报告熔解温度、 自动报告基因分型结果、高分辨率熔解曲线、阴阳性判读等功能，实时 动态监测运行，扩增和检测同时进行。 2.4.3 数据导出：TXT表单、GIF、 PNG。 2.4.4 数据兼容性：支持生成MIQE国际标准对应的RDML通用数据格式。 3试剂耗材 开放平台，可使用市面上国产或进口的各品牌试剂及第三方提供的96孔板。 二、配件、备件要求：配备操作电脑一台。 三、商务要求 1 质保期：仪器安装调试合格之日起一年； 2 交货时间：合同签订后60天； 3售后服务响应要求：有专职工程师，提供维修服务和技术支持。4小时响应，24小时解决问题。
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
7500荧光定量PCR 仪使用说明 注意事项： 实验过程必须戴干净的一次性乳胶手套进行操作。 PCR 反应所用的96孔板、8联管或单管必须为ABI7500专用，凸盖PCR 管禁止使用。 使用8联管两侧需用空管支撑，使用单管四角需用空管支撑，以防止板槽受力不均。 实验数据用光盘刻录，禁止U 盘拷取，数据可暂存于本机电脑硬盘中，各实验室D 盘中有指定文件夹，中心外部人员数据存于FUWU 文件夹下的子文件夹中。 操作步骤 开机 放入反应板 注：关闭仪器托盘时，应按一个角度推压托盘的右侧。 按压此处 ！ 待电脑启动稳定后，按压7500仪器电源按扭，等待仪器启动（约30 s ）。 当仪器只显示Power 状态指示灯时，方可按压托盘以打开它。
（以下过程按字母顺序a →q 进行操作） 创建反应板文件 双击电脑桌面上SDS 软件图标 打开SDS 软件； a. 从 Assay 下拉列表中选择反应板类型 c. 单击Next 反应板文件类型有以下几种： 1. Relative Quantification (ddCt) Plate （相对定量） 2. Absolute Quantification (Standard Curve)（绝对定量，标准曲线） 3. Allelic Discrimination （等位基因鉴别） 4. Plus/Minus （阳性/ 阴性实验） d. 选择要添加到反应板文件的探针（引物），单击Add 添加选中探针 e. 如果在列表中未列出所需探针，请单击New Detector 创建新探针 f. 单击Next b. 为反应板文件命名
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
目录： 1 安全预防法 2 安装 2.1 交货包装 2.2 仪器的安装 2.3 功能性单元 2.3.1 Mastercycler ep realplex 2.4 启动 2.4.1 realplex模块与热模块之间的连接 2.4.2 Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接2.4.3 与其它部件的连接 2.4.4 realplex软件的安装 2.4.4.1 安装主程序 2.4.4.2 数据恢复 2.4.4.3 开始realplex软件的运行 3. 操作 3.1 管理者登陆 3.2 登陆 3.3 用户变更 3.4 系统配置 3.4.1 对使用者的管理 3.4.1.1 新用户建立 3.4.1.2 编辑用户 3.4.1.3删除用户 3.4.2 用户层 3.4.3 循环仪 3.4.4 realplex 模块 3.4.5 系统层 3.4.5.1 特性 3.4.5.2 登陆出错信息 3.4.5.3 用户登陆 3.4.5.4 软件更新 3.5 检测项目管理 3.5.1 建立检测项目 3.5.2 打开检测项目 3.5.3 保存检测项目 3.5.4 保存模板文件 3.5.5 模板文件的使用 3.5.6 复制检测项目 3.5.7 检测项目的输出 3.5.8 检测项目的输入
建立文件夹3.5.9 3.5.10 删除检测项目和文件夹 3.6 探针管理 3.7 染料管理 3.8 校准 3.8.1 背景校准 3.8.2 颜色校准 3.8.2.1 使用商业的校准工具包进行的颜色校准3.8.2.2 客户特有的染料的校准 3.9 数据库管理 3.9.1 当前数据库的自动保存 3.9.2 当前数据库的保存 3.9.3 输入数据库 3.9.4 数据库的归档 4 编程（检测项目的建立） 4.1 建立一个新的检测项目 4.2 建立板布局 4.2.1 染料的确定 4.2.2 参考染料的选择 4.2.3 样本容积输入 4.2.4 探针类型的确定 4.2.5 背景的确定 4.2.6 样品类型的定义 4.2.6.1 标准 4.2.6.2 阳性对照 4.2.6.3 阴性对照 4.2.6.4 未知样品 4.2.7 复制和标准系列的自动建立 4.2.8 定量的样品类型 4.2.9 相对定量的样品类型 4.2.9.1 多plex分析例子 4.2.9.2 单plex分析的例子 4.2.10 熔点分析中的样品类型 4.2.11 终点测定中的样品类型 4.2.12 +/-检测项目中的样品类型 4.2.13 基因辨识中的样品类型 4.2.12 样品的复制与剪切 4.2.15 删除样品 4.2.16 几个样品的归组 4.2.17 子检测项目的测定 4.2.18 板布局的删除 4.2.19 完整检测项目的板布局编辑 4.3 pcr程序的建立 4.3.1 用模板程序建立一个pcr程序
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
各款荧光定量PCR仪的性能比较 本人从事荧光定量PCR检测试剂的开发工作，用过市场上主流的多款荧光定量PCR仪，如ABI5700，ABI7700，ABI7000，ABI7300，ABI7500，MJ opticon，MJ opticon2，bio-rad ICycler，LightCycler1.5，roter-gene3000，Stratagene Mx3000P，line-gene等等。这种仪器各有各的特点，但都存在不足之处。 ABI公司的荧光定量PCR仪产品比较多，成系列，但目前而言ABI5700和ABI7700不能实时在线地检测荧光，因而已经退出历史舞台，尤其是ABI7700，不但很贵，而且采用苹果机电脑，使用很不方便。ABI7000目前也已经淘汰，我用的这台仪器老出问题，曲线极不光滑，但同样的反应体系在国产机杭州博日line-gene上曲线非常好，在ABI7500上曲线也很光滑，所以，本人估计是ABI7000设计上有不足之处。而且卤钨灯特别容易坏，在南方，我们实验室平均5个月换一个，配件容易坏，后续使用成本就会高一些。 现在市场上的ABI7300就是ABI7000的简单升级版，硬件设计上几乎没有改变，只是换过几个性能更好的配件，软件有所升级。 另外我个人感觉ABI7900（ABI公司第二代产品）有些华而不实，价格应该是所有荧光定量PCR仪中最贵的，硬件上跟ABI7700差不了太多，但性能指标还不如ABI7500（ABI公司第三代产品），硬件设计上也不如ABI7500合理。所以这个型号的仪器，谁买了，用的时候会不呼上当。 ABI7500是ABI公司最成功的产品，各方面性能都不错，虽然加热模块还是有一些边缘效应，但使用中央的孔位效果可以得到保证，在96孔板使用中间的48个孔位，结果都能得到保证。 总的来说，ABI公司在荧光定量领域上还是做出很多贡献的，其仪器在科研上还是可以用的，但由于硬件设计上的缺陷，需要额外的ROX染料进行校正，并且占用了一个检测通道。国内的试剂厂商都不加ROX染料，科研用户一般也不使用，所以其检测的准确性和重复性还是很难保证的，尤其浓度较低的模板进行检测时效果不佳，偏差会很大。 罗氏Roche的LightCycler以运行速度快而著称，在国内市场占有率最高，其设计保证了临床诊断的准确性，又充分考虑了科研功能。但本人最初使用时老出问题，有时候阳性
实时荧光定量PCR： 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 原理： 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性） 2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)； 3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录； 5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。 收费标准 优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量） （含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系