体细胞杂种小麦高分子量麦谷蛋白亚基组成与品质
评分研究１
石垒，陈凡国**，夏光敏*
山东大学生命科学学院，济南（250100）
E-mail：xiagm@https://www.doczj.com/doc/7e630649.html,
摘要：测定了90个小麦/长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系共322份样品的高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成，并根据Payne等人1987年制定的小麦品质评分标准进行了品质评分。结果表明，体细胞杂种株系在Glu-A1，Glu-B1和Glu-D1位点上的遗传变异率分别为0.52，0.58和0.46；一共出现了27种不同的亚基组成形式，其中H1AxNull，H1Bx7+H1By9，H1Dx2+H1Dy12（同亲本小麦济南177）出现的频率最高，而H1Ax2*，H1Bx7+H1By8+H1By9，H1Dx2+H1Dx5+H1Dy12出现的频率最低；在与优质相关的亚基组合当中，H1Bx13+H1By16出现的频率约为31.1%，H1Dx5+H1Dy12出现的频率约为33.5%。基于沉降值与面粉品质的关系，给出了H1Dx5+H1Dy12品质评分为3，进而对全部27种不同的亚基组成形式进行了品质评分，平均分为6.54±0.03，变幅为5-13。综上所述，不对称体细胞杂交不但可以产生新的高分子量谷蛋白亚基，而且这些新的亚基及其组合对小麦加工品质具有重要的贡献。
关键词：小麦，长穗偃麦草，体细胞杂种，高分子量麦谷蛋白亚基，SDS沉降值，Payne 品质评分
1．引言
一般的六倍体小麦中，高分子量麦谷蛋白约占全部种子贮藏蛋白的12%，是影响面包加工品质的重要因素[1]。在欧洲小麦中，面包加工品质的差异有70%与高分子量麦谷蛋白亚基组成的变异有关[2]。高分子量麦谷蛋白对面粉加工品质的影响主要通过两方面来实现：第一，蛋白亚基表达数量的不同；第二，在同一位点上表达的亚基/亚基组合由于结构和理化性质的不同导致的质量效应。高分子量麦谷蛋白之间的这些不同之处尤其会造成谷蛋白聚合体的大小以及空间分布的差异，从而影响面团的强度和加工品质[3]。
麦谷蛋白亚基组成与数目受遗传控制，具有品种的稳定性[4,5]。从对品质的贡献上看，一般认为Glu-B1位点上的亚基组合13+16，14+15，17+18以及7+8对加工品质的贡献大于7+9或6+8，Glu-A1位点的亚基1或者2*对加工品质的贡献大于Null[1,2,6]。Payne 等人在1981年通过SDS沉降值分析表明麦谷蛋白亚基的等位变异对小麦的加工品质会产生重要影响，随后他们在1987年根据不同亚基对品质的贡献制定了小麦品质评定标准，该方法简便易行，已被广泛用于小麦品质评定和育种实践[2,4~6]。
栽培小麦中的优质蛋白资源毕竟是有限的，而在长穗偃麦草等许多小麦的近缘种当中包含多种不同于小麦的蛋白亚基。本实验室已经成功获得小麦与长穗偃麦草的属间体细胞杂种植株，并且产生大量株系，一些体细胞杂交系已经自交到了F8代。基因组原位杂交（GISH）分析表明，长穗偃麦草染色体小片段渐渗到小麦基因组并且在后代稳定遗传[7]。从杂种后代中已获得蛋白质含量在20%以上的优质强筋小麦新种质和新品系及耐盐（>0.5%）的小麦新品种‘山融3号’。
１本课题得到教育部博士点基金（2004）的资助。
* 通讯作者。
**同等贡献。
本文分析了90个小麦/长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系共322份样品的HMW-GS组成并计算了品质评分，从而为体细胞杂交技术应用于小麦品质的改良提供了理论依据。
2．材料与方法
2.1 试验材料
实验室保存的90个小麦/长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系F8代共322份样品的种子。
2.2 试验方法
取单粒小麦种子，研磨成粉，按每4 mg样品加入100 μl蛋白质提取液，其中含有0.125M Tris-HCl 缓冲液(pH 6.8)，4%(w/v)SDS，1%(w/v)DTT，20%(v/v)甘油和0.03%(w/v) Pyronin Y，混合均匀，沸水浴中煮沸10 min，13000 rpm离心30 min，收集上清液准备用于点样检测。
SDS-PAGE电泳采用不连续缓冲体系，即4%的浓缩胶和7.5%-10%的梯度分离胶，交联度均为2.66%。在4℃的条件下10 mA稳流电泳至指示剂迁移至凝胶底部。凝胶于考马斯亮蓝染液中染色30 min，最后在热水中进行脱色直至背景干净。考马斯亮蓝染液中含有0.1%(w/v)考马斯亮蓝R250，10%(v/v)甲醇和50%(v/v)乙酸。
称取3 g粗面粉，加50 ml蒸馏水，左右快速移动15 s，每2 min重复上述操作一次，重复三次。再加入50 ml 2%SDS溶液,1 ml乳酸水溶液（85%的乳酸5 ml加入40 ml水），上下颠倒四次，每2 min重复上述操作一次，重复四次。以上每次摇动和颠倒后，均将量筒横放，最后一次对着光源立放，立刻计时，5 min时记下沉淀物截面的刻度（ml数）,即为该样品的SDS沉降值。
亚基品质评分根据Payne等1987年制定的小麦品质评分标准进行确定[2]，由于此评分标准中并没有对Dx5+Dy12给出分数评定，于是我们根据亚基组成形式与SDS沉降值之间的关系，得出杂种的H1Dx5+H1Dy12品质分数。
每个位点（包括Glu–A1，Glu–B1，Glu–D1位点）的遗传多样性根据公式H=1-∑pi2进行计算[8]，其中H表示遗传变异指数，pi表示在某位点上一个独特的等位基因的发生频率。
体细胞杂种中出现的亚基,除了根据Payne等人在1984年制定的标准进行命名之外[9],为了区别于普通栽培种的HMW-GS，在杂种来源的亚基前加“H”；为了行文方便起见,除个别地方为防止混淆加了“H”之外,其它地方均省略。
3．结果与分析
3.1 HMW-GS组成与Payne品质评分的统计
分析了90个小麦/长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系共322份样品的HMW-GS组成情况（表1）。从表中可以看到，一共出现了27种不同的亚基组成形式，出现了同一位点表达两个及两个以上的亚基而导致总亚基数量达到6-7个的情况，例如有的株系在Glu–B1位点上表达了1Bx13，1By16和1By8三个亚基，有的在Glu-D1位点上表达了1Dx2，1Dx5和1Dy12三个亚基，等。同一位点多亚基的表达存在两种情况：一是可能处于杂合状态，下一代继续分离，另外一种情况可能已经稳定。如果是后者，根据数量效应理论，这些表达了多个亚基的株系很可能在加工品质参数方面优于其他的品系。
表1 小麦与长穗偃麦草体细胞杂交后代的HMW-GS 组成和品质评分
Table1 HMW-GS compositions and quality scores of 90 hybrids
根据Payne 等人在1987年制定的小麦品质评分标准，本文对本实验室的90个体细胞杂种当中出现的所有27种亚基组成形式进行了评分（表1）。在一些普通小麦栽培种中也被认为是优质亚基组合的1Dx5+Dy12[10,11]，Payne 并没有给出相应的评定分数，于是我们根据现有的体细胞杂种研究中已经获得的SDS 沉降值的平均值求得换算系数，然后得到H1Dx5+H1Dy12的评定分数，为了和先前的Payne 品质评分对应起来，取了近似的整数值3。需要说明的是，Payne 品质评分本身就是根据沉降值制定的，而H1Dx5+H1Dy12的评定分数也是通过沉降值之间的比较得到的，因此可以用来解释体细胞杂种不同的HMW-GS 组合方式之间存在的品质差异。
在全部27种不同的亚基组成方式均得到了品质评分后，对其进行了统计学分析，得出全部322份样品的平均亚基品质评分为6.54±0.03，变幅为5-13，与亲本小麦济南177相比有了很大的提高。
3.2 Glu-1位点的遗传变异指数
计算得到了Glu–A1，Glu–B1和Glu–D1位点的遗传变异频率（表2）。结果表明，体细胞杂种在Glu–A1，Glu–B1和Glu–D1位点上的遗传变异率分别为0.52，0.58和0.46。与其他位点相比，Glu–D1位点的遗传变异率较低，原因在于在此位点上Dx2+Dy12的比率超过了65%,这部分株系在此位点上均与亲本小麦济南177相同。
Alellic composition Glu-A1 Glu-B1 Glu-D1
NO. of
hybrids
(Total=90) SDS sedimentation (mL,average) Total rank Null 7+9 2+12 143
20.5 5 Null 13+16 2+12 26
57.0 6 Null 13+16 5+12 8
--- 7 Null 7+9 5+12 13
28.8 6 Null 7+8 2+12 7
23.7 6 Null 7+8+9 2+12 4
--- 8? Null 13+16+9 2+12 1
--- 6+? Null 7+8 5+12 3
--- 7 Null 13+16+8 5+12 1
--- 7+? Null 7+9 2+5+12 1
--- 8? 1 7+9 2+12 10
42.5 7 1 13+16 2+12 5
32.2 8 1 13+16 5+12 4
43.2 9 1 7+9 5+12 9
48.5 8 1 7+8 2+12 6
27.5 8 1 7+8 5+12 12
24.8 9 1 13+16+8 2+12 1
--- 8+? 1 16+7+8 5+12 1
--- 9+? 1 7+9 2+5+12 2
--- 10? 1 7+8+9 2+12 2
--- 10? 2* 7+9 5+12 4
--- 8 2* 7+8 5+12 3
--- 9 2* 13+16 5+12 48
45.8 9 2* 13+8 5+12 1
--- 6+? 2* 7+8+9 2+5+12 1
--- 13? 2* 13+16 2+12 5
--- 8 2* 13+16+8 5+12 1 --- 9+?
表2 小麦与长穗偃麦草体细胞杂交后代Glu-1位点的等位基因发生频率
Table2 Allelic frequencies (%) for the Glu-1 loci of 90 hybrids
4 讨论
高分子量麦谷蛋白亚基呈伸展状态，利于促进形成大谷蛋白聚合体，是决定面团弹性的主要因素[12]。在亚基的结构中，二硫键的数量和分布，以及重复区的特性和相互作用与亚基在谷蛋白聚合体中所起的作用是相关的，这一点对小麦的面包加工品质有重要的影响[13]。
Glu －1品质得分与SDS 沉降值、面筋指数极显著相关，而与干面筋含量以及蛋白质含量显著相关。拥有得分高的高分子量麦谷蛋白亚基的杂种品系要比拥有得分低的高分子量麦谷蛋白亚基的杂种品系在品质参数方面要高，也就是说比后者优质一些[14]。从本实验室的90个体细胞杂种HMW-GS 组成的统计结果来看，与亲本小麦济南177组成相同的杂种株系占据绝对优势，但同时也出现了很多不同于亲本小麦的新类型，也就是说很多杂种株系表达了“新”亚基/组合，例如1Ax1，1Ax2*，1Bx13+1By16，1Bx7+1By8, 1Dx5+1Dy12,等。这些新的亚基/组合类型从Payne 品质评分来看都要优于亲本小麦。
本实验给出了HDx5+HDy12的品质得分为3，高于1Dx2+Dy12的得分。在具体操作中，我们把SDS 沉降值作为主要的参考对象，大体反映了各种亚基组合对品质的贡献。影响品质的因素有很多，其中值得注意的就是蛋白质含量，一般来说蛋白质含量高的小麦品种，其SDS 沉降值会比较高，加工品质也会比较好；另外籽粒的饱满程度也是品质的一个影响因素。
利用SDS-PAGE 分析高分子量麦谷蛋白亚基的组成从而对亚基组合进行评分，已经和SDS 沉降值一起，作为评估小麦加工品质的最重要的参数，广泛用于多种面包小麦的育种工作中[15~17]。但小麦品质表现具有明显的地域性，有的品种含有优质亚基（如农大142含有5+10亚基），甚至数目较多，但烘烤品质并不好，相反，有的品种含优质亚基数目较少或不含优质亚基，却有好的烘烤品质。所以单纯从高分子量麦谷蛋白亚基的组成上来判定小麦品质的高低有一定的局限性，必须将高分子量麦谷蛋白亚基的品质评分标准与SDS 沉降值、粉质图等加工品质参数相结合，才能全面地反映小麦的加工品质。
所以，不对称体细胞杂交确实能够高频率的产生新的类似于其它普通小麦的高分子量麦谷蛋白亚基，从Payne 品质评分来看，这些新的亚基及其组合对小麦加工品质具有重要的贡献，对我们建立新的种质资源产生巨大的推动作用。体细胞杂交技术作为一种不同于常规的育种手段，在小麦品种改良的研究中正在体现出巨大的潜力。不仅仅局限于小麦面粉的品质改良，大量的实验证据证明有相当一部分杂种株系在抗旱，耐盐以及抗病虫害方面有非常
Null 207 0.6428 1 52 0.1615
Glu-A1
2* 63 0.1956 0.5223 7+9 182 0.5652 7+8 31 0.0962 13+16 96 0.2981 7+8+9 7 0.0217 13+16+8 3 0.0093
13+16+9 1 0.0031
16+7+8 1 0.0031
Glu-B1 13+8 1 0.0031
0.5817 2+12 210 0.6521 5+12 108 0.3354
Glu-D1
2+5+12 4 0.0124 0.4620
出色的表现，其中就包括本实验室已经育成的耐盐（>0.5%）小麦新品种‘山融3号’。总之，将体细胞杂交技术应用于小麦育种工作当中，不仅大大促进了新种质资源的产生，而且进一步增进了我们对不对称体细胞杂交机理的认识。
参考文献
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Study on Composition and Quality Score of High Molecular Weight Glutenin Subunits in Somatic Hybrid Wheat
Shi Lei，Chen Fanguo**，Xia Guangmin*
School of life science，Shandong University，Jinan (250100)
Abstract
High molecular weight glutenin subunit (HMW-GS) patterns of three hundred and twenty-two samples in ninety somatic hybrid introgression lines between Triticum aestivum c.v. JN 177 /Agropyron elongatum were analyzed, together with their quality scores according to Payne’s Glu-1 quality assignments. The genetic index for Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D1 loci were 0.52, 0.58 and 0.46, respectively. These hybrid lines could be divided into twenty-seven groups based on allelic composition, in which H1AxNull, H1Bx7+H1By9, H1Dx2+H1Dy12 like parent wheat distributed in the highest frequency, while H1Ax2*, H1Bx7+H1By8+H1By9, H1Dx2+H1Dx5+H1Dy12 appeared in the lowest rate. The high-quality HMW-GS H1Bx13+H1By16 and H1Dx5+H1Dy12 occupied frequencies about 31.1% and 33.5%, respectively. Based on the relationship between SDS sedimentation value and flour quality, we assigned H1Dx5+H1Dy12 the score 3. Subsequently, twenty-seven HMW-GS compositions’ quality score were given, which ranged from 5 to 13 with average score 6.54±0.03.Therefore, asymmetric somatic hybridization is able to not only generate novel subunits but also contribute to wheat bread-making quality.
Keywords:Triticum aestivum；Agropyron elongatum；somatic hybrid line；high molecular weight glutenin subunit (HMW-GS)；SDS sedimentation；Payne quality score
体细胞杂种小麦高分子量麦谷蛋白亚基组成与品质 评分研究１ 石垒，陈凡国**，夏光敏* 山东大学生命科学学院，济南（250100） E-mail：xiagm@https://www.doczj.com/doc/7e630649.html, 摘要：测定了90个小麦/长穗偃麦草体细胞杂种渐渗系共322份样品的高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成，并根据Payne等人1987年制定的小麦品质评分标准进行了品质评分。结果表明，体细胞杂种株系在Glu-A1，Glu-B1和Glu-D1位点上的遗传变异率分别为0.52，0.58和0.46；一共出现了27种不同的亚基组成形式，其中H1AxNull，H1Bx7+H1By9，H1Dx2+H1Dy12（同亲本小麦济南177）出现的频率最高，而H1Ax2*，H1Bx7+H1By8+H1By9，H1Dx2+H1Dx5+H1Dy12出现的频率最低；在与优质相关的亚基组合当中，H1Bx13+H1By16出现的频率约为31.1%，H1Dx5+H1Dy12出现的频率约为33.5%。基于沉降值与面粉品质的关系，给出了H1Dx5+H1Dy12品质评分为3，进而对全部27种不同的亚基组成形式进行了品质评分，平均分为6.54±0.03，变幅为5-13。综上所述，不对称体细胞杂交不但可以产生新的高分子量谷蛋白亚基，而且这些新的亚基及其组合对小麦加工品质具有重要的贡献。 关键词：小麦，长穗偃麦草，体细胞杂种，高分子量麦谷蛋白亚基，SDS沉降值，Payne 品质评分 1．引言 一般的六倍体小麦中，高分子量麦谷蛋白约占全部种子贮藏蛋白的12%，是影响面包加工品质的重要因素[1]。在欧洲小麦中，面包加工品质的差异有70%与高分子量麦谷蛋白亚基组成的变异有关[2]。高分子量麦谷蛋白对面粉加工品质的影响主要通过两方面来实现：第一，蛋白亚基表达数量的不同；第二，在同一位点上表达的亚基/亚基组合由于结构和理化性质的不同导致的质量效应。高分子量麦谷蛋白之间的这些不同之处尤其会造成谷蛋白聚合体的大小以及空间分布的差异，从而影响面团的强度和加工品质[3]。 麦谷蛋白亚基组成与数目受遗传控制，具有品种的稳定性[4,5]。从对品质的贡献上看，一般认为Glu-B1位点上的亚基组合13+16，14+15，17+18以及7+8对加工品质的贡献大于7+9或6+8，Glu-A1位点的亚基1或者2*对加工品质的贡献大于Null[1,2,6]。Payne 等人在1981年通过SDS沉降值分析表明麦谷蛋白亚基的等位变异对小麦的加工品质会产生重要影响，随后他们在1987年根据不同亚基对品质的贡献制定了小麦品质评定标准，该方法简便易行，已被广泛用于小麦品质评定和育种实践[2,4~6]。 栽培小麦中的优质蛋白资源毕竟是有限的，而在长穗偃麦草等许多小麦的近缘种当中包含多种不同于小麦的蛋白亚基。本实验室已经成功获得小麦与长穗偃麦草的属间体细胞杂种植株，并且产生大量株系，一些体细胞杂交系已经自交到了F8代。基因组原位杂交（GISH）分析表明，长穗偃麦草染色体小片段渐渗到小麦基因组并且在后代稳定遗传[7]。从杂种后代中已获得蛋白质含量在20%以上的优质强筋小麦新种质和新品系及耐盐（>0.5%）的小麦新品种‘山融3号’。 １本课题得到教育部博士点基金（2004）的资助。 * 通讯作者。 **同等贡献。