附件1：
抗氧化功能评价方法
试验项目、试验原则及结果判定
Items, Principles and Result Assessment
1 试验项目
1.1 动物实验
1.1.1 体重
1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）
1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基
1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶
1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽
1.2 人体试食试验
1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）
1.2.2 超氧化物歧化酶
1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶
2 试验原则
2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。
2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。
2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。
2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。
3 结果判定
3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。
3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。
抗氧化功能检验方法
Method for the Assessment of Antioxidative Function
1 动物实验
1.1 实验动物
选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。
1.2 剂量分组及受试样品给予时间
实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。
1.3 实验方法
1.3.1 老龄动物
选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。
1.3.2 D－半乳糖氧化损伤模型
1.3.
2.1原理
D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。
1.3.
2.2造模方法
选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。
1.3.3 乙醇氧化损伤模型
1.3.3.1原理
乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。
1.3.3.2造模方法
选25－30g健康成年小鼠（180－220g大鼠），随机分为4个组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，必要时可增设1个空白对照组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。
1.3.4脂质氧化产物测定
1.3.4.1 血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定
血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。
1.3.4.1.1 荧光法
1.3.4.1.1.1 荧光法原理
MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。
1.3.4.1.1.2 仪器与试剂
仪器：荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管
试剂：
10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL
29mmol/L硫代巴比妥酸工作液
硫代巴比妥酸0.209g
EDTA.2H20 25mg
谷胱甘肽（还原型）1mg
用0.02mol/L NaOH 50 mL 溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）酸水解液
0.1mol/L H2SO4 125mL
0.1mol/L Na2SO4 125mL
加水150mL用H2SO4 调pH 1.5，加水稀释至500mL
正丁醇
以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂
（选AR级）最好用双蒸水配制。
1.3.4.1.1.3 实验步骤
1.3.4.1.1.3.1 样品制备
全血上清液：取血50μl加入0.5mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。
血清样品：取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。
1.3.4.1.1.3.2 标准曲线制作
将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL 分别取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
1.3.4.1.1.3.3样品测定
试剂空白管样本管标准管10mL具塞离心管0.1mL蒸馏水0.1mL血清* 0.1mL标准＃酸水解液2mL 2mL 2mL
TBA工作液0.5mL 0.5mL 0.5mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却
正丁醇3mL 3mL 3mL
振荡抽提1min，3000r/min 离心5min
*全血上清液0.5mL（空白管加蒸馏水0.5mL，标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL）＃1nmol/mL四乙氧基丙烷（标准）
血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）→加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min →取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）
1.3.4.1.1.3.4 计算公式：
B-A B-A
过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝———×C×K =————×1×1
F-A F-A
B-A B-A 1 过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝———×C×K =———×1×————
F-A F-A 0.05
A：空白管荧光度
B：样品荧光度
F：四乙氧基丙烷荧光度
C：四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）
K：稀释倍数
1.3.4.1.2比色法
1.3.4.1.
2.1比色法原理
MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。
1.3.4.1.
2.2 仪器与试剂
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。
试剂：0.2M乙酸盐缓冲液pH3.5
0.2M乙酸溶液185mL
0.2M乙酸钠溶液15mL
1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL
8.1%十二烷基硫酸钠SDS
0.8%硫代巴比妥酸TBA
0.2M磷酸盐缓冲液pH7.4
0.2M磷酸氢二钠1920mL
0.2M 磷酸二氢钾480mL
1.3.4.1.
2.3 实验步骤
1.3.4.1.
2.
3.1 样品制备
溶血液样品：取血20μL加入0.98mL蒸馏水制成2％溶血液。
1.3.4.1.
2.
3.2样品测定
试剂空白管样品管标准管2％溶血液* 0.2mL
40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL
8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL
0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL 1.5mL 1.5mL
0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL
H2O 0.8mL 0.6mL 0.6mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
*若用血清，样品管0.15mL，标准管0.15mL。
1.3.4.1.
2.
3.3计算
B – A B – A
过氧化脂质含量（nmol/mL2%溶血液）＝————×C×K = —————×40×1
F – A F – A
B – A B – A
过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝————×C×K = —————×40×1
F – A F – A
A: 空白管吸光度
B：样品吸光度
F：四乙氧基丙烷吸光度
C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）
K：稀释倍数
1.3.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定
1.3.4.
2.1 原理
见1.3.4.1.2.1
1.3.4.
2.2 仪器与试剂
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器
试剂：见1.3.4.1.2.2
1.3.4.
2.3 实验步骤
1.3.4.
2.
3.1 样品制备
组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。
1.3.4.
2.
3.2样品测定
试剂空白管样品管标准管10％组织匀浆0.2mL
40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL
8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL
0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL 1.5mL 1.5mL
0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mL
H2O 0.8mL 0.7mL 0.7mL
混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行
1.3.4.
2.
3.3计算
B - A B- A 1
过氧化脂质含量＝————×C×K = ———×40×————————
（nmol/mg组织） F - A F - A 0.2×10%×1000
A: 空白管吸光度
B：样品管吸光度
F：四乙氧基丙烷吸光度
C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）
K：稀释倍数
1.3.4.3 血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）测定
1.3.4.3.1原理
8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物，其含量能间接反应因机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。
1.3.4.3.2仪器与试剂
仪器：酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机
试剂：8-Isoprostane KIA Kit (酶联免疫试剂盒)
8-Isoprostane EIA 抗体血清、8-Isoprostane AChE示踪物、8-Isoprostane EIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-兔IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellman’s试剂
1.3.4.3.3实验步骤
1.3.4.3.3.1样品制备
小鼠眼内眦静脉丛取血，3000r/min离心10min。取上清液，用EIA 缓冲液稀释15倍备用。
1.3.4.3.3.2样品测定
按试剂盒说明操作。
8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：500 pg/mL、200 pg/mL、80 pg/mL、32 pg/mL、12.8 pg/mL、5.1 pg/mL、2.0 pg/mL、0.8pg/mL
标准或样品孔吸光度—NSB孔吸光度
%B/B0= ——————————————————×100
B0孔吸光度—NSB孔吸光度
以标准物的浓度的对数（log）为横坐标，%B/B0为纵坐标绘制标准曲线，亦可将数据转换成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]做为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。将样品的%B/B0值，代入方程式，计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数，即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。
1.3.5蛋白质氧化产物测定
H2O2或O2·ˉ自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽链，使肽链断裂，引起蛋白质一级结构的破坏，在断裂处产生羰基。羰基化蛋
白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能，蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，它随着年龄的增长而增加。
1.3.5.1血清中蛋白质羰基测定
1.3.5.1.1原理
被氧化后的蛋白质羰基含量增多，羰基可与2，4-二硝基苯肼反应生成2，4-二硝基苯腙，2，4．二硝基苯腙为红棕色的沉淀，将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370 nm下的吸光度值，从而测定蛋白质的羰基含量。
1.3.5.1.2仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。
试剂：10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼(DNPH)
99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解，4℃避光保存。
2 mol/L HCL
200 g/L 三氯乙酸（TCA）
6 mol/L 盐酸胍
无水乙醇乙酸乙酯混合应用液
将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。
1.3.5.1.3操作步骤
涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法测定血清（或血浆）蛋白质含量。
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.5.1.4计算公式
测定管OD-对照管OD
蛋白质羰基含量= ——————————————————————×125×105
（nmol/mgprot）22×比色光径（cm）×样本蛋白浓度（mg/L）
1.3.5.2组织中蛋白质羰基测定
1.3.5.
2.1原理
见1.3.5.1.1
1.3.5.
2.2 仪器与试剂
仪器：紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、天平、匀浆器、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。
试剂：
10 mmol/L HEPES缓冲液pH7.4
2.38克N-2-羟乙基哌嗪-2’-乙磺酸（HEPES）溶入1000ml双蒸馏水，用lN NaOH
调pH至7.4，4℃保存。
100 g/L 硫酸链霉素
1g硫酸链霉素，溶入10ml双蒸馏水，4℃避光保存。
10 mmol/L 2，4-二硝基苯肼(DNPH)
99毫克2，4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解，4℃避光保存。
2 mol/L HCL
200 g/L 三氯乙酸（TCA）
6 mol/L 盐酸胍
无水乙醇乙酸乙酯混合应用液
将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比1：1的比例配置成混合溶液，现用现配。
1.3.5.
2.3 实验步骤
1.3.5.
2.
3.1样品处理
取0.1g组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。加人0.9ml的冰的10 mmol/L HEPES缓冲液(pH7.4)，制成10％的匀浆。将匀浆液以3000r/min的转速，离心10 min，保留上清。取100g／L的硫酸链霉素溶液50μl，加入上清液450μl（v/v,1:9），室温放置10 min 后，以11000r/min的转速，离心10 min，取上清液待测。
涡旋混匀，将全部沉淀溶解，以12000r/min离心15min，取上清液在370nm处比色，6 mol/L 盐酸胍试剂调零，测定OD值。用双缩脲法测定匀浆上清液蛋白质含量。
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.5.
2.
3.3计算公式
测定管OD-对照管OD
蛋白质羰基含量= ——————————————————————×125×105
（nmol/mgprot）22×比色光径（cm）×样本蛋白浓度（mg/L）
1.3.5.3 注意事项
1.3.5.3.1 加入硫酸链霉素：在匀浆上清液中加人硫酸链霉素溶液的作用是沉淀核酸。核酸中的一些碱基如鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基，如不去除核酸，这些碱基就会与DNPH结合，并反应生成有色物质，这些物质会增加最后溶液的吸光度，使结果偏大。
1.3.5.3.2 DHPH的溶解：DNPH不溶于水，只能溶于稀酸和稀碱等溶液，因此，用2 mol／L HC1来溶解DNPH。设对照管是为了避免HC1与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质。
1.3.5.3.3反应体系应避光：当蛋白质溶液中加人DNPH进行反应时，反应体系需置于黑暗中，因为DNPH不稳定，见光会分解。如果反应体系遇到光，DNPH分解，体系中会有剩余的没有变成蛋白质腙衍生物，对反应比色有影响。
1.3.5.3.4 去除未与蛋白质结合的DNPH：由于DNPH在370nm左右有强烈的光吸收，因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反复洗涤沉淀，去掉未与蛋白质结合的DNPH，否则，会增加吸光值。
1.3.6 抗氧化酶活力测定
SOD催化超氧阴离子自由基（O2·ˉ）生成H2O2，再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和过氧化氢酶作用生成水，这样可以清除O2·ˉ对细胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在动物某些器官和人体血红细胞中的含量均有明显的增龄变化，酶活性与生物年龄的增长成反比。消除自由基的能力与酶活性成正比。
1.3.6.1 血或组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力测定
1.3.6.1.1 原理
O2·ˉ氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O2·ˉ后形成的亚硝酸盐减少。
1.3.6.1.2仪器与试剂
仪器可见光分光光度计、酶标仪、离心机、恒温水浴、匀浆器
试剂65mM磷酸盐缓冲液（PBS）pH7.8
10mmol/L盐酸羟胺
盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL
7.5mmol/L黄嘌呤
黄嘌呤11.41mg，加0.1M NaOH 2.5mL溶解，加PBS至10mL
0.2g/L黄嘌呤氧化酶
取10g/L黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL
0.1%甲萘胺
取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL
凉蒸馏水至200mL
0.33%对氨基苯磺酸
取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL
SOD标准品
三氯甲烷
95％乙醇（v/v）
0.9%生理盐水
1.3.6.1.3 实验步骤
红细胞抽提液制备：10μl全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95％乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。
组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成1％组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。
SOD标准抑制曲线将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（1.5μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。
对照管OD－测定管OD
SOD百分抑制率＝──────────────×100％
对照管OD
计算每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个单位。
（对照管OD-测定管OD）×100％
对照管OD 反应液总量（6mL）SOD活力（U/mL）＝─────────×──────────×样品稀释倍数
50％取液量
也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/mL，乘以稀释倍数（1mL/取样量）。
若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg 蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。
样品测定步骤：
试剂测定管对照管
1/15mol/L磷酸盐缓冲液pH7.8（mL） 1.0 1.0 样品A*
10mmol/L盐酸羟胺（mL）0.1 0.1
7.5mmol/L黄嘌呤（mL）0.2 0.2
0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶（mL）0.2 0.2
双蒸水（mL）0.49 0.49
混匀，37℃恒温水浴30min
0.33%对氨基苯磺酸（mL） 2.0 2.0
0.1%甲萘胺（mL） 2.0 2.0
混匀15min后，倒入1cm光径比色杯，以蒸馏水调零，530nm处比色测定OD值。
* A 所用样品的量
红细胞抽提液10 μl
血清（或血浆）20－30 μl（溶血样品剔除）
1%组织匀浆10－40 μl
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定
1.3.6.
2.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
1.3.6.
2.2 试剂和仪器
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂：叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
N a N316.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-N a27.44mg 终浓度0.2mmol/L
N a2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
N a H2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N a OH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25－1.5mmol/LH2O2溶液
取30％H2O20.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临
用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO316.7g（先用蒸馏水溶解）
EDTA 0.5g
N a Cl 280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/LN a2HPO4溶液:
N a2HPO422.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
0.2M磷酸缓冲液pH7.4
0.9%生理盐水
1.3.6.
2.3 实验步骤
1.3.6.
2.
3.1 样品制备
溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h 内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。
组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。
1.3.6.
2.
3.2 GSH标准曲线的制作：
取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.6.
2.
3.3 测定步骤：
试剂样品管（mL）非酶管（mL）空白管（mL）
1.0mmol/LGSH 0.4 0.4
样品** 0.4
双蒸水* 0.4
37℃水浴预温5min
H2O2（37℃预热）0.2 0.2
37℃水浴准确反应3min （严格控制时间）
偏磷酸沉淀液 4 4
3000r/min离心10min
离心上清液 2 2
双蒸水0.4
偏磷酸沉淀液 1.6
0.32mol/LN a2HPO4 2.5 2.5 2.5
DTNB显色液0.5 0.5 0.5
显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。
* 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
**溶血液0.1－0.4mL
组织上清液1:20稀释，取稀释液0.4mL
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.6.
2.
3.4 计算
鼠全血GSH-Px活力单位规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低
后，使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。
非酶管log[GSH]-样品管log[GSH]
鼠全血GSH-Px活力单位（U/mL全血）= ────────────────
3min×0.004mL
log[非酶管OD－空白管OD]-log[样品管OD-空白管OD]
= ────────────────────────
3min×0.004mL
组织GSH-Px比活力单位规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
（非酶管OD－样品管OD）×A**×5
组织GSH-Px比活力单位（U/mg蛋白）= ───────────────────
3min×样品蛋白质的mg数*
* Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量
标准GSH浓度（μmol/L）
** A= ───────────即标准曲线斜率。
标准GSH光密度（OD）
1.3.6.
2.4 注意事项
1.3.6.
2.4.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
OD
浓度（mmol/L）＝————————
0.036（消光系数）
若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
1.3.6.
2.4.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还
受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min 内读数准确。
1.3.7抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）测定
谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是GSH-PX和GST两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳定含巯基的酶，和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用，GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。
1.3.7.1血或组织中还原型谷胱甘肽（GSH）测定方法
1.3.7.1.1原理
GSH-和5，5'-二硫对硝基甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基甲酸阴离子，于420nm波长有最吸收峰，测定该离子浓度，即可计算GSH的含量。
1.3.7.1.2仪器和试剂
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂：0.9％生理盐水
4％磺基水杨酸溶液
0.1mol/L PBS溶液（pH=8.0）：
称取Na2HPO4 13.452g，KH2PO4 0.722g，加蒸馏水至1000mL。
0.004％DTNB溶液：
称取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶液（pH=8.0）中。
叠氮纳缓冲液：
NaN316.25 mg
EDTA-Na27.44 mg
Na2HPO4 1.732 g
NaH2PO4 1.076 g
加蒸馏水至1000mL，用少量HCl、NaOH调pH7.0，4℃保存。
标准溶液：称取还原型GSH 15.4mg，加叠氮纳缓冲液至50mL，终浓度为1mmol/L，临用前配制。
1.3.7.1.3 实验步骤
1.3.7.1.3.1 样品制备：
溶血液上清液：取0.1mL抗凝全血加双蒸水0.9mL（1：9溶血液），充分混匀，直至透亮为止。取溶血液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
血清上清液：取0.1mL血清加4%磺基水杨酸0.1mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
组织上清液：取组织0.5g加生理盐水4.5mL充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取
浆液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
1.3.7.1.3.2 样品测定：
溶血液或组织样品测定：
测定管空白管
上清液0.5mL －
4%磺基水杨酸－0.5mL
DTNB 4.5mL 4.5mL 混匀，室温放置10 分钟后，420nm处测定吸光度。
血清样品测定：
测定管空白管
上清液0.1mL －
4%磺基水杨酸－0.1mL
DTNB 0.9mL 0.9mL 混匀，室温放置10 分钟后，420nm处测定吸光度。
注：该指标检测，需新鲜样品取材后当天完成。用双缩脲法测定血清（或溶血液）、组织匀浆蛋白质含量。如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.7.1.3.3 标准曲线
取1mmol/L GSH标准溶液0、10、20、50、100、150、200μL,分别加入生理盐水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400μmol/L的GSH标准液系列，各管加入DTNB4.5mL，混匀，室温放置10 分钟后，空白管调零，420nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。
1 2 3 4 5 6 7
1mmol/L GSH（mL）0 0.01 0.02 0.05 0.10 0.15 0.20
生理盐水（mL）0.50 0.49 0.48 0.45 0.40 0.35 0.30
DTNB（mL） 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 GSH量（μmol/L）0 20 40 100 200 300 400
1.3.7.1.3.4 计算
样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×溶血液稀释倍数×上清液稀释倍数（μmol /L全血）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×10×2
样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×上清液稀释倍数
（μmol /L血清）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×2
样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×上清液稀释倍数÷上清液组织含量（μmol /g组织）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×2÷100g组织/L
样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×上清液稀释倍数÷上清液蛋白含量（μmol /gprot）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×2÷匀浆gprot/L
1.4数据处理与结果判定
1.4.1数据处理
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.4.2 指标判定
1.4.
2.1脂质氧化产物
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质（丙二醛或8-表氢氧异前列腺素）含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，该项指标结果阳性。
1.4.
2.2蛋白质氧化产物
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，蛋白质羰基含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低蛋白质过氧化作用，该项指标结果阳性。
1.4.
2.3抗氧化酶活力
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，抗氧化酶（SOD或GSH-PX）活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化酶活力作用，该项指标结果阳性。
1.4.
2.4抗氧化物质GSH
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，GSH含量升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化物质GSH作用，该项指标结果阳性。
1.4.3结果判定
过氧化脂质含量、蛋白质羰基、抗氧化酶活性、还原性谷胱甘肽四项指标中三项指标阳性，可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。
2 人体试食试验
2.1 受试者纳入标准
选年龄在18－65岁，身体健康状况良好，无明显脑、心、肝、肺、肾、血液疾患，无长期服药史，志愿受试保证配合的人群。
2.2 排除受试者标准
2.2.1妊娠或哺乳期妇女，对保健食品过敏者。
2.2.2合并有心、肝、肾和造血系统等严重疾病患者。
2.2.3短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。
2.2.4不符合纳入标准，未按规定食用受试样品，无法判定功效或资料不全影响功效或安全
性判断者。
2.3 受试者分组
对受试者按MDA、SOD、GSH-Px水平随机分为试食组和对照组，尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、生活饮食习惯等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。每组受试者不少于50例。
2.4 试验方法
采用自身和组间两种对照设计。试验组按推荐服用方法、服用量每日服用受试产品，对照组可服用安慰剂或采用阴性对照。受试样品给予时间3个月，必要时可延长至6个月。试验期间对照组和试食组原生活、饮食不变。
2.5 观察指标
各项指标在试验开始及结束时各检测1次。
2.5.1 安全性指标
2.5.1.1 一般状况包括精神、睡眠、饮食、大小便、血压等
2.5.1.2 血、尿、便常规检查
2.5.1.3 肝、肾功能检查
2.5.1.4 胸透、心电图、腹部B超检查
2.5.2功效指标
2.5.2.1 过氧化脂质含量观察试验前后MDA的变化及MDA下降百分率。（测定方法见1.
3.3.1）
试验前MD A —试验后MDA
MDA下降百分率= ?100%
试验前MDA
观察试验前后8-Isoprostane的变化及8-Isoprostane下降百分率。（测定方法见2.8）
试验前8-Isoprostane —试验后8-Isoprostane 8-Isoprostane下降百分率= ?100%
试验前8-Isoprostane
2.5.2.2 超氧化物歧化酶观察试验前后SOD的变化及SOD升高百分率。（测定方法见1.
3.
4.1）
试验前SOD—试验后SOD
SOD升高百分率= ?100%
试验前SOD
2.5.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶观察试验前后GSH－PX的变化及GSH－PX升高百分率。（测定方法见2.7）
试验前GSH－PX—试验后GSH－PX
GSH－PX升高百分率=×100%
试验前GSH－PX
2.6数据处理和结果判定
凡自身对照资料可以采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验，后者需进行方差齐性检验，对非正态分布或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态方差齐后，用转换的数据进行t检验；若转换数据仍不能满足正态方差齐要求，改用t’检验或秩和检验；但变异系数太大（如CV>50％）的资料应用秩和检验。在试验前组间比较差异无显著性的前提下，可进行试验后组间比较。
各功效观察指标试验前后自身比较和试食后组间比较均有统计学意义，方可判定该指标阳性。
过氧化脂质含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项实验中任二项实验结果阳性，可判定该受试样品具有抗氧化功能作用。
2.7 血中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定
2.7.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5，5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
2.7.2 试剂和仪器
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、恒温水浴锅、微量加样器、离心机
试剂：叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0
N a N316.25mg 终浓度2.5mmol/L
EDTA-N a27.44mg 终浓度0.2mmol/L
N a2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L
N a H2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N a OH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25－1.5mmol/L H2O2溶液
取30％H2O20.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO316.7g（先用蒸馏水溶解）
EDTA 0.5g
N a Cl 280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/L N a2HPO4溶液:
N a2HPO422.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB 40mg
柠檬酸三钠 1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
2.7.3 实验步骤
2.7.
3.1 样品制备
溶血液：取血20μl加入到1mL 双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4小时内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3天内测定，若4℃存放，28小时内必须测完。测前取出样品室温自然解冻，
2.7.
3.2 GSH标准曲线的制作：
取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L N a2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
2.7.
3.3 测定步骤：
试剂样品管（mL）非酶管（mL）
1.0mmol/L GSH 0.4 0.4
血样稀释液0.4
双蒸水* 0.4
37℃水浴预温5min
H2O2（37℃预热）0.2 0.2
37℃水浴准确反应5min（严格控制时间）
偏磷酸沉淀液 4 4
3000r/min离心10min
离心上清液 2 2
双蒸水
偏磷酸沉淀液
总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 产品编号产品名称包装 S0116 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法) 100次 产品简介： 总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)，即Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method，简称T-AOC Assay Kit，是一种采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢。在细胞或组织的正常生理代谢过程中会产生活性氧，同时一些环境因子例如紫外照射、γ射线照射、吸烟、环境污染等也可以诱导活性氧的产生。活性氧产生后，可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激(Oxidative stress)，继而导致各种肿瘤、动脉粥样硬化、风湿性关节炎、糖尿病、肝损伤、以及中枢神经系统疾病等。 机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激(oxidative stress)的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此测定血浆、血清、尿液、唾液等各种体液，细胞或组织等裂解液中的总抗氧化能力具有非常重要的生物学意义。 植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱，可以用于筛选强抗氧化能力的药物。 FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还原Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后在593nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。 Antioxidant Fe3+-TPTZ ——————> Fe2+-TPTZ (蓝色) 提供了抗氧化物Trolox作为对照。Trolox是一种维生素E的类似物，水溶性较好，抗氧化能力和维生素E相近。 本试剂盒方便快捷，加入待测样品后3-5分钟即可进行吸光度测定，通常10-20个样品可以在十多分钟内检测完毕。 本试剂盒可以检测100个样品。 包装清单： 产品编号产品名称包装 S0116-1 TPTZ稀释液 15ml S0116-2 TPTZ溶液 1.5ml S0116-3 检测缓冲液 1.5ml S0116-4 FeSO4·7H2O 200mg S0116-5 Trolox溶液 (10mM) 0.1ml —说明书1份 保存条件： -20℃保存，一年有效。其中S0116-2 TPTZ溶液，S0116-3 检测缓冲液和S0116-5 Trolox溶液 (10mM)需避光保存。 注意事项： 在酸性条件下呈蓝色或接近蓝色的试剂会对本试剂盒的检测产生干扰，需尽量避免。 如果样品中含有外加的较高浓度的铁盐或亚铁盐，会干扰测定。但血浆、血清、细胞或组织裂解液等样品中含有的微量的铁盐或亚铁盐不会干扰测定。 样品中不能添加DTT、巯基乙醇等影响氧化还原反应的物质，也不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢剂。 测定时需可以测定A593的酶标仪一台(测585-605nm也可以)或可以测定微量样品的分光光度计一台。 TPTZ对人体有刺激性，请注意适当防护。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
1还原力的测定 样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。吸光值越大表明还原力越强。 注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。但具体情况应根据吸光值大小而定。 0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。 铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。 比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。 2 DPPH自由基清除活性的测定 将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在 室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。清除率计算公式为： 空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。 式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值； Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值； 注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。 DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。 3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。对照管除不加样液外其他试剂同前。将上述2种试管同时置37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA0.5mL，静置10 min后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0mL上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0mL，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0mLPBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示为: SA(%)=(Ac一AS)/A C×100 式中:Ac一不加样品的吸光度 As一加入样品的吸光度 注意：卵黄溶液不用时应放置冰箱保存。 酶解液蛋白浓度以5mg/ml左右调整，但具体应视清除率大小而定，对酶解液蛋白浓度
ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验 1.实验目的 1.1 了解多功能酶标仪的应用范围和基本结构及其操作方法 1.2 掌握ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验原理 2 实验原理： 2.1 仪器基本原理 酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上。光电检测器将透射过待测标本后强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大、对数放大、模数转换等处理后，送入微处理器进行数据处理，转换成相应的浓度，最后由显示器和打印机输出结果。 2.2 ORAC实验原理 ORAC是氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity）的缩写，也被称为抗氧化能力指数，ORAC分析法中的自由基主要来源于偶氮化合物2，2'-偶氮-双-（2-脒基丙烷）氯化二氢[2，2'-azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride，AAPH]热分解产生的过氧化氢自由基，也可以是芬顿( Fenton) 反应过程中产生的羟自由基，以荧光素钠（sodium flourescein，FL）为荧光探针，观察自由基与荧光探针作用后，探针荧光强度的衰退过程，以水溶性维生素E类似物( 6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox) 作为抗氧化标准物质，检测体系中各种抗氧化剂延缓探针荧光强度衰退的能力，以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。 3 仪器及试剂 3.1 仪器及配件 Enspire 多功能酶标仪，96孔荧光板 3.2 试剂 3.2.1 磷酸盐缓冲液的制备：精密量取适量磷酸，以高纯水稀释得到75 mmol/L 磷酸溶液；称取8.56 g磷酸氢二钾以高纯水500mL溶解，以磷酸溶液调pH 7.4，即得75 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液。 3.2.2 AAPH溶液的制备：精密称取AAPH 207mg，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5 mL量瓶，即得浓度为153 mmol/L的AAPH溶液。 3.2.3 FL溶液的制备：精密称取FL 40 mg，以磷酸盐缓冲液溶解，制成4125 mmol/L的FL 溶液，记为FL母液a。精密吸取FL母液a 50uL置50 mL量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，记为FL母液b；FL母液a，b均于4℃冷藏。实验时精密吸取FL母液b500uL置25 mL 量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，即得8*10-5mmol/L的稀释液。 3.2.4 样品溶液的制备：精密称取虾青素样品适量，以甲醇溶解，配制成1mg/mL的化合物母液，继而以缓冲液稀释制成10，50，100ug/mL的化合物溶液。 4 实验内容 4.1 样品量效曲线的确定：精密吸取FL稀释液100uL于96孔荧光板中，随后加入不同浓度样品溶液50uL振荡5 min，37℃温育10min后迅速加入AAPH液50uL启动反应。以激发波长485 nm，发射波长535 nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔1.5min测定一次荧光值（记为Fn）。以测定时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制不同浓度虾青素荧光衰变曲线。
附件1： 抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重 1.1.2 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.1.3 蛋白质氧化产物：蛋白质羰基 1.1.4 抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶 1.1.5 抗氧化物质：还原性谷胱甘肽 1.2 人体试食试验 1.2.1 脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane） 1.2.2 超氧化物歧化酶 1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。 2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。 2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。 2.4 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。
抗氧化功能检验方法 Method for the Assessment of Antioxidative Function 1 动物实验 1.1 实验动物 选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。 1.2 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。 1.3 实验方法 1.3.1 老龄动物 选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.2 D－半乳糖氧化损伤模型 1.3. 2.1原理 D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。 1.3. 2.2造模方法 选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kg BW 颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。 1.3.3 乙醇氧化损伤模型 1.3.3.1原理
抗氧化活性测定方法的比较 人体衰老和多种疾病均与自由基有关，寻找天然抗氧化剂具有重要意义。黄酮、多糖、多肽、酚类等生物活性成分均具有抗氧化活性，抗氧化活性的筛选方法可分为体外和体内2种测试体系。 体外：抗氧化活性可以用在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力、抗油脂过氧化能力及样品的还原能力、总抗氧化能力等来衡量和表征。常用的方法有羟基自由基（·OH）清除能力法、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH法）、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（ABTS 法）、超氧阴离子自由基法（O2-·）、邻苯三酚自氧化法、β-胡萝卜素漂白法、硫代巴比妥酸法、铁离子还原能力测定（FRAP法）、总酚测定法、ORAC法等方法。体内：主要有DNA氧化损伤法、蛋白质氧化损伤法、线粒体氧化损伤法。 其中DPPH法和ABTS法操作较简单便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外分光光度测量值后计算其自由基清除率，缺点是不同物质具有组成和结构的差异，与DPPH·、ABTS+·的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断，且DPPH自由基会和其他自由基发生反应。邻苯三酚自氧化法缺点是检测波长、缓冲液的组成及ｐＨ值、邻苯三酚浓度等关键测定条件存在
着较大差异。β-胡萝卜素漂白法的缺点是β-胡萝卜素本身有抗氧化活性，对样品活性的测定结果有影响。FRAP法主要用于食品业，优点是简单易操作、可以重复，缺点是无法测定硫醇化合物的还原能力。ORAC法是国际上通用的评价食品氧化的标准方法，缺点是仪器成分较复杂，检测成本较高。 目前普遍使用的体外抗氧化活性指标一般都采用分光光度法，使用分光光度计测量各种颜色成分含量的变化。分光光度法操作较简单、便捷，不需要特殊的检测设备，只在需固定时间下记下其紫外-可见分光光度测量值后计算其活性大小，具有成本低、效率高、样品量少等优点。分光光度法缺点是会受到样本自身颜色和浑浊度的影响和限制，颜色深的样品测得的数据误差大，甚至得到错误的结果；不同物质组成和结构存在差异，与各种自由基的反应速率不同，反应到达平衡的时间不同，将反应时间固定在某一值时，可能对抗氧化剂的抗氧化性评价带来错误的判断。外界环境因素对实验结果也存在一定程度的影响，有些抗氧化活性实验在冬天低温时不易成功，测得的数据往往没有规律。 我觉得在测定样品的抗氧化活性时，各种方法都有自己的优缺点，要根据需测物质来决定用什么方法，比如DPPH 法的自由基选择性强，不和只有一个羟基的芳香酸、无羟基的类黄酮反应，这类物质需用其他方法测定。若对检测结果
小鼠总抗氧化能力的测定 刘小美宋菊敏 （2006-10-24） 一、原理 机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3＋还原成Fe2＋，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。 二、目的 1．掌握总抗氧化能力的测定方法。 2．观察血虚小鼠模型总抗氧化能力的变化。 3．观察中药对血虚小鼠模型总抗氧化能力的影响。 三、材料和方法 1．试剂：总抗氧化能力测定试剂盒（南京建成生物工程研究所） 2．材料：EF管（1.5ml）120支，一次性试管（10ml）60支，移液器（P20ul、P100ul 、P1000ul）各2把及配套枪头各200支，玻璃比色皿（3ml，1cm光径）4只，温浴箱，分光光度计，漩涡混匀器1台，普通离心机大管、小管各1台，试剂瓶（125ml）1个，烧杯（150ml）2个，吸管（10ml）2支，吸球1支，量筒（200ml）1个，标签纸2张。 3．测定方法 （1）样本处理：取全血3500转/分离心15分钟得血清待测。 （2）试剂盒组成及配制：（50T） 试剂一：液体60ml×2瓶，40C保存。 试剂二：粉剂×2支，用时每支加双蒸水至120ml，室温保存。 试剂三：黄色贮备液10ml×1瓶，避光冷藏保存。贮备液得稀释液60ml×1瓶。 试剂三应用液的配制：临用前取贮备液以稀释液稀释，比例为1：19。需多少配制多少。 试剂四：溶液24ml×1瓶 试剂五：溶液24ml×1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。——测组织中总抗氧化能力时用到，测血清时不用。 处测各管吸光度。（370C时，每分钟每毫升血清使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位）。 4）计算： 总抗氧化能力（单位/毫升血清）＝（测定管OD-对照管OD）÷0.01÷30×19 四、注意事项 1．室温放置10分钟后必须立即测定吸光度，否则吸光度会增加。 2．实验试剂用量较少，所以加量一定要仔细、准确。 3．每次加样后都必须在漩涡器上充分混匀。 4．难吸难打的试剂必须做到慢吸慢打。 五．思考题 1．小鼠血虚模型总抗氧化能力会出现什么样的变化？为什么会出现这样的变化？ 2．怎样用本实验的结果解释模型动物的某些主要症状？ 1
附件8： 减肥功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重、体重增重 1.1.2 摄食量、摄入总热量 1.1.3 体内脂肪重量（睾丸周围脂肪垫、肾周围脂肪垫） 1.1.4 脂/体比 1.2 人体试食试验 1.2.1 体重 1.2.2 腰围、臀围 1.2.3 体内脂肪含量 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。 2.2 动物实验中大鼠肥胖模型法和预防大鼠肥胖模型法任选其一。 2.3 减少体内多余脂肪，不单纯以减轻体重为目标。 2.4 引起腹泻或抑制食欲的受试样品不能作为减肥功能食品。 2.5 每日营养素摄入量应基本保证机体正常生命活动的需要。 2.6 对机体健康无明显损害。 2.7 实验前应对同批受试样品进行违禁药物的检测。 2.8 以各种营养素为主要成分替代主食的减肥功能受试样品可以不进行动物实验，仅进行人体试食试验。 2.9 不替代主食的减肥功能试验，应对试食前后的受试者膳食和运动状况进行观察。 2.10 替代主食的减肥功能试验，除开展不替代主食的设计指标外，还应设立身体活动、情绪、工作能力等测量表格，排除服用受试样品后无相应的负面影响产生。结合替代主食的受试样品配方，对每日膳食进行营养学评估。 2.11 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验： 实验组的体重或体重增重低于模型对照组，体内脂肪重量或脂/体比低于模型对照组，差异有显著性，摄食量不显著低于模型对照组，可判定该受试样品动物减肥功能实验结果阳性。
1.抗氧化剂是指在低浓度下能有效延缓或阻止底物氧化的物质。被氧化的底物包括蛋白质、脂质、糖和DNA。 2.初始型抗氧化剂(AH)可通过与脂质自由基L.、过氧自由基LOO.或烷氧自由基LO.反应抑制脂质氧化链反应。 L.+ AH--- LH + A. LOO.+ AH--- LOOH + A. LO.+ AH--- LOH + A. 抗氧化剂自由基A.也能与过氧自由基、烷氧自由基反应从而终止脂质氧化反应。 LOO.+ A.---LOOA LO.+ A.---LOA 次级型抗氧化剂可通过各种机理延缓脂质氧化,如螯合过渡金属、给初始型抗氧化剂补充氢、清除氧以及使活性物质失活等。 抗氧化剂的活性分为在生物体外(如食品中)的活性和在生物体内的活性。本文综述了体外测定抗氧化剂抗氧化活性的方法,不包括在生物体中测定生物活性的方法。 3.评价或表征抗氧化活性的方法为了说明在特定条件下被测物抑制底物氧化的效力或清除自由基的能力 实际测定时至少要说明在测试条件下被测物是抗氧化剂还是促氧化剂;在指定浓度下比较不同测试材料(如被测物与标准抗氧化剂或添加有被测物的测试体系与空白体系)对底物的作用。 评价或表征抗氧化活性的方法有: (1)在指定的时间测量氧化产物或官能团的浓度或吸光度值;( 2)测量反应的速率;
( 3)测量诱导期(延滞期)或氧化达到一定程度所需的时间;( 4)测量速度的积分(即动力学曲线下的面积) ; ( 5)测量被测物产生与标准抗氧化剂相当作用的浓度。4.参数 4.1诱导期( induction period) 诱导期tIND(也叫延滞期, lag period)常定义为化学反应的速度。诱导期是一个相当不确定的值,受检测方法、使用仪器的灵敏性以及一些其他因素的影响。对于脂质氧化,诱导期通常是指链增长阶段动力学曲线的切线和时间轴的交点。 4.2抑制率( percentag e of inhibition)和IC50 抑制率和IC50 (抗氧化剂提供50%抑制作用时的浓度,也可用EC50表示的)常用来表征抗氧化能力。它们不仅与被测抗氧化剂的反应性能和氧化的底物有关,而且受其他因素的影响,如脂质氧化链反应的长度和抑制速率等。此外,用IC50表征抗氧化剂 的活性与比较活性的时间点有关。只有在其他参数相同的情况下,在某一研究中测得的抑制率和IC50才可以与另一研究中测得的值进行直接比较。TEC50是指抗氧化剂提供50%抑制作用所需的时间,也常用来表征抗氧化活性 5.对测定方法的要求 测定抗氧化剂抗氧化活性的方法应满足如下要 求: ( 1)能说明测试体系中发生的反应,并能用明确的动力学图解描述;( 2)测试要有再现性; ( 3)测试效率要足够高; ( 4)方法要相对简单; ( 5)能连续检测; ( 6)应使用与体内或食品有关的活性自由基;
缓解视疲劳功能评价方法 （征求意见稿） 保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 缓解视疲劳功能 1 人体试食试验项目 1.1 分别于试食前后进行眼部症状及眼底检查，血、尿常规检查，肝、肾功能检查，症状询问、用眼情况调查；于试验前进行一次胸透、心电图、腹部B超检查；。 1.2 明视持久度 1.3 视力 2 试验原则 2.1 受试样品试食时间为60d。 2.2 所列指标均为必做项目。 2.3 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，症状改善且症状总积分差异有显著性（p<0.05）。 3.2试验组自身比较或试验组与对照组组间比较，明视持久度差异有显著性（p<0.05），且平均明视持久度提高大于等于10%。 具备3.1及3.2可判定该受试物具有缓解视疲劳功能。
缓解视疲劳功能检验方法 Method for the Assessment of Alleviating Eye Fatigue Function 1受试者纳入标准 1.1 18岁~65岁的成人。 1.2长期用眼，视力易疲劳者。 2受试者排除标准 2.1患有感染性、外伤性眼部疾患者。进行眼部手术不足3个月者。 2.2患有角膜、晶体、玻璃体、眼底病变等内外眼疾患者。 2.3患有心血管、脑血管、肝、肾、造血系统等疾病者。 2.4妊娠或哺乳期妇女、过敏体质患者。 2.5 短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判定者。 2.6.长期服用有关治疗视力的药物，保健品或使用其他治疗方法未能终止者。 2.7不符合纳入标准，未按规定食用受试物者，或资料不全等影响功效或安全性判断者。 3 试验设计及分组要求 采用自身和组间两种对照设计。根据随机、双盲的要求进行分组，分组时根据症状及视力检查情况，使试食组和对照组的症状及视力水平均衡。同时要考虑年龄、性别等因素，使两组具有可比性。试食试验结束时每组受试者人数不少于50例。 4 受试物的剂量和使用方法 试食组按推荐方法和推荐量服用受试物，对照组服用安慰剂。受试物服用时间为连续60天。 5 观察指标 5.1 安全性指标： 5.1.1血、尿常规检查，体格检查。 5.1.2肝、肾功能检查。 5.1.3 胸透或X光片、心电图、腹部B超检查（于试食前检查一次）。 5.2 功效性指标：于试食开始及结束时检查。 5.2.1问卷调查：症状询问、用眼情况。 5.2.2眼科检查：包括眼底检查、视力检查（近视、远视、散光等）。 5.2.3明视持久度（测定方法见附录）。 6功效判定标准 6.1症状改善有效率：眼酸痛、眼胀、畏光、视物模糊、眼干涩、异物感、流泪，全身不适8种症状中有3种改善，且其他症状无恶化即判定症状改善。计算两组症状改善例数和两组症状改善有效率。症状改善有效率（%）计算方法为症状改善例数/试食例数×100。将两组症状改善有效率进行统计学检验。 6.2症状平均积分：计算每位试食者试食前后的症状积分，分别计算两组的平均积分值，并进行统计学检验。
抗氧化方法 一、Determination of Superoxide Anion Scavenging Ability（超氧阴离子清除能 力） 1、determined by a CL method in the pyrogallol-luminol system on a BPCL Ultra-weak luminescence analyzer。（焦性没食子酸-发光胺，荧光检 测） 2、步骤：10μL sample (不同浓度) + 50 μL焦棓酸(6.25*10-4 mol/L) + 0.94 mL of a mixture containing luminol (0.05 mol/L) and carbonate buffer (pH 10.2) （发光胺用pH 10.2碳酸盐缓冲液配成0.05 mol/L） 3、Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温 度：30 ° C.总时间：300S，每2S读数一次。 4、对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加焦棓酸（用来调零）。 二、Determination of Scavenging Ability on Hydroxide Radicals（羟基自由基清除能力） 1、CuSO4-Phen-Vc-H2O2 CL system（1 mL体系） 2、50 μL of sample solution （样品液）+ 50 μL of a 1.0 mmol/L CuSO4 solution （CuSO4 溶液）+ 50 μL of a 1 mmol/L 1,10-phenanthroline solution（邻二氮菲溶液）+ 700 μL of a 0.05mol/L borate buffer (pH 9.0) （硼酸缓冲液）+ 100 μL of a 1 mmol/L ascorbate solution + 50 μL of a 0.15% H2O2 solution 3、总时间400S，间隔3S。Hi-V, 800; Kv, -1; the spectral range of CL（波长范围）180-800 nm; 温度：30 ° C. 4、阳性对照：不加样品（样品用水代替）。空白不加H2O2（用来调零）。 三、Determination of Scavenging Effect on Hydrogen Peroxide（过氧化氢清除 能力） 1、luminol-H2O2 system
植物总抗氧化能力（TAC）比色法（ABTS）定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
植物总抗氧化能力 （TAC） 比色法 （ABTS） 定量检测试剂盒是一种旨在通过过硫酸钾的参与， 使染料 ABTS 氧化，在抗氧化剂的存在下，通过分光光度仪，观察其峰值下降的变化，来定量检测对应于标准水溶性生 育酚 Trolox 的总抗氧化能力，即抑制氧化等值浓度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功 实验证明的。适用于各种体液包括血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、精液等各种体液的总抗氧化能力检 测。产品严格无菌，即到即用，操作简易，性能稳定。b5E2RGbCb5E2RGbC
技术背景
超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-） 、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2） 、羟自由基或氢氧基 （hydroxyl radical；OH-） 、过氧化基（peroxyl radical；ROO-） 、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO） 、烷 氧自由基（alcoxyl radical） 、氮氧基（nitric Oxide；NO-） 、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl） 、半醌自由基（semiquinone radical） 、单线态氧气（singlet oxygen）等 细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡，甚而导致诸如 冠心病、风湿性关节炎、肿瘤、退行性病变等各种病理状况。在生物系统内，通过抗氧化酶例如超氧化物 歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等，大分子，例如白蛋白、铜蓝蛋白（ceruloplasmin；CER） 、 铁蛋白（ferritin）和抗氧化因子，例如生育醇、类胡萝卜素、抗坏血酸、还原性谷胱甘肽和尿酸胆红素 （bilirubin）等，产生抗氧化能力，即捕获自由基的能力，达到消除或降低ROS的损害。通过过硫酸钾 （potassium persulfate）氧化2,2’-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸） （2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline6-sulfonic acid)，diammonium salt；ABTS）产生的ABTS自由基，衡量体系中抗氧化剂捕获自由基或者消耗 抗氧化剂的能力，在分光光度仪（730nm波长）的帮助下，观察其峰值下降的变化，并与标准化抗氧化剂 水溶性生育酚Trolox对照。p1EanqFDp1EanqFD
产品内容
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附件9： 促进消化功能评价方法（征求意见稿） 保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定 Items, Principles and Result Assessment 1 试验项目 1.1 动物实验 1.1.1 体重、体重增重、摄食量和食物利用率 1.1.2 小肠运动实验 1.1.3 消化酶测定 1.2 人体试食试验 1. 2.1 临床症状观察 1. 2.2 胃/肠运动实验 2 试验原则 2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。 2.2 在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。 3 结果判定 3.1 动物实验：动物体重、体重增重、摄食量、食物利用率，小肠运动实验和消化酶测定三方面中任二方面实验结果阳性，可判定该受试样品有助于促进消化功能动物实验结果阳性。 3.2 人体试食试验：临床症状积分结果和胃/肠运动实验结果阳性，可判定该受试样品有助于促进消化功能人体试食试验结果阳性。 3.3动物实验和人体试食试验均为阳性结果，可判断受试样品具有有助于促进消化功能的作用。
促进消化功能检验方法 Method for the Assessment of Facilitating Digestion Function 1 动物实验 1.1 实验原理 胃肠道是营养物质的摄取、消化与吸收的器官，对食物的消化作用主要是依靠其运动、消化酶的分泌来完成的。如果某一保健食品能对这一环节或几环节有调节作用，那它就有可能有促进消化功能的作用。 1.2 实验项目 促进消化功能动物实验包括大鼠体重、体重增重、摄食量和食物利用率实验；小肠运动实验；消化酶的测定等三部分。 1.3 实验动物 根据实验项目可选用单一性别成年小鼠或大鼠。小鼠18g~22g，每组10只~15只，大鼠120g~150g，每组8只~12只。 1.4 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组和模型对照组。受试样品给予时间30d（小肠运动实验受试样品给予时间7d~15d），必要时可延长至45d。 1.5 实验容 1.5.1 体重、体重增重、摄食量和食物利用率 选用同一性别的大鼠。实验开始时动物体重的差异应不超过平均体重的10％。分不同剂量实验组和阴性对照组，经口给予受试样品，每周测2次体重和食物摄入量。实验结束时计算体重、体重增重、摄食量和食物利用率。 1.5.2 小肠运动实验 选用同一性别的小鼠，分不同剂量实验组、空白对照组和模型对照组，模型对照组用复方地芬诺酯或洛哌丁胺造模。可用墨汁或炭末加阿拉伯树胶作为指示剂。经口给予受试样品。实验结束前禁食不禁水20h，于测定当天各实验组和空白及模型对照组再给予一次受试样品或蒸馏水，30min后各实验组和模型对照组给予复方地芬诺酯5mg/kgbw ~6mg/kgbw或洛哌丁胺5mg/kgbw ~6mg/kgbw(依据复方地芬诺酯或洛哌丁胺的实用剂量取用，用研钵研碎呈粉末后按实验所需浓度配制，注意要待溶质完全溶解、充分摇匀后使用。)，空白对照组给予蒸馏水，30min后各组再给予指示剂(精确称取阿拉伯树胶100g，加水
第38卷第3期2802009年5月 卫生研究 JO U R N A L O F H Y G I E N E R ES EA R C H V01.38N o.3 M ay2009 文章编号:1000-8020(200903.02∞.04 几种生物活性物质体外抗氧化能力评价技术的研究 刘小兵朴建华1田园 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京100050 论著 摘要:目的研究生物活性物质体外抗氧化能力评价方法,应用体外理化环境下建立起来的评价方法对受试物进行初步抗氧化能力评估。方法联合应用2,2’.连氮.双.(3.乙基苯并噻唑.6.磺酸二铵盐(AB T S 法与铁离子还原/抗氧化能力测定法(r aA P法用于生物活性物质体外抗氧化能力研究。在A B T S法中。使用 紫外可见分光光度计734nm波长下测定以槲皮素、姜黄素、D L-a.生育酚和原花青素等为代表的生物活性物 质;在FR A P法中,运用酶标仪,595nm波长处测定同样受试物的抗氧化能力。结果A B TS法:槲皮素和姜黄 素的抗氧化活性T E A C值分别约为2.02和0.50;而l g D L-a.生育酚、原花青素清除自由基的能力相当于
2.06m m ol、2.897m m ol的Trol ox清除自由基的能力;F RA P法:抗氧化活性以1.O m m ol/L FeS04为参考标准,槲皮 素、姜黄素和Tr ol ox摩尔当量约为5.73、1.18和2.09;而D L-a.生育酚和原花青素抗氧化活性分别是207.7m g、 156.36r ag。结论A B TS法与FR A P法联合应用,操作简便、结果可靠,尤其适宜作为生物活性物质体外抗氧 化能力的评价方法。 关键词:生物活性物质氧化应激中图分类号:R151.2Q591A B T S法FR A P法抗氧化能力 文献标识码:A R ese a r ch on t he eval uat i on m et hods f or ant i oxi dant capaci t y of s ever al bi oact i ve s ubs t ances/n vi t r o LI U X i aobi ng,P I A O Ji anhua,TI A N Y ua n I nst i t ut e of N u t r i ti on a nd F oo d Saf et y,C hi nes e C ent er f or D i seas e C ont r ol a nd Pr event i on,B eij i ng100050,C h i na A bst r act:O bj ect t ve T o s t udy t he eval u at i on m e t h ods f or ant ioxi dant capaci t y of bioacti ve s ubs t B nce i n础阳,an d t O appl y t he m e t h ods w h i ch i s es t abl i s hed i n physi eochem i ea l envi r onm ent i n or der t o g i v e t he pr eli m i nar y as se韶,m ent of t e st subj e ct s.M et hods7r he co m bi ne d appli cat i on of A B T S and F R A P m e t h ods i n t he as s es s m ent https://www.doczj.com/doc/7d7962082.html, i ng t he U V—V I S
通过功能分析与整理明确必要功能后，价值工程的下一步工作就是功能评价。功能评价，即评定功能的价值，是指找出实现功能的最低费用作为功能的目标成本（又称功能评价值），以功能目标成本为基准，通过与功能现实成本的比较，求出两者的比值（功能价值）和两者的差异值（改善期望值），然后选择功能价值低、改善期望值大的功能作为价值工程活动的重点对象。功能评价工作可以更准确选择价值工程研究对象，制定目标成本有利于提高价值工程工作效率、增加工作人员的信心。 功能评价的基本工作步骤是： 1、计算功能现实成本，将零件成本按功能进行分配。 2、求功能评价值，一般以功能货币价值形式计算。 3、计算功能价值和改善期望值，选择研究对象。 功能评价使用的公式为： V=F/C 其中，V--功能价值 F--功能评价值 C--功能现实成本 当V=1时，表示实现功能的现实成本与其最低成本相适应，这种状态已经理想。 当V>1时，说明实现功能的现实成本低于最低成本，这种情况要做具体分析，可能状态已很理想，可能要适当提高成本。 当V<1时，说明现实成本高于最低成本，应当列为价值工程活动的重点对象。（F-C）为改善期望值，即成本降低幅度，F为目标成本。 功能评价的方法主要有：经验估算法、功能重要性系数法、最合适区域法、理论价值标准法、实际价值标准法、逻辑判断法、实际统计值评价法等。下面介绍其中的几种。 一、经验估算法 这种方法是由价值工程人员以及一些邀请的有经验的技术人员、专家对实现某一功能的几个方案进行成本估算，取成本最低的为目标成本。在要求精度不高的情况下，这是一种简便有效的方法。 二、理论价值标准法
有些功能成本可以根据物理学、材料力学和其它的工程计算方法进行计算，直接求出实现该功能的最低成本，进行功能评价。价值标准法比较科学可靠，应用简便，不需要评价的特殊技巧及熟练程度。但是该方法仅限于能够用物理学、材料力学等工程计算公式计算的，而且用理论公式计算往往考虑不到实际情况，所以作为研究对象的现实目标成本还要进一步结合市场行情、企业状况、国家政策等综合考虑。 三、实际价值标准法 实际价值标准法，是指广泛收集企业内外实现同样功能的已有产品资料，从中选择成本最低的产品作为价值标准。 实际价值标准法的实施步骤如下： 1、广泛收集企业内外实现同样功能的已有产品资料，包括其功能、功能的实现程度、产品成本资料以及实现功能的约束条件（如可靠性、操作性、质量、维修性等）。 2、将所收集的产品资料按功能实现程度进行分类并排列顺序。 3、根据实际价值标准决定产品目标成本。 采用实际价值标准法制定目标成本的价值标准现实存在，有说服力。但是现在的产品功能真的尽善尽美了吗？仍有可能存在过剩功能或功能不足，而且产品的功能与成本是不断变化的，所以选择实际价值标准时，一定要注意变化的情况，进行适当修正。 四、逻辑判断法 逻辑判断法也是一种相对评分方法，对研究对象各个功能区域进行功能评分，进行逻辑判断活动给出功能评价系数。这种方法可以在强制确定法和DARE 法的基础上进行。其评价步骤为： 1、进行定性评价，由上而下依次排出各零件功能重要程度的顺序。 2、自上而下进行对比，分析功能之间的关系，给出逻辑判断。 3、暂定最下一项的功能分值为某一数值，按照逻辑判断的数量界限依次打分。 4、每一功能的功能值除以得分总合，即得该零件功能评价系数。逻辑流程判断法确定的功能评价系数，更能准确反映各个零件功能的实际情况，按功能评价系数分配的目标成本比较切合实际。但功能评价时逻辑判断有一定主观色彩。 五、实际统计值评价法
抗氧化体内的评价方法 张丽楠 天津科技大学生物工程学院，天津300457 摘要：抗氧化是抵抗集体氧化作用的过程，目前准确评价生物活性物质的抗氧化能力已经成了氧化与抗氧化研究领域的热点问题，为了更好地评价样品的抗氧化性，常用的评价方法分为体内和体外评价方法，本文主要介绍几种体内的评价方法。 关键词：抗氧化性；体内测定方法 Evaluation of the antioxidant in the body Zhanglinan Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457 Abstract:Anti-oxidation is the process of collective resistance to oxidation, antioxidant capacity currently accurate evaluation of bioactive substances have become oxidized and antioxidant research in the field of hot issues, in order to better evaluate the antioxidant activity of the sample, the commonly used evaluation methods into in vivo and in vitro evaluation methods, this paper describes several methods evaluated in vivo. Key words:antioxidant activity:Determination of in vivo methods 抗氧化是抵抗集体氧化作用的过程，也是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤，因为自由基或氧化剂会将细胞和组织分解，影响代谢功能。因此，当生物体内产生了大量的自由基，平衡被破坏时，生物体就会生病，这样需氧生物在不断进化过程中，逐渐形成了一套完整的抗氧化系统。 基于不同原理的各种抗氧化活性检测方法已广泛用于抗氧化活性物质，这些方法虽然能够在不同的条件下反映抗氧化活性物质的多种功能特性，但也各有其局限性，目前常用的抗氧化活性检测方法主要基于以下机理：（1）样品对检测体系中脂类物质的氧化抑制能力反映被测物的抗氧化活性；（2）样品对检测体系中自由基的清除能力反映被测物的抗氧化活性；（3）测定样品的还原能力反映被测物的抗氧化活性。[1] 很据以上机理，抗氧化活性物质的检测方法分为体内评价方法和体外评价方法，本文针对当前该领域的发出状况，在总结前人的科研成果的基础上，简单的介绍几种体内评价方法。 1体内抗氧化防御系统 需氧生物在不断进化过程中，逐渐形成了一套完整的抗氧化系统，包括预防性的、阻断性的和修复性的，也即一级和二级抗氧化防御系统；分别在不同水平发挥着防御作用。一级抗氧化防御系统也称为初级抗氧化防御系统，分为抗氧化酶和非酶性抗氧化剂。能够是自由基失效的化学物质称为“抗氧化剂或抗氧化酶”。抗氧化剂或抗氧化酶是清除氧自由基或阻止、抑制氧自由基产生过氧化物的物质。抗氧化酶系统包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽转硫酶、髓过氧化物酶、细胞色素C过氧化物抗坏血酸过氧化物酶等。抗氧化非酶系统，也即抗氧化剂，包括两大类，一类是人体必需的抗氧化剂，包括维生素E、维生素C、类胡萝卜素、锌、硒、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、铜蓝蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等；另一类是人类非必需的抗氧化剂，如生物类黄酮、花色素、番茄红素和叶黄素等。 脂质、蛋白质和核酸是氧自由基攻击的主要靶点。在正常情况下，虽然初级抗氧化防御系统通过各种抗氧化剂和抗氧化酶能有效地防止活性氧对靶