酵母蔗糖酶的分离提取
摘要：介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的过程和方法。利用有机溶剂自溶法、质量分数50%乙醇分级和透析的方法纯化蔗糖酶，测得蔗糖酶的总活力和蛋白质含量均逐渐下降。
关键词：酵母、蔗糖酶、提取、纯化
Abstract:This paper introduces the process and the method of invertase extraction from yeast.Then the purified invertase was obtained by adding organic dissolvant,precipitatation with 50% ethyl alcohol and dialyzing。The results showed the whole vigour and the content of potein was all decreased by degrees.
Key words:yeast;invertase;extraction;purification
蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）,又称转化酶，特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济效益，蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5.
1.材料与方法
1.1试剂
1)酵母粉（实验室提供）
2)醋酸钠(0.5g)
3)乙酸乙酯（8ml）
4)10%醋酸
5)无水乙醇
6)蒸馏水
7)3,5-二硝酸水杨酸试剂（DNS）
8)考马斯亮蓝G-520
9)5%蔗糖
10)NaOH溶液
11)系列标准蛋白液
12)9%生理盐水
13)蛋白质染色液
14)磷酸缓冲液buffer（0.005mol/L PH6.0）
注：整个实验应避免高温，以防止酶失活（水浴温35℃）
1.2器材
1)量筒25ml
2)烧杯100ml、500ml
3)大小试管若干
4)吸耳球、玻棒、胶头滴管、PH试纸、各种滴定管
5)恒温水浴锅、冰水浴锅
6)秒表
7)离心管、离心机
8)分光光度计
9)冰箱
10)透析袋
11)托盘天平
1.3操作方法
1.3.1蔗糖酶粗品制备方法
1）自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次地加入15mL蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。
2）抽提补加蒸馏水10mL，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，4000r/min 离心10min,弃沉淀，得E1;量体积V1=17.5mL,取出2mL置于4℃冰箱保存，待测酶活力及蛋白质浓度(留样1)。
3）乙醇分级和透析
测E1 PH：用10%HAC调PH至４．５（注意少量、慢加、搅匀，防止调过），共加入0.5ml 10%HAc;
第一次乙醇分级（30%乙醇饱和度）：计算出使Ｅ１得乙醇浓度达30%时所需的无水乙醇Ｘ１的体积为6.6ml，将Ｅ１和乙醇Ｘ１，放入冰浴中预冷，在不断搅拌下缓慢滴加乙醇，4000ｒ／min离心10min，弃沉淀，留上清，得E2；量体积V2=19.5ml（留样２）;
第二次乙醇分级（50%乙醇饱和度）同上法加入Ｘ２（为达50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积），计算的加入无水乙醇Ｘ２为7.0mL。4000ｒ／min离心10min，弃上清，沉淀立即用10ml／150mol／LPH6.0的磷酸溶解，并装入透析袋，透析６小时，之后，4000ｒ／min离心10min，得E3，量体积V3＝11.0mL（留样３）;
1.3.2测蔗糖酶活性方法
取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35℃水浴中预热5min[若酶浓度过高，用0.02mol/l的醋酸缓冲液（PH=4.7）适当稀释］。
从留样的2ml中取0.1ml稀释150-200倍，即得稀释后的酶液。
表1 蔗糖酶水解蔗糖
试管0 1 ５％蔗糖（ｍＬ） 2 2
１mol/ml NaOH（ｍＬ）0.5
酶液（ｍＬ） 2 2
３５℃水浴，３ｍｉｎ
１mol/ml NaOH（ｍＬ）０.５
表2 还原糖的测定
试管0 1 2
反应液（ｍＬ）０. ５
（取自表１中０管）０. ５
（取自表１中1管）
０. ５
（取自表１中1管）
DNS试剂（ｍＬ）３３３
水（ｍＬ）１.５１.５１.５
沸水浴５ｍｉｎ后，立即流水冷却
水（ｍＬ）２０２０２０
OD520
在葡萄糖标准曲线上找到所测定光吸收值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：蔗糖酶活力单位＝葡糖糖毫克数×９×酶的稀释倍数
在本实验条件下，每３ｍｉｎ释放１毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。
1.3.3葡萄糖浓度标准曲线
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定。采用DNS 比色法测定还原糖的含量，同时用DNS闭塞定糖法测定蔗糖酶的活力。
表3 葡萄糖浓度标准曲线的制作
项目空白 1 2 3 4 5 6
含糖总量mg 0 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8
葡萄糖液ml 0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
蒸馏水ml 2.0 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6
DNS试剂ml 3 3 3 3 3 3 3
加热均在沸水浴中加热5min
冷却立即用流动冷水冷却
蒸馏水ml 20 20 20 20 20 20 20
光密度OD520nm
以葡萄糖（mg）含量为横坐标、A520值纵坐标，画出工作曲线。
根据得到的葡萄糖曲线，得到公式为：y=0.0746x+0.0024
1.3.4蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝G250染色法
1）蛋白质标准曲线的制作
表4 蛋白质定量测定标准曲线制作
溶液０管１管２管３管４管５管留样1 留样
1’
系列标准蛋白液ｍＬ_ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.5 0.5
实际蛋白质含量ｕｇ_ 20 40 60 80 100 _ _
0.9%生理盐水ｍＬ 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 _ _ _
蛋白质染色液ｍＬ 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出标准曲线。未知样品
从标准曲线上查出相应浓度经测定，得蛋白质含量与光密度值测定结果
表5 蛋白质含量与光密度值测定结果
根据得到的蛋白质曲线得到公式：Y=0.0543+5.985X
2）蛋白质浓度测定
从留样中取0.3ml 加0.9%的Nacl 稀释至3ml,再按以下表格操作测定
表6 蛋白质浓度OD 值
溶液
对照组 留样1 留样1’ 系列标准蛋白液/ml — 0.5 0.5 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 0.5 蛋白质染色液/ml 5.0
5.0
5.0
2结果
经测量和计算得:
表7 蔗糖酶活力单位
样本 稀释倍数 OD520
平均 1 2 E1 150 0.861 0.911 0.886 E2 100
0.586 0.538 0.562 E3
100
0.761
0.797
0.779
表8 蛋白质浓度
试管
OD595
E1 E2 E3
1 0.84
2 0.554 0.181
2 0.939 0.526 0.190 平均0.891 0.540 0.186 蛋白质毫克数0.140 0.0812 0.0220
表9 蔗糖酶分离提取效果计算结果
留样体积
ml 蛋白质浓度
mg/ml
总蛋白
mg
活力
U/ml
总活力U 比活力
U/mg
纯化倍
数
产量
（回收
率）
1 17.5 2.800 49 799.54 13991.95 285.55 1 100
2 19.5 1.624 31.668 337.55 6582.2
3 207.85 0.728 47.04%
3 11.0 0.442 4.862 468.45 5152.95 1059.8
4 3.712 36.83%
3.讨论与分析
3.1由表9蔗糖酶分离提取效果计算结果可知，因为随着酶分离提取步骤越来越多，其回收
率逐渐下降，则每次提取后得到酶的量逐渐减少，总蛋白的量及酶的总活力逐渐下降。但是，纯化倍数逐渐升高，即酶在分离提取过程中，酶中含有的杂质越来越少，纯度越来越高，比活力也随之升高。
3.2在整个实验过程中，采用了自溶法、抽提、乙醇分级和透析的方法。
3.2.1细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我们用的酵母菌细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH 值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。
3.2.2在离心抽提过程中，对称离心管必须使用托盘天平，以防止离心机震荡明显，造成事故。同时，离心管底端不能破裂，以防止在离心过程中，高速旋转加快离心管的破裂程度。测量过程中，应先测酶活力，再测蛋白质浓度。因为测酶活力时，可将酶液做适当的稀释，倘若酶液浓度过高，可加大酶液的稀释倍数。方便后续过程中对蛋白质浓度的测定。
3.2.3乙醇分级和透析对酶做了进一步的提纯，增加酶液的浓度和纯度。其中，因为蔗糖酶的本质是蛋白质，所以透析原理是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。透析是把待纯化的酶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液中进行。
3.2.3蔗糖酶活力的测定过程中，试剂应该按照顺序加入，蔗糖酶水解蔗糖用的试剂中有1Mol/L的NaOH，该试剂起的作用是钝化蔗糖酶，倘若还原糖测定的OD520值很大，则因酶液的浓度很大，造成了NaOH的钝化作用不明显，所以测酶活力时，适当加大酶的稀释倍数。除此之外，应该熟练掌握722S分光光度计的使用方法，具体操作流程：按MODE打到“T”，调100% ，拉杆，调“0”，按MODE打到”A”,再拉杆测量。
3.2.4蛋白质定量测定中，对于各留样应该设置平行实验和空白实验，两次测得的值取平均，减少实验的系统误差。
4.建议和改善
4.1自溶法过程中，需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。可
采用其他方法进行。酶的分离纯化有许多种方法，离心、过滤、膜分离、演习沉淀、等电点沉淀、选择性变性沉淀、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、凝胶电泳、有机溶剂萃取、浓缩、结晶等，在酶的分离纯化过程中，应该充分考虑避免酶的变性失活。一般情况下，所有分离纯化操作都应在低温条件下进行，而且要防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、剧烈搅拌等因素对酶活性的影响。近年来，高效液相层析（HPLC）和电泳技术越来越发达。
4.2测量时，应将剩余的酶液保存于适合温度下的冰箱中，以防止酶液的变性或失活。因
此，可增加对实验的设计，考察不同温度梯度下，酶液活力的变化，并寻找在其他适合条件下，酶活力最大时的最适温度，并寻找适合保存酶的温度。
4.3由于透析时间过长，则可采用超过滤的方法进行，利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上以达到浓缩和脱盐的目的，减少时间。同时，用HAC调PH至4.5时，利用的是蔗糖酶的最适PH为4.0~4.5。因此，可增加实验，即在其他适合的条件下，通过不同PH梯度下的酶活力的大小，测出蔗糖酶的最适PH值，加强实验的说服力和学生的实验操作能力。
5.参考文献
〔1〕阎伯旭、高培基.内切葡聚糖苷水解酶的分离纯化和内源荧光性质.生物化学杂志,1997,13(5):580～585 〔2〕王建枝,何善述,等.绒毛β-1,4葡萄糖苷酶的研究.生物化学杂志,1990,6(2):102～106
〔3〕袁静明,张崇华,等.戊二醛交联根霉葡萄糖淀粉酶的研究.生物化学与生物物理学报,1990,22(3):289～292 〔4〕余瑞远,倪逸生,等.大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质.生物化学杂志,1993,9(6):659～663
〔5〕BAILEY M, PETER B, KAISA P. Interalbortory testing of methods for assay of xylanase activity. J Biotech,1992,23:257～270
〔6〕朱静,严自正.微生物产生的木聚糖酶的功能和应用,生物工程学报,1996,12(4):375～378
〔7〕苏拔贤.生物化学制备技术.北京:科学出版社,1986,1.30-36
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
酵母蔗糖酶的提取工艺 摘要 蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。 采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。 蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述
生物化学实验示范报告: 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的: 1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离 提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉 淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶 蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质 的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置； 9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
实验3 酵母蔗糖酶的制备 一、实验目的 1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶 2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量 二、实验原理 酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。 三、实验器材 1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。 2、材料：啤酒酵母、 3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。 四、实验步骤 1 研磨水提取 (1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。 (2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。 (3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。 (4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。 (5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。 (6) 将上清液转入量筒，量出体积。用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。 2 热处理和乙醇沉淀 (1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
蔗糖酶的分离提纯 【实验目的】 1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2．掌握离心技术、电泳技术、层析技术、膜分离技术和分光光度法。 【实验原理】 蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名β--D--Fructofuranosidase 系统命名：β--D —Fructofuranosideffructonydrolase 。 蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是： H OH OH H 蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含量很丰富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。 研究表明采用菌体自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱层析两步分离提纯步骤，就可制备纯度较高的蔗糖酶制剂，而且收率也较好。从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性质、动力学研究也十分方便。 【实验材料、仪器和试剂】 1．实验材料和试剂 (1)0．2％葡萄糖标准液；(2)3，5-二硝基水杨酸试剂；(3)新鲜啤酒酵母； (4)甲苯；(5)乙酸钠；(6)稀乙酸溶液；(7)95％乙醇；(8)DEAE--纤维素；(9)0.5mol ／L NaOH ；(10)0.5mol ／L HCl ；(11)0.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液；(12)含O.15mol ／L NaCl 的O.005mol ／L ，pH6.0的磷酸钠缓冲液； CH 2OH H OH H H OH CH 20H
(13)5％蔗糖；(14)测定蛋白质浓度试剂；(15)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂2．仪器 (1)恒温水浴；(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰盐浴； (4)离心机；(5)721型分光光度计；(6)柱层析装置；(7)天平；(8)pH计； (9)滴管、试管和血糖管；(10)秒表 【方法】 一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1．取10支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨 上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇匀，于540nm测光密度。 2．以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 二、蔗糖酶的分离提纯 1．蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶 称取10克干酵母，放在200mL的烧杯中，加30mL蒸馏水搅成糊状，再加入 1.5克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。 (2)提取及粗酶的制备 往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二天，将自溶液于4500r／min离心20min。取出离心管，小心将上清液倒入烧杯中，弃沉淀。得到的上清液就是无细胞抽提液，即粗酶液（E1）。 量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品（4℃保存）。2．乙醇分级 将粗酶液用稀醋酸调pH至4.5。 (1)32％乙醇饱和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
酵母蔗糖酶的固定化 实验三酵母蔗糖酶的固定化 一、实验原理 1.固定化酶 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。 2.酶活测定 蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。二、实验材料、仪器和试剂 1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液 2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等 3.试剂
(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 (2)10%蔗糖溶液 (3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液 (4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至 100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液 三、实验步骤 1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联 (1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。 (2)称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。 1 (3)将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。 注意:为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。 (4)壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。 2.固定化酶的制备 (1)将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。
论文 论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 作者姓名周柱林 指导教师钟莉 学科专业食品科学与工程1102 所在学院生物与环境工程学院 提交日期 2013年12月
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 周柱林 生物与环境工程学院食品科学与工程1102班 摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用Q Sepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660. 关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量 1.前言（文献综述）： 啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β -D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。 目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多 , 有SDS抽提法，正交法等等，其中以甲苯自溶法最为常见。本实验采用此自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，利用有机溶剂将胞内蔗糖酶释放，经过初提取的离心去杂和等电位沉淀，制得的粗酶经醇沉后，采用Q Sepharose-柱层析法纯化，利用DNS法测定其酶活力，利用Folin-酚法测定蛋白质的含量及比活力，利用微量凯氏定氮法测总蛋白氮，以及用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究，也为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的技术开发提供了实验依据。
大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。 一．实验原理及相关知识 （1）蔗糖酶的介绍 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的 —呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 （2）。实验原理： 本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有以下分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 同组学生姓名： 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1. 掌握蔗糖酶的提取纯化的操作方法。 2. 熟悉有关生化技术的基本操作。 二、实验内容和原理 1、酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料： 市售干酵母粉 2、实验试剂： ⑴ 石英砂 ⑵ 95%乙醇(-20℃） ⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 3、实验仪器 （1）电子天平（称量样品） （2）研砵（每组一套） （3）50ml 高速离心管（4支/组、离心管架1个/组） （4）托盘天平（离心管平衡用） （5）高速冷冻离心机 （6）恒温水浴箱（50℃） （7）制冰机 （8）1.5ml 离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 （9）－20℃冰箱
实验名称：_ __________________姓名： 学号： 四、实验方法和步骤 1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g ，约3g 石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I ）,另留1ml 上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE 分析。 2、热处理 将上一步抽提液（样品I ），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml 离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml 上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE 分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 上清液（样品Ⅱ）加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min 离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验。 五、实验数据记录和处理 V1=35.0ml V2=30.0ml 六、实验结果和分析 V1=35.0ml V2=30.0ml 七、实验讨论和心得 酶作为一种蛋白质，在发挥其生物功能需要保持适当的高级结构。如果提取工作在温度较高的环境中进行，那么过高的温度有可能会不可逆的改变、破坏这种高级结构，导致酶失活；其次，蛋白质在高温下易于降解，保持冰浴能够最大限度的降低蛋白降解的速率。所以酶液的提取要在冰浴中进行。 另外，实验操作过程中应小心注意，切勿打翻样品液。因为这个实验是之后一系列实验的基础，所以，提取的蔗糖酶的质量决定着后面实验的质量。 装 订 线 P.2
实验报告 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法 二、实验内容和原理 1、离子交换层析 由于蔗糖酶的偏酸性,所以在7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测 蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。（100℃显色） 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂 ⑴ ⑵ 20 7.3 缓冲液 ⑶ 20 （1 ）7.3缓冲液 ⑷ 0.2乙酸缓冲液，4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液 ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器 （1）高速冷冻离心机 （2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）
（3）? （1套/组） （4）部分收集器及收集试管（4管）（1台/组） （5）－20℃冰箱（保存样品用） （6）微量移液枪 200、1000 （7）1.5离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） （8）7离心管（留样品Ⅳ用） （9）恒温水浴（50℃、100℃） （10）试管、移液管、试管架等 四、实验方法和步骤 1、仪器连接 （1）接通各仪器电源，将泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。注意B为含溶液。 （2）点击电脑桌面上软件图标，打开软件。选择，点击，进入操作界面。点击 （3）在操作界面的工具栏，点击。出现窗口，调节为 1，确定。 2、装柱与平衡 （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（)相连，下端接头与样品阀（ )相连。 （3）平衡一个柱体积（约2020） 3、加样 停止加入20 7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，程序暂停。旋开柱上方接头，用胶头滴管缓慢将5蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。程序继续，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，程序暂停，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加缓冲液至一定高度。 4、洗脱（梯度洗脱法） （1）加样后，先用进行洗脱，洗去未被凝胶吸附的杂蛋白（20左右）； （2）待层析柱流出液在仪器上绘出的基线稳定，在程序主界面的工具栏→ → → ，在两个框内均填入100，点击，最后点击一次，开始梯度洗脱。每2接一管，当上升至8 时，开始测定各管的蔗糖酶活力； （3）将蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，测量总体积V4（样品Ⅳ），样品用7离心管－20℃保存。 5、蔗糖酶活力检测
酵母蔗糖酶的分离提取 摘要：介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的过程和方法。利用有机溶剂自溶法、质量分数50%乙醇分级和透析的方法纯化蔗糖酶，测得蔗糖酶的总活力和蛋白质含量均逐渐下降。 关键词：酵母、蔗糖酶、提取、纯化 Abstract:This paper introduces the process and the method of invertase extraction from yeast.Then the purified invertase was obtained by adding organic dissolvant,precipitatation with 50% ethyl alcohol and dialyzing。The results showed the whole vigour and the content of potein was all decreased by degrees. Key words:yeast;invertase;extraction;purification 蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）,又称转化酶，特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济效益，蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5. 1.材料与方法 1.1试剂 1)酵母粉（实验室提供） 2)醋酸钠(0.5g) 3)乙酸乙酯（8ml） 4)10%醋酸 5)无水乙醇 6)蒸馏水 7)3,5-二硝酸水杨酸试剂（DNS） 8)考马斯亮蓝G-520 9)5%蔗糖 10)NaOH溶液 11)系列标准蛋白液 12)9%生理盐水 13)蛋白质染色液 14)磷酸缓冲液buffer（0.005mol/L PH6.0） 注：整个实验应避免高温，以防止酶失活（水浴温35℃） 1.2器材 1)量筒25ml 2)烧杯100ml、500ml 3)大小试管若干
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定 摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。 第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。 第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。 第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。 最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。 关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD 正文： 1，蔗糖酶的提取及提纯 1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体 内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要 破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系 将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界
酵母中蔗糖酶的制备及活力测定 一、目的要求 1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。 2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）测定酶活力的原理和方法。 3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。 二、实验原理 蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。 酶活力单位的定义：在一定条件下，反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位（U）。 三、仪器与试剂 1. 仪器 研钵，天平，离心机，721型分光光度计，恒温水浴，具塞试管25ml，沸水浴，移液器（1000ul、200 ul） 2. 试剂 市售酵母干粉，石英砂，丙酮（预冷）, 1mg/ml葡萄糖溶液，pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液。 四、实验方法 1. 蔗糖酶制备 称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中，加适量蒸馏水，用力研磨30分钟成糊状，再加蒸馏水100ml，搅匀，6层纱布过滤，滤液加2倍体积冷丙酮搅匀，静置5分钟，离心管中，平衡后3000 rpm离心10 min，弃上清取沉淀。沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。沉淀真空干燥后称重。再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟，用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。 2. 蔗糖酶活力测定 （1）制作葡萄糖标准曲线 取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。按表1操作。