浙江工业大学药学院生物化学实验论文
2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文
摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD
540
计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD
660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；
正文：
文献综述
蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.
实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会
1 蔗糖酶的提取及初步提纯
1.1实验原理
酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。
1.2 试剂与器材
1.2.1试剂
①啤酒酵母；
②醋酸钠（AR）；
③甲苯（AR）；
④4mol/L醋酸；
⑤95%乙醇（<-20℃）；
⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏
水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水
稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀
释10倍即得。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
1.2.2器材
①锥形瓶250ml（31），50ml（31）；
②量筒10ml（31）25ml（31）;
③烧杯100 ml（31），1000 ml（31）；
④具塞试管10 ml（33）；
⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；
⑥培养箱；
⑦恒温水浴箱；
⑧磁力搅拌器，搅拌子；
⑨高速冷冻离心机。
1.3操作方法
1．酵母的自溶：在弱碱中培养60小时；
2．初提取液A：取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A；
3．热提取液B：水浴提取液A，并使PH为4.5，离心得热提取液B
4．乙醇沉淀提取液C：将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少于30min，离心得提取液C
1.4结果与分析
1.4.1结果
表2-1
提取液颜色状态体积（ml）
A 黄色液体17.0
B 浅黄色液体18.0
C 淡黄色液体8.27
V A总=V A=17.0ml
V B总=V B2[V A/(V A-3)]=18.0ml
V C总=V c2[V A/(V A-3)] 2[V B/(V B-3)]=V c2[V B总/(V B-3)]=8.27ml
1.4.2分析
提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。
1.4.3结论
V A总=17.0ml ；V B总=218.0ml ；V C总=8.27ml。
1.5注意事项
①第一次离心后取液体时要小心；
②水浴时的温度不要超过50℃。同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。冰
浴时要迅速操作；
③冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；
1.6认识与体会
实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50°C以上失活。
2 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法
2.1实验原理
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
2.2试剂与器材
2.2.2.1试剂
①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
②1mol/LNaCl的0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
③0.5mol/LNaOH；
④Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.2.2.2器材
①层析柱；
②梯度混合器;
③磁力搅拌器，搅拌子；
④紫外分光光度计；
⑤点滴板；
⑥尿糖试纸、擦镜纸；
⑦止水夹；
⑧烧杯、试管。
2.3操作方法
1．离子交换柱的填充：将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不
得干柱）。
2．缓冲液盐度梯度发生器的安装：在低浓度一段装入搅拌子。且要形成梯度。
3．柱的平衡：将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4．加样：缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一
5．洗脱：为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。
6．测OD值：在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下：表2-2
试管号OD
280值试管号OD
280
值
1 0.32
2 14 0.120
2 0.447 15 0.109
3 0.060 16 0.083
4 0.054 17 0.077
5 0.065 18 0.069
6 0.031 19 0.126
7 0.028 20 0.305
8 0.016 21 0.900
9 0.037 22 1.014
10 0.048 23 0.673
11 0.061 24 0.281
12 0.231 25 130
13 0.284
7．酶活力测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取1、
2、5、12、1
3、1
4、20、21、22、23管进行测试。
酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
将其合并成一管，V D =5.22ml
2.4结果与分析
2.4.1结果
V D =5.22ml
V D 总=V D 2V C 总/V 样=5.636.1/0.5=86.34ml 。 由数据得表如下：
蔗糖酶洗脱曲线图
0.322
0.447 1.014
0.673
0.06
0.0540.065
0.0310.0160.0280.0480.037
0.061
0.2310.2840.12
0.083
0.1090.069
0.077
0.126
0.305
0.90.281
0.13
0.2
0.40.6
0.8
1
1.2
1
2
345678910111213141516171819202122232425
试管号
24
68
101214
1618盐浓度梯度
系列1
系列2
-±
+
++
----
图2-1 Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
2.4.2分析
①柱的高度与冲洗的流速、梅的浓度及柱的带电量大小会影响样品在柱
内的移动快慢；
②酶活力不是特别的强，也许是前面柱下端渗出液体导致蔗糖酶流失； ③适当增加柱的高度与降低冲洗液的流速能提高分离效率；
④在使用Q-Sepharose 纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和
DEAE Sepharose 层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose 纯化方法有如下特点：
(1) 提高实验效果。琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,
分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。
（2） 缩短实验时间。梯度洗脱时间由原来的100min 缩短到现在的
50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。
（3） 节约实验支出。离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度
会随缓冲液浓度及pH 改变,不能承受0.1M 以上NaOH 清洗,重生
效果差,寿命短。琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越
性。且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重
生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。
2.4.3结论
V D 5.22ml
V D总=86.34ml。
2.5注意事项
①在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。当液面低
于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果；
②加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯；
③恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下
滴过快而引起干柱。是绝对不能干柱；
④盐度梯度发生器内气泡要除尽；
2.6认识与体会
在本实验中，由于操作失误，导致柱内气压太大，加样时在柱的下端有液体流出，影响了本实验的准确性，使得D的酶浓度不高，影响后续实验，提纯也不好。
3 蔗糖酶活力的测定
3.1实验原理
本实验用DNS法测还原糖的含量，进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。
酶活力单位数（U）：在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。
总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*(试管溶液总体积/2)*V总*n V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=（各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活）*100%
3.2试剂与器材
3.2.1试剂
①3,5-二硝基水杨酸
（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
（2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。将甲乙二溶液混合即得黄色
试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7~10天后使用。
②葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml）准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先
在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容
量瓶中，定容。5%蔗糖、；
③0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml
的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L；
④ 5%蔗糖用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置；
⑤ 2mol/L NaOH 溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。
3.2.2器材
①电炉；
②恒温水浴;
③紫外分光光度计；
④试管、吸管；
3.3操作方法
1．葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。
表2-3 葡萄糖标准曲线的制作
试管号0 1 2 3 4 5
葡萄糖0 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 蒸馏水 3.00 2.20 2.00 1.80 1.60 1.40 DNS 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 总体积 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 OD 0.000 0.234 0.406 0.557 0.746 0.914 2．酶活力测定
①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：
200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：
20）。
②取8支试管，按表3-2加入各种试剂。
表2-4 酶的催化反应
项目A（1：200）B(1:200) C（1：200）D（1：20）
加样A对A样B对B样C对C样D对D样酶液/ml 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
2N NaOH 0.50 —0.50 —0.50 —0.50 —
35℃预热10min，同时预热5%蔗糖
5%蔗糖 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
立即摇匀，准确计时，反应3min
2N NaOH —0.50 —0.5 —0.50 —0.50
总体积/ml 4.50 4.50 4.50 4.5 4.50 4.50 4.50 4.50
③取反应液A 0.15ml，B 0.25ml，C 0.10ml，D 0.90ml进行DNS反应，
测定540nm 处OD 值。
得到OD A =0.348 OD B =0.288 OD C =0.456 OD D =0.508
3.4结果与分析
3.4.1结果
①绘制葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线图
0.746
0.914
0.557
0.4060.234
0.187435294
0.173317647
0.212847059
0.225082353y = 4.25x - 0.4486
R2 = 0.9991
0.10.20.30.40.50.60.70.80.910
0.05
0.10.150.20.250.30.35
葡萄糖含量/mg
OD540值
图2-2
总活力单位数=mg/V 测24.5/22V 总2n
酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A 的总酶活）2100%
本次试验最终结果：表2-5 3.4.2分析
（1）、理论中A 、B 、C 、D 的回收率应该是越来越低的，但这里确实C>B ，
可能是因为C 中蔗糖酶浓度高于B 或反应时间控制不好； （2）、蔗糖酶标曲在01.-0.7之间呈线性关系，低于01或高出0.7都要重新
做过；.
3.5注意
①做葡萄糖标准曲线时，加完各种试剂后要充分摇匀。要求测得的OD 值在0.1~0.7
项目 初提液A
热提取液B
乙醇提取液C
柱分离液D
V 测/ml 0.15 0.25 0.10 0.90 mg 0.187 0.173 0.213 0.225 V 总/ml
17.1 19.4 9.0 97.8 总活力单位数/U
9613.62
6051.64
8618.40
1100.25
回收率/% 100 62.95 89.65 11.44
②测定酶活力时，要准确反应3min，这个反应时间应该精确把握，不要
多1秒也不要少1秒
③测得在线性范围外的OD值，需重新配液显色反应。
④由于某些原因我们这一组用的是另一组的试剂，所以数据不符合前面
的实验；
3.6认识与体会
（1）、还原糖的测定方法有菲林试剂热滴法、3,5-二硝基水杨酸法、nelson 试剂法；
（2）、在这种定量且精确地实验中要严格控制一些因素，比如在这个实验中必须严格控制反应时间；
4 蔗糖酶的蛋白质含量测定及比活力计算
4.1实验原理
比活力是指单位质量（mg）蛋白质中酶的含量（U），常用来表示酶的纯度。
比活力=酶的含量（U）/蛋白质含量（mg）
测定蛋白质含量的方法有福林-酚试剂法、微量凯式定氮法、紫外吸收法、考马斯亮法等，本实验采用的是福林-酚试剂法，或称Lowry法，蛋白质与Folin-酚A试剂（碱性）在碱性条件下形成铜-蛋白质复合物，然后加入Folin-酚B（酸性），铜-蛋白质复合物将其还原形成深蓝色钼蓝和钨蓝化合物。因为Folin-酚B 中的磷钼酸-磷钨酸可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物。蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的吸光值。故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值，然后据此测出未知样品的蛋白质浓度[5]。
4.2试剂与器材
4.2.1 试剂
①试剂A（碱性铜试剂）取Na2CO3（AR）10g和NaOH（AR）2g，加蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠（Na2C2H3O3?2H2O，AR）0.1g和CuSO4?5H2O （AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至100ml，即为试剂A。该试剂为含10% Na2CO3，0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料试剂瓶中，24℃至少可使用1个月。溶解于500毫升蒸馏水中。；
②试剂B（酚试剂）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。
③标准浓度牛血清白蛋白溶液（200μg/ml）精确称取结晶牛血清蛋白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。；
4.2.2器材
①分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；
②刻度吸管0.5ml（31），2ml（31），5ml（31）;
③试管1.5 cm315cm（38）；
④具塞试管10 ml（33）；
⑤恒温水浴箱（55℃）；
4.3 操作方法
1．标准曲线的制作
表2-6 标准曲线的配置加样表
管号0 1 2 3 4 5 BSA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 水 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5
试剂A 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
静置10min（立即充分混匀）
试剂B 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
静置10min（立即充分混匀）
试剂B 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
混匀55℃水域5min,测A660
OD
6600.000
0.237
0.216
0.344 0.481 0.623 0.739
由于在振荡时，管1有洒出，因此做了两次。
2.未知蛋白浓度的测定
按A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）进行稀释，A稀释液去0.4ml，B、C、D稀释液各取5ml测定OD
660
(所得数据如上表所示)。
【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定，而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚B试剂加入后，应迅速摇匀（加一管，摇一管），使还原反应产生在试剂被破坏之前。
4.4结果与分析
4.4.1结果
表2-7实验结果数据记录表
标准牛血清蛋白（ml) 标准牛血清蛋白(μg) OD660
0.2 40 0.216/0.237
0.4 80 0.344
0.6 120 0.481 0.8 160 0.623 1 200
0.739
牛血清蛋白标准曲线图
0.216
0.3440.481
0.623
0.739
C1,
79.96969697,
0.347
B1,
58.45454545,
0.276
A1, 93, 0.39
D1,
10.57575758,
0.118
y = 0.0033x + 0.0831
R 2 = 0.9991
00.10.20.30.40.50.60.70.80
50
100
150200250
蛋白质含量/
OD660值
图 2-3
表2-8实验处理结果总汇表
总体积/ml 总酶活/u
总蛋白/mg 比活力/u/mg 蛋白回收率/%
酶活回收率/% 纯化倍数/倍 初提取
液A 17.0 9613.62 316.20 30.40 100
100 1.00 热提取
液B 18.0 6051.64 210.24 28.78 66.49
62.95 0.95 乙醇提
取液C 8.27 8618.40 16.53 521.38 5.23
89.65 17.15 柱分离
液D
86.34 1100.25 0.37 3014.36 0.12
11.44
99.16
4.4.2分析
样品 A1 B1 C1 D1 OD 660 0.390
0.276
0.347
0.118（小）
（1）、此次方法的优点是操作简单，灵敏度高；缺点是蛋白质浓度和光密度线性关系不够严格，而且不同的蛋白质会因Tyr和Trp的含量不同，造
成显色程度有差异；
（2）、此实验中由于蔗糖酶不断提纯，虽然也不断损失，但比活力还是应该上升的，但这次实验中比活力A>B，是因为上次实验我们组的酶活力没
测，这次用的是上次做的那个组的酶活力；
（3）、测D的OD值时是0.118，不在线性范围内，但由于D试剂不够用，不重做，本来应该将D的取样量提高重做；
4.5注意
①试剂A加完后，立即充分混匀，静置10min。再向各管加B后放置10min，
再加第二次。
②每次加A、B后应立即迅速充分混合。
4.6认识与体会
（1）、folin-酚法之所以比双缩尿试剂法灵敏是因为此法显色原理与后者相同，只是加入了第二种试剂----folin-酚B试剂，以此增加显色量，从而提
高了灵敏度；
（2）、做实验时要谨慎仔细，尽量避免不必要误差，在本实验中，我在振荡试管时有时会将溶液振出，虽然量不多，但由于此法灵敏度高也会造成
相当的误差，在振荡方面仍需练习；
5微量凯氏测总蛋白
5.1实验原理
凯氏定氮法由Kieldahl于1833年首创，是一种元素分析方法。根据取样量
分类，可以分为常量和微量。
而不同蛋白质中含氮量平均16%，凯式定氮仪测定含氮量，然后乘以蛋白质
换算系数6.25，得到蛋白质含量。N / 16% = N 3 6.25 = 蛋白质含量
实验共需消化、蒸馏、滴定3个步骤，其中消化是为了将有机氮转化为无机氮，
然后在碱性条件下蒸馏，让无机氮转化成氨气出来，用硼酸试剂吸收，最后用盐
酸滴定。滴定指示剂在碱性条件下是绿色，当溶液由绿色--灰色--红色时可认为
是滴定完全。
NH2CH2COOH + H2SO4 → 2 CO2 + 3 SO2 + H2O + NH3
2 NH
3 + H2 SO
4 →（NH4）2 SO4
（NH4）2 SO4 + Na OH → Na 2 SO4 + 2 H2O + 2 NH3
2 NH
3 +
4 H3BO3 →（NH4）2B4O7 + 5H2O （NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O → 2NH4Cl + 4H3BO3
5.2试剂与仪器
2.5.2.1试剂
①蛋白样品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100ml；
②浓硫酸；
③硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量分数）混合研磨成粉末；
④30%NaOH溶液:30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml；
⑤2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100ml；
⑥混合指示剂：0．1％甲基红酒精溶液和0．1％甲基蓝酒精溶液临时
按2:1的比例混合。或0．1％甲基红酒精溶液和0．1％溴甲酚绿酒
精溶液临时按1:5的比例混合
5.2.2器材
①改良式凯氏定氮仪；
②克氏烧瓶50ml（32）;
③移液管；
④锥形瓶50ml（33）；
⑤吸球、玻棒、滴管、量筒；
5.3操作方法
1．消化
凯氏瓶内加入A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化剂，消化至淡绿色，定容至50ml。
2.洗涤定氮仪
实际操作时，观察到随着锥形瓶内水量增多，指示剂变棕红色。
第三次洗涤后，指示剂不变色。
3．蒸馏
实际操作时，在加反应液后，反应室内液体变成棕黑色，液体反应剧烈。
指示剂有红色变成棕色，最后变成绿色。
4．滴定
用0.01N HCl将锥形瓶中的指示剂滴定至淡紫色，记录消耗HCl的量。
5.4结果与分析
5.4.1结果
表2-9
次数 1 2
HCl消耗量/ml 0.85 0.82
HCl消耗量（同组）/ml 0.75 0.77
样品含氮量=(A-B) 3N=11mg/ml
样品含蛋白质量=1251mg
5.4.2分析
（1）、上次用folin-酚法测得的提取液B的蛋白质是210.42mg，而此次测得为1251mg，影响原因可能有：
A、folin-酚法以Tyr和Trp为中心测，实际蛋白质有其他氨基酸且不一定
符合比列；
B、凯氏定氮法中不能否定其含有其他含氮物质；
C、收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸PH影响较大；
D、蒸汽洗涤时间不够长也可以大致实验结果偏大；
E、最后滴定过程中，滴定操作的标准与否也对实验的结果影响较大；
（2）、本次试验与上次实验测定的结果由较大的出入，其影响结果的主要因素有：1.收集氨气过程中带入了水蒸气对硼酸PH影响较大；2.蒸汽洗涤
时间不够长也可以大致实验结果偏大；3.最后滴定过程中，滴定操作的
标准与否也对实验的结果影响较大；
5.4.3结论
样品含氮量=11mg/ml
样品含蛋白质量=1251mg
5.5注意
（1）、消化时，样品勿粘于烧瓶壁上；
（2）、定氮仪的橡皮管、塞都需处理；
（3）、蒸馏时火不能太猛；
5.6认识与体会：
1、常量凯氏定氮法测总蛋白氮时可用强酸，微量凯氏定氮法测总蛋白氮必须用弱酸。
2、folin-酚法与凯氏定氮法比较：
（1）、folin-酚法：操作简单，灵敏度高，但操作需严格计时、干扰多；
（2）、凯氏定氮法：费时间，灵敏度比前者低，但干扰少，用于蛋白质的测定准确
6 SAS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量
6.1实验原理
电泳是指溶液中带点粒子在外加电场的作用下，向相反电极方向移动的现象。蛋白质的电泳迁移率主要取决于它在某PH下所带的净电荷量、分子大小（即分子量）和形状的差异性。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（Ap）和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。凝胶孔径大小可通过改变Acr和Bis浓度来调节。浓度越大，孔径越小，颗粒穿过网孔的阻力越大，反之亦然。网孔大小根据所分离物的分子量的大小来选择。本实验选择分离胶浓度12%。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续的和不连续的凝胶电泳两类。
不连续凝胶电泳有三大效应：
（1）浓缩效应：①两层凝胶的孔径不同（孔径的不连续性）；
②缓冲液与凝胶离子成分和pH不同（缓冲系统的不连续性）（2）分子筛效应：颗粒小，圆球形的样品分子，移动较快；颗粒大，形状不规则的分子阻力较大，移动较慢。
（3）电荷效应：大部分蛋白质在pH8.3带负电，电荷多迁移快
SDS即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂。它可以破坏蛋白质分
子之间的非共价键，形成带大量负电荷的蛋白质-SDS复合物，使蛋白质丧
失了原有的电荷状态，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然电荷的
差异；引起蛋白质分子构象的改变。
6.2试剂与器材
6.2.1试剂
①30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，
先用80ml双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水
稀释至100ml，过滤。用棕色瓶中，4℃保存一个月。
②10%的TEMED；
③10%过硫酸铵（AP）：现用现配。；
④分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tris 9.08g
溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH8.8，用双蒸水定
容至50mL， 4℃保存；
⑤浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g
溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH6.8，用双蒸水定
容至50mL，4℃保存；
⑥23SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，
pH6.8）+4ml10%SDS+1ml巯基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(质量浓度)
溴酚蓝，加双蒸水定容至10mL，4℃保存。
⑦SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1%SDS，
pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml双蒸水中，加
入50ml 10%(质量分数)SDS贮存液，加双蒸水定容至1000mL则成5
3SDS-电极缓冲液。
⑧10%SDS：25gSDS用双蒸水定容至250mL，室温保存。
⑨染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL
冰乙酸，用滤纸过滤。
6.2.2器材
①垂直板型电泳槽；②玻璃板; ③大培养皿；④烧杯；吸量管；滴管
6.3 操作方法
1．分离酸制备
装配制胶工具，按表比例配制分离胶，小心加满水，待聚合好后，倾
去水，用滤纸片吸干胶面。
2.浓缩胶制备
按表配置浓缩胶，迅速混匀，倒在分离胶上层，插上梳子，待聚合好
后，拔出梳子，用滤纸片去除齿孔中的气泡。
3.加样
取100μL样品与100μL样品缓冲液混合，沸水浴3-5min，取20μL
各样品加入齿孔中，加一孔Marker，将电极缓冲液倒入电泳槽。
4.电泳
调节电流，电泳至溴酚蓝距酸前沿1.5cm左右，停止电泳。
5.染色和脱色
小心取出凝胶，置于平皿中，加染色液中过夜，用脱色液脱色，换两次脱色液，至背景透明。 6．计算样品相对分子质量。
6.4结果与分析 6.4.1 结果
表2-10 蛋白质分子
迁移距离/cm 染料迁移距离/cm 相对迁移率
标准蛋白分
子量
标准蛋白分子量的对数 2.94 4.4 0.668 14400 4.158362492 1.30 0.295 31000 4.491361694 1.19 0.270 43000 4.633468456 0.72 0.164 66200 4.820857989 0.48 0.109 97000 4.988558957
标准蛋白质分子迁移数据表
图2-4电泳标准曲线图
蛋白质分子量对数与迁移率的标准曲线
0.668181818,
0.270454545,4.633468456
0.295454545,4.491361694
0.163636364,4.820857989
0.109090909,4.988558957
y = -1.3971x + 5.0396
R2 = 0.9206
012345
60
0.10.20.30.40.50.6
0.70.8
mR相对迁移率
分子量的对数
由电泳迁移率图得到蛋白质相对分子质量：
组别
分子量的对数
蛋白质分子迁移距离
相对迁移率
蛋白质相对分子质量
A
4.896714773
0.45 0.102272727 78834.22 4.779231364 0.82 0.186363636 60149.41 4.722077273 1 0.227272727 52732.37 4.658572727 1.2 0.272727273 45558.85 4.547439773 1.55 0.352272727 35272.79 4.458533409 1.83 0.415909091 28743.09
4.280720682 2.39 0.543181818 19086.25
B 4.944343182 0.3 0.068181818 87971.74
4.737953409 0.95 0.215909091 5469
5.73
4.706201136 1.05 0.238636364 50839.48
4.560140682 1.51 0.343181818 36319.57
4.242617955 2.51 0.570454545 17483.08
C 4.947518409 0.29 0.065909091 88617.28
4.722077273 1 0.227272727 52732.37
4.525213182 1.62 0.368181818 33512.99
4.261669318 2.45 0.556818182 18267.09
D 4.890364318 0.47 0.106818182 77689.86
4.814158864 0.71 0.161363636 65186.68
4.483935227 1.75 0.397727273 30474.40
表2-11
实际试验图：图2-5
6.4.2分析
(1)、由于R2=0.9206，距离1较远，所以回归不好，不够精确；
（2）、电泳所得结果中A有7种不同分子量，B有5种，C有4种,D有3种，
说明至在提纯提取液D时做的实验不好，没有提纯完全，仍有杂质；
（3）、网上查询的蔗糖酶的相对分子质量为40000左右，而我们的数据中最
为接近的分别是A：35272079；B:36319.57;C:33512.99;D:30474.40;则蔗糖酶
的分子量为33894.94。
6.4.3 结论
电泳迁移率图得到蛋白质相对分子质量。如上表所示。
6.5注意
①N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免
其直接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。
②凝胶模的装配也起到相当重要的作用。保证玻璃板的干净、干燥。
③配置分离胶和浓缩胶时，最后加TEMED。混合后迅速加入玻璃槽中。
④装好浓缩胶后不可预电泳；
⑤电泳时要注意溴酚蓝的电泳距离不可超出分离胶；
6.6认识与体会
（1）加样品时要在电泳开始前加，不可过早；
（2）在A、B、C、D加热时，要把盖子盖紧，防止它爆开；
（3）本实验最好将分离胶与浓缩胶做的更大，电泳更长时间，这样能减小实验误差；
参考文献：
百度文库，百度搜索
浙江工业大学药学院生物化学实验论文 2013 年12 月13日
啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文 摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD 540 计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD 660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。 关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳； 正文： 文献综述 蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5. 实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯 1.1实验原理 酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。 1.2 试剂与器材 1.2.1试剂
酵母蔗糖酶的提取工艺 摘要 蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。 采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS 抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。 比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。 蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。 关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化 Study on Purification of Invertase from Yeast Abstract Sucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms of carbon and energy supplies in microorganism growth and development. This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast. The results of our study were followed: 1、Purification of invertase from yeast The specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%. 2、Properties of sucrase The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min. Key words : yeast;invertase;extraction;purification 第一部分文献综述
生物化学实验示范报告: 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的: 1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离 提纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉 淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶 蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质 的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每3min释放lmg还原糖所需的酶量定义为一个活力单位；通过Folin法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5.离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7. 柱层析装置； 8. 梯度洗脱装置； 9. 部分收集器；10. 电磁搅拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纤维素。
实验3 酵母蔗糖酶的制备 一、实验目的 1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶 2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量 二、实验原理 酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。 三、实验器材 1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。 2、材料：啤酒酵母、 3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。 四、实验步骤 1 研磨水提取 (1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。 (2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。 (3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。 (4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。 (5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。 (6) 将上清液转入量筒，量出体积。用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。 2 热处理和乙醇沉淀 (1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。 (2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
酵母蔗糖酶提取方法的研究 生命科学学院 10级生物科学类李倩 10197022 指导老师：陶芳 摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶提取自溶法 Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose School of Life Sciences，Biological Sciences of grade 2, li Qian, 10197022 Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30 ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification. Key words:yeast；extraction；autolysis method 前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。 按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究 摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。 关键词：蔗糖酶、酶学性质 1前言 蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。 2材料与方法 2.1 材料与设备 2.1.1 实验材料 酵母、活性干酵母、壳聚糖 2.1.2 试剂及配制方法 葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na 2HPO 4 、KH 2 PO 4 、MgSO 4 、NaCl、NaOH、Na 2 CO 3 、盐 酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。 95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml 0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液
土壤蔗糖酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法） 一、原理 蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及 土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生 成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度 与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠 （11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯 2）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天）。 三、操作步骤 （1）标准曲线绘制 分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新 沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色， 以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 （2）土壤蔗糖酶测定
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
酵母蔗糖酶的固定化 实验三酵母蔗糖酶的固定化 一、实验原理 1.固定化酶 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。 2.酶活测定 蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。二、实验材料、仪器和试剂 1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液 2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等 3.试剂
(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。 (2)10%蔗糖溶液 (3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液 (4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至 100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液 三、实验步骤 1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联 (1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。 (2)称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。 1 (3)将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。 注意:为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。 (4)壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。 2.固定化酶的制备 (1)将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。
蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定 摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。 第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到2~3管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。 第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。 第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。 最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。 关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD 正文： 1，蔗糖酶的提取及提纯 1.1，文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体 内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要 破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。 材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系 将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界
论文 论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 作者姓名周柱林 指导教师钟莉 学科专业食品科学与工程1102 所在学院生物与环境工程学院 提交日期 2013年12月
蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究 周柱林 生物与环境工程学院食品科学与工程1102班 摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用Q Sepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660. 关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量 1.前言（文献综述）： 啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β -D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵母中提取。 目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多 , 有SDS抽提法，正交法等等，其中以甲苯自溶法最为常见。本实验采用此自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，利用有机溶剂将胞内蔗糖酶释放，经过初提取的离心去杂和等电位沉淀，制得的粗酶经醇沉后，采用Q Sepharose-柱层析法纯化，利用DNS法测定其酶活力，利用Folin-酚法测定蛋白质的含量及比活力，利用微量凯氏定氮法测总蛋白氮，以及用SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究，也为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的技术开发提供了实验依据。
对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究 兰德新（同组：李建鑫） 浙江工业大学海洋学院食工1201 摘要： 目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。 关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE 文献综述: 蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。 而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性
大实验酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质作初步的研究。 一．实验原理及相关知识 （1）蔗糖酶的介绍 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的 —呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。 （2）。实验原理： 本实验提取面包酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖）的量或旋光法来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有以下分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师：杨劲树 同组学生姓名： 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得 二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析 一、实验目的和要求 1. 掌握蔗糖酶的提取纯化的操作方法。 2. 熟悉有关生化技术的基本操作。 二、实验内容和原理 1、酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 2、蔗糖酶的初步分离纯化 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。 三、实验材料和主要仪器 1、实验材料： 市售干酵母粉 2、实验试剂： ⑴ 石英砂 ⑵ 95%乙醇(-20℃） ⑶ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液 3、实验仪器 （1）电子天平（称量样品） （2）研砵（每组一套） （3）50ml 高速离心管（4支/组、离心管架1个/组） （4）托盘天平（离心管平衡用） （5）高速冷冻离心机 （6）恒温水浴箱（50℃） （7）制冰机 （8）1.5ml 离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 （9）－20℃冰箱
实验名称：_ __________________姓名： 学号： 四、实验方法和步骤 1、酵母细胞破碎 称取市售干酵母粉10g ，约3g 石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml 的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I ）,另留1ml 上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE 分析。 2、热处理 将上一步抽提液（样品I ），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml 离心管中，平衡后， 4℃，15000r/min 离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml 上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE 分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀： 上清液（样品Ⅱ）加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml 离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min 离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验。 五、实验数据记录和处理 V1=35.0ml V2=30.0ml 六、实验结果和分析 V1=35.0ml V2=30.0ml 七、实验讨论和心得 酶作为一种蛋白质，在发挥其生物功能需要保持适当的高级结构。如果提取工作在温度较高的环境中进行，那么过高的温度有可能会不可逆的改变、破坏这种高级结构，导致酶失活；其次，蛋白质在高温下易于降解，保持冰浴能够最大限度的降低蛋白降解的速率。所以酶液的提取要在冰浴中进行。 另外，实验操作过程中应小心注意，切勿打翻样品液。因为这个实验是之后一系列实验的基础，所以，提取的蔗糖酶的质量决定着后面实验的质量。 装 订 线 P.2
综合性实验 2 酵母蔗糖酶浓度及酶活力测 定
（一）实验目的
学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用 3.5－二硝基水杨酸法测定酶活力。掌握 各步骤的实验原理和方法。
（二）实验原理
本实验采用 Bradford 法[10]又称考马斯亮蓝染色法(Coomassie brilliant blue staining)测定
蛋白浓度，属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具
有高敏感性。考马斯亮蓝有 G250 和 R250 两种。其中考马斯亮蓝 G250 由于与蛋白质的结
合反应十分迅速，常用作蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝 R250 与蛋白质反应虽然比较缓慢，
但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝 G250 的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在 OD465nm。当它与蛋白质结合形 成复合物时呈蓝色，蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为 OD595nm，其光吸收值与蛋白质含 量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝 G250 结合在 2min 左右的
时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳定。该法试剂配制简单，
操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry 法高近 4 倍，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合
物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，在 10~100μg/mL 蛋白质浓度范围内成
正比。因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围
内。
本实验采用 DNS 法[11]测定，属于染料结合法的一种。还原糖的测定是糖定量测定的基
本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还
原糖，其中蔗糖（双糖）和淀粉（多糖）是非还原糖。
蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的 1,2-糖苷键裂解，释放出等量的 D-葡萄糖和 D-果糖[12]。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5
－二硝基水杨酸被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸（图 1）。在一定范围内，还原糖的
量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，可利用分光光度计进行比色测定，查对标准曲线，
求得样品中的含糖量。
O2N
COOH OH
+ 还原糖
NO2
加热 碱性
COOH OH
O2N
NH2
酵母中蔗糖酶的制备及活力测定 一、目的要求 1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。 2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）测定酶活力的原理和方法。 3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。 二、实验原理 蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。 酶活力单位的定义：在一定条件下，反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位（U）。 三、仪器与试剂 1. 仪器 研钵，天平，离心机，721型分光光度计，恒温水浴，具塞试管25ml，沸水浴，移液器（1000ul、200 ul） 2. 试剂 市售酵母干粉，石英砂，丙酮（预冷）, 1mg/ml葡萄糖溶液，pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液。 四、实验方法 1. 蔗糖酶制备 称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中，加适量蒸馏水，用力研磨30分钟成糊状，再加蒸馏水100ml，搅匀，6层纱布过滤，滤液加2倍体积冷丙酮搅匀，静置5分钟，离心管中，平衡后3000 rpm离心10 min，弃上清取沉淀。沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。沉淀真空干燥后称重。再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟，用蒸馏水定容至40m l作为酶应用液备用。 2. 蔗糖酶活力测定 （1）制作葡萄糖标准曲线 取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。按表1操作。