真菌的常规检验法 实验室检查： ?标本采集分离培养 ?直接镜检生化反应 ?染色镜检免疫学试验 一、临床标本的采集 ?1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。 2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。 ?3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。 4．脓汁及渗出物。 二、检验方法 （一）标本直接检查法
不染色标本检查 染色标本检查 （二）培养检查 （三）鉴定 ①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 ②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。 微生物学检查步骤： 取患部标本
（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化 →镜检（观察菌丝和孢子） 直接镜检的意义 ①有诊断意义，如浅部真菌病等； ②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等； ③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。 直接镜检的局限性： ①阴性结果不能排除真菌感染； ②有假阳性结果。 因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。 2. 染色标本检查 ?（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。 ?（2）乳酸酚棉蓝染色
?（3）糖原染色： ?又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。为真菌染色最常用的方法之一。 ?（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色 ?（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 ?（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。 （二）培养检查法 ?本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。 ①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大； ③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
分离培养：无菌采取病料接种马铃薯琼脂培养基中，置37℃恒温箱中培养24小时，长成绒毛样菌丝，未见其它细菌生长。经48小时培养长成白色菌落。72小时菌落呈纽扣状，由中心向外周逐渐变深，转变成灰白色、灰绿色。取培养物镜检可见大量球形的分生孢子。 通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部通常人们把真菌和霉菌认为是一种病原的两种说法。真正真菌包括霉菌，霉菌只是众多真菌中的一种。真菌是由单细胞或多细胞组成，按有性或无性方式进行繁殖的真核细胞类微生物。根据其侵犯人体的部位分为前部真菌和深部真菌，包括皮肤癣菌、孢子丝菌、念珠菌、曲霉菌、隐球菌、组织胞浆菌等。而霉菌多为细胞真菌的一种，也为深部感染真菌，包括烟曲菌、黄曲菌、黑曲菌、土曲菌等，常发生于免疫力低下的患者，引起全身播散性感然，影响预后。 培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO),其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长,而CAO则适合于高渗性霉菌生长,酵母菌几乎不长。在日常检测中我们发现,有些常见的耐高渗性霉菌,如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长,而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方:蔗糖400g,麦芽提取汁20g,酵母提取汁5g,琼脂20g,氯霉素50mg,蒸馏水1000ml;DG18琼脂配方:葡萄糖10g,蛋白胨5g,KH2PO41g,MgSO4·7H2O 0.5g,氯霉素0.1g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH6.5)上则正常生长,孢子、形态特征发育良好,而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长,因此,若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌,将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等,更有必要同时采用M40Y或DG18。 由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素,危害较小,而有的菌株即使污染数量不多,但其产生的霉菌毒素却危害较大,因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度,重要的是要知道污染菌的菌相,才能更好地判断被污染食品的安全程度。为此,国外有些研究者设计出各类选择性培养基,可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方:酵母提取汁20g,蛋白胨10g,柠檬酸铁铵0.5g,0.2%二氯硝基苯胺1.0mL,琼脂15g,蒸馏水1000mL,PH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落,非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。 2接种方式 接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国际方法中采用倾注法,但近来国际上有不少学者认为霉菌计数采用涂布法更合适。Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大
真菌细菌大不同，全面解读真菌的实验室检查 真菌为自然界中存在的微生物，单细胞酵母样或者分枝丝状。环境中有5000多种的真菌，但与人类疾病有关的不到200种，常见导致感染的仅20到25种。 真菌感染常由一种或几种真菌侵入组织造成，可导致浅部皮肤感染或严重的深部组织感染，血、肺部或全身感染。 浅部真菌感染较常见，可导致指甲感染或者发痒红斑的皮肤感染，如众所周知的“脚癣”、皮肤发痒、皮肤癣，或酵母菌感染导致的口腔中的白斑（鹅口疮），或阴道发痒及分泌物增多。根据疾病预防和控制中心（CDC）报道，大约75%的女性一生中至少有一次真菌感染。 少见情况下，真菌可以从它们最初所在的位置蔓延到或侵入到深部组织，可侵犯机体的任意器官，可能导致严重的肺部感染、败血症或全身性感染。典型的真菌肺部感染通常是由于吸入微小的真菌孢子导致。任何人群都有可能得严重的肺部或全身性真菌感染，但是大多数感染只表现为轻微到中度的流感样的症状。但是免疫缺陷的患者，如HIV/AIDS、器官移植术后，和有基础疾病如糖尿病、肺部疾病等的患者发生严重肺部真菌感染、全身性感染或反复感染的危险性较高。 真菌检查试验可检测和鉴定真菌，以协助诊断感染并指导治疗。经典的真菌检查试验包括标本涂片显微镜检查，有时用前处理或者染色来帮助检查真菌。镜检可以为真菌感染的诊断提供充分的依据，若为浅部感染，就不需要进行进一步的试验了。但对于持久的、深部的或全身性的等需要明确诊断的感染，还需要进行其它检测，如培养、敏感性试验、抗原和/或抗体试验。 真菌感染VS细菌感染
真菌感染常常需要与其他微生物引起的感染相区分，如细菌感染。某些感染病例，真菌和细菌都存在。需要一些试验来进行鉴别诊断： 革兰染色 - 用显微镜检测标本中的细菌和/或真菌的一种快速试验 细菌培养 - 用于排除细菌感染或确定是否合并有细菌感染 抗酸杆菌涂片和培养–怀疑分枝杆菌感染如结核病 血培养–怀疑为菌血症 真菌在潮湿的环境中生长旺盛，如公共游泳池和体育馆的储物柜，有汗的鞋子、紧身衣服和皮肤皱褶里。可以通过穿拖鞋或凉鞋以减少直接暴露，勤换袜子，烘干鞋子，保持身体易潮湿的部位干燥清洁等来减少皮肤真菌感染的机会。 测试样本如何采集？ 根据所怀疑的感染部位来采集标本。对于浅部感染，可采取皮肤刮屑、剪下或削下的指甲或头发，用无菌拭子采取阴道分泌物，或者尿标本。对于深部组织、器官或全身性感染，可采取静脉血液标本、来自肺部的痰标本、和/或活检组织标本。若怀疑脑膜炎，可采取脑脊液标本。 有何用途？ 真菌检查试验用于检测和诊断真菌感染、协助指导治疗、有时也可用于监测治疗效果。对多数浅部皮肤感染和酵母菌感染，根据临床检查和标本显微镜检查即可诊断是否存在真菌感染，通常不要求把微生物鉴定到种。医生根据实习指南和他的经验进行局部或者口服抗真菌药物治疗。 真菌培养可用于鉴定侵入深部组织的、感染肺部的、或系统性感染的持久真菌感染中的真菌。许多真菌生长缓慢。特殊营养琼脂能特异性的抑制细菌生长，但必
浅谈常见病原性真菌感染及实验室检查方法 发表时间：2019-08-14T13:28:12.163Z 来源：《健康世界》2019年7期作者：王祥 [导读] 真菌是一类具有完整细胞结构和内含物（如典型的细胞核和完整的细胞器），不含叶绿素，没有根、茎、叶的真核细胞型微生物。王祥 达州市宣汉县第三人民医院 636150 真菌是一类具有完整细胞结构和内含物（如典型的细胞核和完整的细胞器），不含叶绿素，没有根、茎、叶的真核细胞型微生物。真菌在自然界中种类繁多，分布广泛。多数真菌对人体无害，甚至有利，如食用、发酵、酿酒及生产抗生素等，仅有少数真菌可引起人类感染性、中毒性及变态性疾病，特别是本来属于人体正常菌群的某些真菌，当机体免疫力低下或长期使用免疫抑制剂、广谱抗生素、激素及化、放疗药物时，导致真菌机会性感染的几率明显增加。真菌感染严重时，可累及全身组织器官，在ICU重症患者、气管插管患者、全静脉营养患者、白血病或其他恶性肿瘤患者的治疗过程中，真菌是医院感染病例中的重要病原菌。由于真菌感染具有治愈率低、治疗周期长、死亡率高等特点，因此越来越受到临床医生的关注和重视。 在真菌的分类方面，临床多根据真菌侵袭肌肤组织程度的不同而分为肌肤浅表感染性真菌和深部感染性真菌。深部感染性真菌主要包括白假丝酵母菌又称白色念珠菌、曲霉菌、隐球菌、耶氏肺孢子菌、马尔尼菲青霉、毛霉目真菌、组织胞浆菌病及镰刀菌8个菌属，主要侵犯人体深部组织、粘膜及脏器，引起深部真菌感染，甚至全身播散性感染。其中以白色念珠菌感染最为常见，当各种原因导致机体菌群失调或抵抗力降低时，可侵犯人体组织器官，引起多部位的念珠菌机会性感染，常见的有女性外阴炎、念珠菌性阴道炎，男性包皮炎、念珠菌性龟头炎、膀胱炎、肺炎、肠炎、心内膜炎、肾盂肾炎及婴幼儿体质虚弱时易患的鹅口疮口角糜烂等，白色念珠菌侵犯中枢神经系统时，还可引起脑膜脑炎、脑膜炎、脑脓肿等。 肌肤浅表感染性真菌主要包括皮肤癣菌、暗色真菌、角层癣菌及孢子丝菌4个菌属。皮肤癣菌有称之为皮肤丝状菌，主要侵犯人体和动物的皮肤、毛发及指（趾）甲，一般不侵犯皮下等深部组织及内脏，常可引起手癣、头癣、甲癣及足癣等多种皮肤癣病；暗色真菌常在患者外伤后感染，高发于四肢暴露部位，暗色真菌感染可引起丘疹、红斑等多种皮损，继发感染时，皮损结痂、反复发作，感染经久不愈，严重时可引起象皮肿，甚至致畸、致残或癌变，机体免疫功能低下时可侵犯中枢神经系统或经血流扩散，对机体造成严重损害；角层癣菌主要寄居于人体毛发、皮肤的最表层，很少引起宿主细胞的炎症反应或较轻微的炎症反应；孢子丝菌感染可导致皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统发生慢性感染，引起孢子丝菌病。 感染性真菌的病原学检查是确证真菌感染的重要措施，实验室检查方法有直接镜检、染色镜检、真菌分离培养、组织病理学检查、免疫血清学检查及分子生物学检查等，其中直接镜检和分离培养是真菌病原学检查中最为常见的两种检查手段。 直接镜检是临床真菌检验最快捷、有效的常用方法。10%KOH溶液（可促进角质蛋白的溶解及杀菌作用）涂片镜检，主要适用于毛发、指甲、鳞屑等致密的难以透明的材料检查，显微镜下查见特征性菌丝及孢子体，是初步诊断皮肤癣菌感染的重要依据；用生理盐水替代KOH溶液涂片镜检，可观察真菌的出芽现象，也可用于尿液、胆汁及粪便标本的直接镜检查；无颗粒或杂质的优质墨汁（如印度墨汁）涂片镜检，主要用于新生隐球菌等有荚膜真菌的检查；水合氯醛-石碳酸-乳酸溶液的穿透力较强，仅限于不透明标本的检查。 染色标本镜检具有能够更清楚观察到真菌形态和结构的优点，有助于提高标本阳性检出率。革兰染色是最为常用的染色方法，革兰染色后各种真菌均呈深紫色，常用于假丝酵母菌、孢子丝菌、组织胞浆菌及酵母菌等染色；乳酸酚棉蓝染色适用于各种真菌的培养物涂片检查、直接涂片检查及小培养标本等，该法染色后，真菌呈现蓝色；糖原染色是真菌染色最常用的方法之一，又称过碘酸Schiff染色（简称PAS或PASH），PAS染色后的真菌菌体为红色，细胞核为蓝色，背景为淡绿色，可用于标本直接涂片及组织病理切片的染色检查；嗜银染色（GMS）的原理与糖原染色原理相似，主要区别在于嗜银染色是用铬酸代替过碘酸，GMS染色后真菌呈现黑色，菌丝呈现旧玫瑰红色，背景为淡绿色，可用于组织病理切片检查和标本直接涂片；黏蛋白卡红染色（MCS）主要适用于新生隐球菌的荚膜染色，MCS染色后细胞壁和荚膜呈红色，细胞核为黑色，背景为黄色；荧光染色法是利用荧光染液对直接涂片、培养涂片及组织切片标本染色后，借助荧光显微镜观察荧光反应结果，其区别在于直接涂片标本阳性只表示有真菌存在，不能确定菌种，而培养涂片和组织切片标本则可以根据荧光反应颜色的不同而确定菌种，如白假丝酵母菌为黄绿色，新生隐球菌为红色等。 分离培养检查法是根据绝大多数真菌可以人工培养的特性和真菌对营养要求的差异及培养目的性不同，选择不同的常用培养基（如沙保培养基、马铃薯葡萄糖琼脂及尿素琼脂等）接种培养出真菌，从而为真菌的鉴定及临床确定诊断提供重要依据。 组织病理检查是将疑似真菌感染组织经封蜡、切片、脱水、染色及镜检等一系列复杂过程，观察机体器官、组织中是否存在真菌感染的病理形态学改变或特征，能为病原性真菌感染提供确切的诊断依据。免疫血清学检查主要利用生化、免疫学手段检测真菌的抗原抗体及代谢产物，目前常通过糖（醇）如葡萄糖、甘露醇等发酵试验，免疫学手段检测隐球菌荚膜多糖抗原、Cand-Tec抗原等，可用于多种真菌的鉴别。分子生物学检查方法的原理是借助靶基因（即适当的特异性基因片段），利用PCR扩增技术扩增痰液、血清（浆）、尿液、脓液、支气管肺泡灌洗液等中的真菌成分，从而确定病原性真菌的有无及种类的一种检查方法。 随着现代医疗水平的提高和真菌感染研究的不断深入，将会促使我们对病原性真菌及感染有更多、更新的认知和掌握，相信会有更多先进、快捷的检查方法不断成熟、完善和应用，为病原性真菌感染疾病的早期诊断、治疗提供更加科学、有效的辅助依据。
声明 本产品属精密光学仪器，在日常使用中，应严格按照我公司出具的操作流程进行试验操作，并确保工作环境正常。本试验的操作者必须为经我公司培训合格的微生物实验室检验人员，如需更换操作者，请做好交接工作，确保新的操作者了解仪器特性、熟悉操作流程。为避免试验结果不准确，请操作者认真阅读操作注意事项及操作流程，并严格遵守。如有任何疑问，请联系我公司售后服务部。 售后服务部电话：400-811-9958 北京金山川科技发展有限公司
真菌（1-3）-β-D葡聚糖测定 1.目的 建立真菌（1-3）-β-D葡聚糖检测标准操作规范，保证实验结果的准确性。 2.授权操作人 经培训合格的微生物实验室检验人员。 3.实验原理 （1-3）-β-D葡聚糖检测原理：真菌（1-3）-β-D葡聚糖激活酶反应主剂中的G因子后形成凝固蛋白，根据其所引起的浊度变化对真菌（1-3）-β-D葡聚糖浓度进行定量测定。 （1-3） -D-Glucan 活化因子G 因子G 凝固酶原凝固酶 凝固蛋白原凝固蛋白（凝胶） 4．产品性能指标 4.1 灵敏度最小检出值5pg/ml 5．实验组成 5.1实验仪器及器具： MB-80微生物快速动态检测系统、洁净工作台、低速离心机、恒温仪， 20~200ul 加样器、100~1000ul加样器、旋涡混合器、定时器。 5.2实验耗材： 200ul无热原吸头、1000ul无热原吸头、无热原平底试管、无热原真空采血管。 5.3试剂盒组成： 真菌（1-3）-β-D 葡聚糖检测试剂盒（光度法）： 试剂盒包括反应主剂和样品处理液。 6．工作环境 相对湿度：20%~80%；温度控制：10~30℃；电源电压：220V±10%，50Hz±2%。 7．标本采集、处理及保存 7.1检测样本： 血液、肺泡盥洗液、胸腔积液、腹水、脑脊液、尿液（无菌取中段尿或穿刺尿） 7.2采集要求： 采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采血管（肝素类抗凝）。 常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患者透析前采血）。
真菌鉴定操作常规 一.标本的采集和处理 1. 皮肤、指甲、毛发和组织 在收集标本前用75%酒精消毒病变部位。如果损害处已用了软膏、冷霜或粉剂应事先清洁。取材应用钝手术刀刮取表皮皮屑，或用透明胶带粘取皮屑直接移至载玻片上，水疱取疱壁组织，脓疱则取脓液。皮肤粘膜交界处或菲薄的皮肤部位如龟头、大阴唇、口周、肛周等处以浸有生理盐水的湿棉拭子，檫拭局部后送检。 指甲标本应取变色、萎缩或变脆的部位，以钝手术刀刮除表层，采集病甲边缘下病甲置载玻片上，滴封固液，微加热，使甲溶解。 毛发标本应取无光泽、脆而松动，根部折断的毛发。毛发置载玻片滴加10%KOH溶液，微加热使角质溶解。 组织取病变部位，置无菌生理盐水中送检。以无菌镊子和剪刀剪碎后进行培养或镜检，避免使用组织研磨器对真菌菌丝的折断及机械性损害 皮肤、指甲、毛发和组织标本一般采用直接镜检。 2．眼、耳部标本 怀疑真菌性角膜炎时，应在手术显微镜下以眼科小匙刮取溃疡的基底和边缘部位。怀疑真菌性内眼炎时，应尽可能收集玻璃体液。结膜标本可用消毒生理盐水浸湿的棉拭子拭取。 耳部标本应从耳道中刮屑取材，也可采用拭子取材。 3．脑脊液标本 取3-5ml经腰穿获取的脑脊液标本至无菌管内立即送检。将标本2500rpm离心15分钟，上清液可用于血清学实验，沉淀部分用于培养和涂片镜检。 4．血液、骨髓标本 抽取5－10 毫升血液或骨髓注入需氧菌血培养瓶中，尽快送检。如血培养仪器报告阳性，及时取样接种于沙氏培养基并涂片革兰染色镜检，如发现真菌孢子电话报告病房并登记。 5．体液（包括胸腔、腹腔及关节腔积液）： 将无菌抽取胸水、腹水和关节腔液及时送检。标本放无菌离心管中，2500rpm离心10分钟，取沉渣培养或涂片镜检。 6．尿液 将清洗外阴后留取的中段尿，或经导尿管导出的中段尿，或经皮膀胱穿刺尿立即送检。尿标本应先2500rpm离心10分钟，取沉淀部分进行培养及涂片镜检。 7．阴道分泌物或男性尿道标本 女性由妇科医师用窥器取阴道或宫颈的伪膜或豆渣样凝块。男性则以尿道拭子伸入尿道2.5cm处旋转取出尽可能多的尿道脱落细胞及分泌物，立即送检。 8．呼吸道标本（咳出痰、诱导痰、气管吸痰、支气管肺泡灌洗液、肺组织） 取清晨新鲜咳出的痰，如病人不能咳痰，可用支气管盐水诱导咳痰，插管病人采用气管吸出痰，必要时在纤维支气管镜检的同时获取支气管肺泡灌洗液或支气管毛刷标本。对于局灶性肺部病变，高度怀疑肺部真菌感染的患者可经皮穿刺，在影像学指导下获取病变部位的肺组织。 9．脓液或溃疡、窦道、瘘管等标本 用75%酒精消毒病变部位后刮取脓液，窦道壁及周围尽可能深的部位，若脓肿未破，应以无菌注射器抽出脓液送检。注意寻找并收集脓液中或窦道开口部位的颗粒送检。 10．大便 留取新鲜大便，尽快送检。 收到标本后，应根据申请项目将检验信息录入计算机并获取检验号记录在申请单上 二、真菌的显微镜检查： 1．直接检查： 将待检标本（皮肤、甲屑、毛发或组织）置载玻片上，加一滴载液（根据不同需要选用相应载液），盖上盖玻片，放置片刻或在火焰上快速通过2-3次（不可煮沸），轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用吸纸吸去周围溢液，置显微镜下镜检。检查时先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察菌丝和孢子的形态、特征、位置、大小和排列。结果报告依据镜下情况报：“找到真菌孢子” 或者“找到真菌菌丝”或者“找到真菌菌丝及孢子”。如未找到真菌孢子及菌丝报告“未找到真菌”。 注意：毛发标本不可过度施压以免破坏毛发的结构而影响对菌丝孢子与毛干相对位置关系的判断。 载液：
深部真菌感染实验室检验方法的比较 一、深部真菌感染的现状及其定义及引起深部真菌感染的因素 真菌与人类有着极为密切的关系，据统计自然界中真菌至少包括50，000种，但是与人类疾病密切相关的真菌种类仅几十种[1]。近年来,真菌感染尤其是深部真菌感染率呈逐年上升趋势[2]，深部真菌感染就是指由致病性真菌所引起的人体深部感染，如侵及到皮肤深层如内脏，如肺、粘膜、肌肉、脑、消化道等器官，危害性较大，已越来越严重地威胁着危重患者的健康与生命，成为住院患者感染及死亡的主要原因之一[3]。.据报道，在美国医院内菌血症／败血症病例中，真菌感染在血流感染常见致病菌中居第三或第四位，真菌感染可明显增加病人死亡率和住院率[4]。.由于深部真菌感染的早期诊断困难，治疗药物有限，感染所致病死率仍高达40％[5].因此深部真菌的诊断尤其是快速诊断日益受到临床的重视。深部真菌感染的危害已越来越突出。目前深部真菌感染已成为免疫功能低下患者发病和死亡的主要原因[6]。引起深部真菌常见的致病菌主有念珠菌、隐球菌、曲菌、毛霉菌及放线菌等[7]我们知道，真菌在人体中,与细菌之间起着重要的微生态平衡作用。近年来,随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用,器官移植、导管插管等普遍开展,深部真菌感染率越来越高。诱发深部真菌感染的因素主要有以下几个方面：1、慢性消耗性疾病，如恶性肿瘤、糖尿病和尿毒症等，可使机体免疫功能和抵抗力降低。2、长期使用广谱抗生素，敏感的细菌被抑制，消除了正常菌群中与真菌相拮抗的细菌，使真菌得以大量繁殖。3、肾上腺皮质激素破坏淋巴细胞，使抗体形成减少。4、大剂量X线照射、抗肿瘤药物和免疫抑制剂都能抑制骨髓，使中性粒细胞和巨噬细胞减少，机体的免疫功能和抵抗力降低。5、侵入性检查和治疗（如长时间静脉插管，留置导尿管和大手术）可引起局部损伤，成为真菌侵入的门户，在机体抵抗力低落时在体内繁殖致病。 二、深部真菌感染的危害性及临床预后 据统计，近30年深部真菌感染的发病率增加了3-5倍，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一[6]。据美国115家医院真菌感染调查显示2004年真菌感染率为1993年的近4.6倍[8]；在国内2003年北京协和医院深部真菌感染发生率为20世纪90年代的3.6倍。[9]， 深部真菌感染病主要包括深部皮肤真菌病，烧伤真菌病，妇科真菌病、恶性血液病患者的真菌的感染，肺部的真菌感染，外科的真菌感染，老年性真菌病，免疫缺陷患者与真菌感染，消化系统的真菌感染，骨髓移植患者的真菌感染，AIDS与真菌感染等。大量的文献报道表明，严重大面积烧伤患者，由于多次创伤和打击，病程冗长，体质严重耗竭，机体抵抗力下降，往往引起深部真菌感染，从而出现严重后果。据报道，近年烧伤真菌检出率有上升趋势，烧伤病人真菌感染死亡率可达47.4%［10］。在医院的ICU病房中，真菌的感染死亡率最高 [11 ,12]。据吴铁军等报道[13]在ICU病房中，肺部真菌感染后死亡率高达39%上述结果表明真菌已经成为医院感染的主要致病菌之一，是住院病人死亡的主要原因之一，因此要十分重视真菌感染的监测。深部真菌感染发病率高、病情进展快，死亡率高、治疗费用昂贵、临床诊断困难、容易产生耐药等，传统的诊断方法主要有培养、病理切片等方法。但培养耗时长、阳性率低、标本容易受到污染。如痰培养容易受到上呼吸道寄生真菌及空气中的真菌的污染影响培养结果。组织病理很难被病人接受因而在临床工作中开展比较困难。面对持续高烧、抗生素治疗无效的病人，因缺乏快速的客观的实验室诊断依据，贻误治疗。很多医生采用经验性抗真菌治疗，但由于缺少有力的实验室证据、抗真菌药物昂贵等病人家属很难理解，容易激化医患矛盾。目前急需一种能够早期快速诊断深部真菌感染的方法。正是由于诸多的原因及深部真菌感染对患者造成的严重危害程度，对于真菌特别是深部真菌的快速检验愈来愈受到临床医生的重视。 三、实验室检验真菌的常见方法
微生物实验室真菌检查质量控制流程 一、目的 规范微生物实验室管理程序，确保临床报告的质量。 二、适用范围 微生物实验室的各类真菌检测。 三、职责 实验室检验人员均必须熟知并遵守本程序。 四、程序 (一)临床样本的采集与处理 1.皮屑边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH 涂片。 2.甲屑用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，作KOH涂片。 3.毛发取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5 根作直接镜检。 4.脓液无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作革兰染色，常规的KOH涂片。 5.CSF 采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉 淀物1ml，作墨汁涂片镜检。 6.血液无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d 出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。
7.体液、痰液、尿液、粪便①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨 痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养（SDA每管种0.5ml）。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭。 采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养（加抗生素）注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。 8.组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm的小块， KOH涂片培养。 (二)涂片染色和直接镜检的质控 1.氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加 热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。 2.胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带 在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。 革兰染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择革兰染色方法，染色后，以油镜观察。 3.染液的质量控制 （1）革兰染液每次新配置和使用中每周一次进行质控，并进行记录。 （2）氢氧化钾/复方氢氧化钾每周进行一次质控。 (三)真菌鉴定质量保证 1.对酵母样真菌如念珠菌或隐球菌在常规临床细菌室已有较成熟的方法学，可用显色培养基。 2.常规鉴定丝状真菌主要依赖于其生长过程中形态变化和特点，所以要求从事丝状真菌检测的检验
真菌标本检验标准操作规程 1.目的 规范真菌标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。 2. 适用范围 各类真菌检测的标本。 3. 标本采集及处理 3.1 标本类型痰、尿、粪、脓液、脑脊液、血、拭子、皮屑、甲屑、气管穿刺抽取的痰液等。 3.2 标本采集与处理 3.2.1 痰液、气管穿刺抽取的痰液。 3.2.2 尿液早晨中段尿10ml，离心取沉淀液1ml，作真菌涂片及培养。 3.2.3 口腔、咽喉、外耳道、阴道、和直肠粘膜的标本应迅速放入内装1-2ml无菌蒸馏水的试管送检。常规KOH 涂片及SDA培养。 3.2.4 粪便无菌盒送检，挑取黏液、脓血接种于含氯霉素培养基上。 3.2.5 脓液脓液标本应置无菌广口有盖玻璃瓶或小的无菌平皿中，立即送检。 3.2.6 脑脊液采集于无菌试管3-5ml，立刻送检。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养
（SDA）25°C及37°一周。 3.2.7 血液分别于左右两侧无菌抽血3-5ml，立即置于脑心浸出液肉汤。 3.2.8 体液支气管积液、关节腔积液、心包积液、腹水等10ml离心沉淀后取0.5ml沉淀液作直接镜检(注意颗粒)及培养。 3.2.9 组织标本置于无菌平皿中立即送检，置无菌研钵或组织匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或切成1-2mm3的小块作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。 3.2.10 皮屑皮损的边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑。取材前75%酒精棉球消毒取材处，标本作真菌直接镜检（KOH涂片）及培养。 3.2.11 甲屑用细锉或牙签研磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后以十点接种法分别种于含放线菌酮及不含放线菌酮的SDA平皿，25°C-28°C培养3周，并同时作KOH涂片。 3.2.12 毛发取病发15根、75%酒精消毒，3-5根作直接镜检，5-10根种于SDA斜面（加氯霉素），稍划破斜面掩埋。 3.3 标本拒收标准及处理参见《标本拒收程序》 4.试剂、培养基及仪器 4.1 接种针、电热灼烧器、显微镜、恒温培养箱、冰箱、全排式生物安全柜等。
深部真菌感染血清真菌成分检测方法研究进展 1.1病例选择深部真菌感染患者35例，年 真菌在人体中，与细菌之间起着重要的生态平衡作用。近年来，随着抗生素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用，器官移植、导管插管普遍开展，深部真菌感染率越来越高。据统计，近30年深部真菌感染的发病率增加了3-5倍，真菌感染为艾滋病的重要死亡原因之一。引起深部真菌感染的病原菌主要有白色念珠菌、曲菌和隐球菌等。传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养历时太长，且阳性率较低，而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏曲型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限。近年来，用于检则真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查已用于深部真菌感染的实验室检测，并已成为这一领域研究的热点。目前的血清学检查主要针对真菌胞壁或胞内成分——烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露糖和Cand-Tec抗原等。 烯醇化酶 烯醇化酶又称2-磷酸-D甘油盐水解酶，是糖酵解所必需的胞内酶，能催化磷酸甘油盐向磷酸烯醇式丙酮盐转变，同时也在糖异生过程中催化逆向反应。烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富且高度保守。它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，近年来已被分离纯化。研究显示只有在深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在浅表部位的白色念珠菌一般不会释放该酶。Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标本中的白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活检和血培养加以对照。在组织活检或血培养中阳性的24例肿瘤患者中，抗原阳性18例，146例组织活检或血培养阴性的肿瘤患者中中，抗原阳性6例。敏感性和特异性分别为75%和96%。另外烯醇化酶在体内具有很强的抗原性，导致其在体内清除较快，数量减少，及抗折色念珠菌烯醇化酶抗体与其它念珠菌烯醇化酶有较弱的交叉反应，均可导致烯醇化酶在体内不能检出。Z?ller等在免疫健全和免疫缺陷的混合人群占以血清中是否含有抗烯醇化酶抗体来诊断深部念珠菌病，其特异性和敏感性分别为96.4%和81.5%。我们可通过监测患者血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度的动态变化来提高烯醇化酶抗体检出率及临床应用价值。 2 Beta-葡聚糖
常见皮肤科 实验室检查技术操作常规 一．真菌（癣菌）直接镜检 【方法】 1．取材部位：临床医师采取头癣，体癣，股癣，足癣，甲癣标本。 2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴5-10%KOH，加盖玻片，在酒精灯火焰上过三次以消化角质蛋白，普通光学显微镜下检查。 【结果判断】 可见真菌菌丝和/或孢子，可判断为阳性。 二．疥螨虫镜检 【方法】 1．取材部位：临床医师采取标本。 2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴5-10%KOH（或加NS），加盖玻片，在酒精灯火焰上过三次以消化角质蛋白，普通光学显微镜下检查。 【结果判断】 见到以下任何一项均可判断为阳性。 1．成虫：低倍镜下看到完整或破碎的成虫。如用NS，有可能发现活动的成虫。 2．虫卵：可以见到虫体的同时见到成堆或散在的虫卵。 三．阴虱检查 【方法】 1．取材部位：临床医师夹取标本。 2．操作方法：将标本置于载玻片上，加一滴NS，加盖玻片，普通光学显微镜下检查。 【结果判断】 见到以下任何一项均可判断为阳性。 1．成虫：低倍镜下看到完整或破碎的成虫。如用NS，有可能发现活动的成虫。 2．虫卵：可以见到虫体的同时见到成堆或散在的虫卵。 四．毛囊虫（蠕螨）的检查 【方法】 临床医师采取，在扩张的毛囊口挤压出一点皮脂或用刀片刮出些皮脂，在载玻片加一滴
液体石蜡或甘油，加盖片轻压使皮脂变薄，普通光学显微镜下检查。 【结果判断】 低倍镜下发现活的毛囊虫，可判断为阳性。 五、淋球菌检查 （一）淋球菌直接镜检 【方法】 1．男性患者：先用NS拭尽尿道口，手指挤出尿道内脓液，用无菌棉拭子沾取脓液涂在载物玻片上。 2．女性患者取宫颈口脓液，用无菌棉拭子沾取脓液涂在载物玻片上。 3．自然干燥后，革兰染色或美兰染色待检。 【结果判断】 涂片中见大量多形核白细胞，细胞内有革兰氏阴性球菌，呈卵圆形或圆形，成对排列。为阳性结果。 （二）淋球菌培养 【方法】 临床取材后，立即接种于培养基中，不得冷藏后再接种。在5-10% CO2，37度培养24-48小时后观察结果。（市场上可见试剂盒） 【结果判断】 在血平皿可见圆形，平滑，透明或灰白色菌落，直径0.5-1.0mm，革兰氏染色阴性。必要时，做生化检查确定菌种。 六、衣原体检查 （一）免疫荧光法 【方法】 取材方法：男性患者用白金耳或特制尿道棉拭子插入尿道口内2-4cm，转动1周，停留约10秒钟后取出分泌物；女性患者经窥阴器暴露宫颈，用无菌拭子蘸去宫颈表面分泌物，用另外一个干净拭子伸入宫颈口内1-2cm，转动1周，停留10秒钟后取出分泌物。 取材后用试子头部在载玻片上涂片，无水乙醇室温固定15分钟，室温晾干，加荧光标记的衣原体单克隆抗体，37℃温育30分钟后磷酸盐缓冲液洗涤次。封片后在荧光显微镜下观察结果。 【结果判断】 阳性标本可以见到亮绿色包涵体。敏感性可达70-90%。
侵袭性真菌病的实验室诊断流程及相关问题探讨 侵袭性念珠菌病的诊断程序（上） 1、念珠菌感染少见于下列哪个部位（）B 2、特异度较高，但是容易受环境中念珠菌污染的实验室检测方法是（）C 3、念珠菌感染（IC）的高危因素不包括下列哪一项C 4、关于侵袭性念珠菌疾病，下列说法错误的是（）B 5、IC指南中指出了引起超过90%的致命性深组织感染的五种主要真菌，其中不包括（）B 侵袭性念珠菌病的诊断程序（下） 1、下列哪一项是念珠菌血症患者可以进行抢先治疗的条件（）D 2、下列关于念珠菌定植指数的诊断阈值，正确的是（）C 3、下列念珠菌评分错误的一项是（）B 4、logistic 回归分析确定的独立的危险因素不包括（）D 5、念珠菌定植指数临床应用时每周筛查的5个部位不包括（）C 曲霉菌肺炎诊断程序（上） 1、BAL-GM用于非粒缺患者的诊断时，阈值设定推荐的区间范围是（）D 2、关于诊断侵袭性曲霉病的血清学指标，下列说法错误的是（）C 3、BAL-GM试验对于血清GM阴性的非粒缺患者的诊断，目前认为最佳cut-off值是（）B 4、下列临床迹象和症状不能说明是曲霉呼吸道定植的一项是（）B 5、关于曲霉菌肺炎的影像学检查，不正确的一项是（）D 曲霉菌肺炎诊断程序（下） 1、下列不能用曲霉IgG抗体试验检测的是（）D 2、变应性支气管肺曲霉病必要的诊断标准不包括（）C 3、下列不可作为慢性肺曲霉病诊断指标的一项是（）B 4、下列不宜行支气管肺泡灌洗（BAL ）检查的是（）C 5、慢性肺曲霉病的临床特点不包括（）D 真菌血清学检验存在的问题及解决办法的建议 1、目前不能溯源到SI 测量结果的情况是（）C 2、为获得扩展不确定度，对合成标准不确定度所乘的包含因子K推荐值为（）B 3、有关真菌血清标本的转运、接收和保存，不正确的一项是（）C 4、不属于G试验和GM试验假阳性不相同的因素的一项是（）C 5、下列不符合真菌血清学检验采集要求的是（）D
真菌检查步骤 1.采集标本浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。 2.检查方法真菌检查的方法主要有： （1）直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。 （2）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接镜检。 （3）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。 （4）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。 四、真菌学检验的基本技术 （一）直接镜检 是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。浮载液：A.10%~20%的KOH。配方：氢氧化钾10～20g，蒸馏水加至100ml，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。B.复方氢氧化钾溶液配方：氢氧化钾（AR）10g，二甲基亚砜（AR）40ml,甘油50ml, 蒸馏水加至100ml,配制方法：将氢氧化钾先加入30ml蒸馏水中溶解后，再依次加入DMSO、甘油揺匀后，用蒸馏水加到100ml，装入塑料瓶内。此配方的优点是：配方中加DMSO，能促进角质的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氢氧化钾结晶，氢氧化钾的浓度相对低，腐蚀性亦低，为进行大面积普查或大批量采集标本作镜检带来了方便。②胶纸粘贴法：用 1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。③涂片染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择适当的染色方法，染色后，以高倍镜或油镜观察。常见镜检染色方法有：①革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。②乳酸酚棉蓝染色：用于
细菌室常规检测项目： 一形态学检查（Morphological Examination） （一）各种染色 1革兰染色（Gram stain）：将细菌分为革兰阳性菌如葡萄球菌属，链球菌属等；革兰阴性菌如大肠埃希菌沙门菌，志贺菌等。 2抗酸染色(Acid-fast stain)：通过染色将细菌分为两大类：抗酸性细菌和非抗酸性细菌，抗酸性细菌种类较少，如结核分枝杆菌，麻风分枝杆菌等。正常：未见。抗酸染色，找到红色分枝杆菌，及报告“找见抗酸分枝杆菌”，量可以用加号表示： ++++ 每个视野>10根 +++ 每个视野发现1～10根 ++ 100个视野发现10～99根 + 300个视野发现3～9根 ±300个视野发现1～2根 3异染颗粒染色（Metachromatic granula stain）：用于检查棒状杆菌。 4墨汁染色（Indian ink negative staining）：用背景着色，而细菌本身不着色的染色方法，用于脑脊液中查找新生隐球菌。正常：未见。 5鞭毛染色（Flagella stain）：鞭毛的数目和位置随细菌种类而不同，可分为周毛菌、单毛菌、双毛菌和丛毛菌，是细菌分类和鉴定的重要依据。如霍乱弧菌是单鞭毛菌。 6荚膜染色（Capsules stain）：荚膜是细菌壁外一层粘液性多聚物，赋予致病菌的侵袭力。染色将荚膜染成与菌体不同颜色，可作为细菌鉴定的依据。如肺炎链球菌。 （二）涂片检测(smear) 1便球杆比检查( stool cocus/bacillus)：即革兰阳性球菌与革兰阴性杆菌之比。 正常值：便球杆比：1:3 临床意义：健康人肠道内寄居着大量厌氧菌和小部分需氧菌。除人乳喂养的婴儿肠道内以革兰阳性球菌为主外，其余人均以革兰阴性杆菌占绝对优势。在肠道发生致病菌如沙门、志贺、弧菌感染时往往由于使用抗生素而是革兰阴性杆菌受到抑制，此时球菌/杆菌比值有可能变大。若比值显著增大，常提示肠道菌群紊乱或发生二重感染。 2标本真菌涂片（fungi）：经革兰染色如发现革兰阳性卵圆形芽生孢子或假菌丝，可初步报告为：找到真菌孢子和菌丝。 正常值：未见真菌。 3痰涂片检查（sputum smear）： 临床意义：目的确定标本是否适合做细菌培养，初步判定是否有致病菌存在。首先应确定标本是否为来自下呼吸道的痰，其标准为革兰染色WBC>25/LPF(低倍视野),上皮细胞<10/LPF。有些细菌可做初步判断： 1) 肺炎链球菌：革兰染色为阳性球菌，成双或短链状排列 2) 结核分枝杆菌：抗酸染色，找到红色分枝杆菌，及报告“找见抗酸分枝杆菌”，量可以用加号表示： ++++ 每个视野>10根 +++ 每个视野发现1～10根 ++ 100个视野发现10～99根 + 300个视野发现3～9根 ±300个视野发现1～2根 3) 真菌：经革兰染色如发现革兰阳性卵圆形芽生孢子或假菌丝，可初步报告为：找到真菌孢子和菌丝。
真菌实验室检查法 发表时间：2011-06-10T15:19:54.967Z 来源：《中外健康文摘》2011年第11期供稿作者：吴彩虹[导读] 分离是鉴定的基础，鉴定为分离的目的，也是治疗时选择用药的依据。 吴彩虹 (黑龙江省呼玛县人民医院 165100) 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)11-0202-02 【摘要】致病性真菌的检测通常分两个阶段，即分离和鉴定。分离是鉴定的基础，鉴定为分离的目的，也是治疗时选择用药的依据。目的讨论真菌实验室检查法。方法对致病性真菌进行分离后用形态学检查法与特殊检查法测定。结论真菌的实验室检查结果很重要，只有对临床标本进行正确检查才能够为医生对疾病进行诊断提供依据。【关键词】真菌实验室检查法致病性真菌的检测通常分两个阶段，即分离和鉴定。分离是鉴定的基础，鉴定为分离的目的，也是治疗时选择用药的依据。 (一)致病性真菌的分离 1.标本的采集处理正确地采集和处理标本对正确诊断和鉴定至关重要，应注意以下原则： (1)严格无菌操作。 (2)应尽可能迅速送检以保持标本新鲜。室温放置时间不应超过2小时，4℃冰箱内不要超过8小时。 (3)详细记录标本的来源和取材日期，以及患者基本情况等必要的基础资料。 (4)标本要足量，保证同时进行镜检和培养液体标本应大于5ml，组织标本应保证同时进行病理学和真菌培养检查。 2.直接镜检法对标本进行直接涂片和镜检是真菌实验室最常用的检查方法。其优点为简便、快速、直接。一般阳性即表示有真菌存在，提示真菌感染，但阴性结果也不能排除诊断。除少数外，大多数致病菌种均要经培养才能确定菌种。需指出的是，对于取自皮肤病变部位标本的阳性结果可作为诊断依据，而对于痰液、尿液等开放性标本即使镜检、培养阳_性也不能妄下诊断，因有时会将原有的正常菌丛误认为致病菌。但如发现较多的菌丝或假_菌丝则有诊断意义，因为这是真菌繁殖且已躲过机体防御的证据。 真菌镜检按常规进行，但需注意两点，一是光源应弱，二是聚光器下调，这样可使真菌成：分折光性突出，便于观察。 真菌培养是其分离鉴定的重要步骤，因绝大多数致病菌种的鉴定依据主要是形态学特征；若要鉴定至种以下水平，即亚种、变种、亚型甚至个体株需作生理生化试验时，也必须先经分离培养获得纯克隆菌落方可进行。同时真菌培养的阳性率一般较直接镜检法高。因此，为了进一步寻找真菌存在的证据，同时进一步鉴定致病菌的种类，应对疑为真菌感染患者的标本进行培养检查。 (二)致病真菌的鉴定-形态学检查法 对来自临床标本的初代培养菌落需分离进行次代培养，以便进行形态学观察和生理生化学试验，做出正确鉴定。次代培养有3种方法：①试管斜面培养：为最普通且常用的培养方法。其特点是安全简便，可在显微镜下初步观察培养物的结构特点，也可以将菌落挑出制成湿片。②平皿培养法：主要是为了更好地观察菌落形态，也可用一小条透明胶纸带在菌落上轻沾一下，然后置载玻片上染色，压片观察。优点是保持了孢子与菌丝的关系(鉴定特征之一)，避免了挑起菌落可将孢子从菌丝体上人为分离干扰鉴定的弊端，但应注意不要沾取菌落中央或边缘，因为前者几乎均为营养菌丝，孢子稀少，而后者孢子太多，影响判断，故应在两者之间沾取。③玻片培养法：可以更为直观详尽地观察待检菌的生长情况，特别是咆子的发生情况，且可制成封片长期保存。 医学真菌的鉴定应依据形态为主、生理生化特征为辅的原则。区分属主要根据形态结合少量生理特征，形态方面包括营养细胞形态，与菌丝的关系及增殖方式，是否形成真菌丝或假菌丝，有性孢子的特点及数目等。区分种则主要依靠生理生化特征，其中又以糖类的发酵和同化最为重要。 无性孢子是医学真菌中最常见的繁殖结构，主要存在于半知菌亚门，此外接合菌、子囊菌、部分担子菌的无性繁殖均可产生此类孢子，其中分生孢子的分生方式是形态学分类的基础。 (三)致病真菌的鉴定-特殊检查法 1.生理生化检查法包括最高生长温度测定、糖发酵、糖同化试验、硝酸盐利用试验、尿素酶试验等。目前已有市售的同化试验试剂盒和鉴定系统，使这类试验更为方便，结果更为可靠。但目前因价格因素，基层医院尚无法普及，可按真菌实验室手册自行配制。 2.血清学检查法多应用于酵母菌的分型及所致感染的快速诊断，如检测新型隐球菌荚膜抗原的乳胶凝集试验，检测念珠菌和曲霉抗原的ELISA试验，鉴定双相真菌和暗色真菌的外抗原试验以及对念珠菌进行分型的凝集试验等。以上试验均已商品化，可按说明书操作。 3.组织病理学检查对于确定致病菌在组织内寄生并了解宿主的反应十分重要，由于常规HE染色标本中真菌不易着色而难以发现，故特殊染色法对检出真菌病原体十分重要。常规的染色方法有：①过碘酸锡夫染色法(PAS染色法)：最常用，可使真菌染成红色而易被发现；②姬姆萨染色法(GMS染色法)：可使真菌成分染为黑色，背景绿色，衬度良好，适于大多数真菌；③Gridley真菌染色：真菌孢子染为玫瑰色至紫色，菌丝深蓝或深玫瑰色，背景黄色；④粘蛋白卡红染色法(MCS染色法)：可将新型隐球菌荚膜染成红色，核则染成黑色；⑤苏木素一伊红染色法(HE染色法)：暗色真菌可显示出颜色，对曲霉和接合菌效果较好，尚能反映出组织反应情况。 4.动物试验将待测病原菌接种于动物体内，再取感染组织作培养及病理检查。目的主要是为了确定被检菌的致病性，另外还可恢复病原菌的毒力。常用小白鼠和豚鼠，可经过静脉、腹腔途径接种，也可接种于皮肤、颅内，应依致病菌种类来决定，且菌量不同可引起不同程度病变。 5.分子生物学用于对疑难菌种及个体株的鉴定，因上述介绍的鉴定方法均依据待测菌的表型(phenotype)，但有时表型会因变异、诱导或人为误差而发生变化，造成鉴定错误，而生物的基因型(genotype)则较稳定，更能反应群体间种系发生学的关系。已有诸多分子生物学方法，如G+C mol％、酶切图谱、DNA指纹、电泳核型、随机扩增多态性、测序等等用在医学真菌的分类分型上，显示很好的应用前景。特别值得一提的是，用PCR方法对深部真菌感染进行早期诊断已进入临床评价阶段，这对于及早选用敏感抗真菌药物进行治疗，以挽救患者生命很有意义。