Sigma-Aldrich公司近日推出Imprint Methylated DNA Quantification Kit (MDQ1)，用于表观遗传学研究。Imprint Methylated DNA Quantification Kit利用类似ELISA的步骤，无需放射性同位素或层析，能在不到四小时内检测整体的甲基化情况。这个试剂盒只需要5ng的甲基化DNA，分析形式为灵活的8孔分析胶条，能够对培养的细胞、组织、血浆和其他体液样品的DNA进行高通量或手工分析。Imprint MDQ技术让科学家迅速确定生物样品中的整体甲基化状态，为改变甲基化状态的条件以及更深入的疾病研究打下基础。
目前的甲基化定量研究主要采取反向HPLC、MALDI-TOF-MS 、甲基化敏感内切酶指纹法、DNA甲基化酶分析、免疫组化染色和点杂交等方法。MDQ1试剂盒为研究人员提供了一种新的选择。MDQ1试剂盒中包含了所有必需的试剂，能让实验室自行筛选样品，而无需将样品送出去分析。
Sigma-Aldrich的销售经理Tim Fleming表示：“我们的Imprint Methylated DNA Quantification Kit为整体DNA甲基化定量提供了快速而完整的解决方案。这项激动人心的技术添加到我们的表观遗传学研究产品中，反映出Sigma- Aldrich开发可靠的平台来支持表观遗传学研究的承诺。”
Sigma- Aldrich是从Epigentek集团获得MDQ技术的许可。Imprint Methylated DNA Quantification Kit 是Sigma在生命科学领域的表观遗传学研究产品线的补充，它还包括Imprint DNA Modification Kit和Imprint ChIP Kit，以及DNA纯化、qPCR、测序和反应后纯化等产品。
Epigentek的首席科技官Adam Li表示：“我们非常高兴Sigma-Aldrich选择与Epigentek在表观遗传学领域合作。这次协议强调了Epigentek在表观遗传学方面的地位，巩固了我们的策略和产品，两家公司有望合作开发新的表观遗传学技术和产品。”
关于Imprint Methylated DNA Quantification Kit以及Sigma-Aldrich表观遗传学研究产品组合的更多信息，请访问https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/epigenetics。
关于Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich是一个领先的生命科学和高科技公司。它的生化和有机化学产品和试剂盒广泛应用于基因组学研究、生物技术、药物研发和疾病诊断，并成为药物及其他高科技生产的关键组分。该公司的客户遍布生命科学公司、大学和政府研究院、医院和工业。超过百万科学家和技术人员使用其产品。Sigma-Aldrich致力于通过在生命科学的领导地位、高科技和服务来加速客户的成功。如需Sigma-Aldrich的更详细信息，请访问其屡获大奖的网站https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,。
（生物通余亮）
2008年11月6日第四十六期第 10 页，共 21 页下一页 返回
举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
第一章蛋白质化学 一、选择题 1、下列氨基酸哪个含有吲哚环？ a、Met b、Phe c、Trp d、Val e、His 2、含有咪唑环的氨基酸是： a、Trp b、Tyr c、His d、Phe e、Arg 3、氨基酸在等电点时，应具有的特点是： a、不具正电荷ｂ、不具负电荷ｃ、溶解度最大ｄ、在电场中不泳动 4、氨基酸与蛋白质共有的性质是： ａ、胶体性质ｂ、沉淀反应ｃ、变性性质ｄ、两性性质ｅ、双缩脲反应 5、维持蛋白质三级结构主要靠： ａ、疏水相互作用ｂ、氢键ｃ、盐键ｄ、二硫键ｅ、范德华力 6、蛋白质变性是由于： ａ、氢键被破坏ｂ、肽键断裂ｃ、蛋白质降解 ｄ、水化层被破坏及电荷被中和ｅ、亚基的解聚 7、高级结构中包含的唯一共价键是： ａ、疏水键ｂ氢键ｃ、离子键ｄ、二硫键
8、八肽Gly-Tyr-Pro-Lys-Arg-Met-Ala-Phe用下述那种方式处理不产生任何更小的肽？ a、溴化氰 b、胰蛋白酶 c、胰凝乳蛋白酶 d、盐酸 9、在蛋白质的二级结构α-螺旋中，多少个氨基酸旋转一周？ a、0.15 b、5.4 c、10 d、3.6 二、填空题 １、天然氨基酸的结构通式是。 ２、具有紫外吸收能力的氨基酸有、、，其中以的吸收最强。 ３、盐溶作用是 。 盐析作用是 。 ４、维持蛋白质三级结构的作用力是，，和盐键。 ５、蛋白质的三种典型的二级结构是，，。
６、Ｓａｎｇｅｒ反应的主要试剂是。 7、胰蛋白酶是一种酶，专一的水解肽链中 和的 形成的肽键。 8、溴化氢（HBr）是一种水解肽链肽键的化学试剂。 三、判断题 1、天然存在的氨基酸就是天然氨基酸。 2、氨基酸在中性水溶液中或在晶体状态时都以两性离子形式存在。 3、维系蛋白质二级结构的最重要的作用力是氢键。 4、所有蛋白质分子中氮元素的含量都是１６%。 5、利用盐浓度的不同可以提高或降低蛋白质的溶解度。 6、能使氨基酸净电荷为０时的ｐH值即ｐＩ值就一定是真正的中性ｐH值即ｐH＝７。 7、由于各种天然氨基酸都有２８０ｎｍ的光吸收特性，据此可以作为紫外吸收法定性 检测蛋白质的依据。 8、氨基酸的等电点可以由其分子上解离基团的解离常数来确定。 9、一般变性的蛋白质都产生沉淀现象，而沉淀的蛋白质一定是变性蛋白质。 10、某氨基酸的等电点为６.５，当它在ｐＨ＝４.８的缓冲液中
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
蛋白相互作用Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。 用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。
实验准备： 实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液 实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、140mM NaCl、10mM KCl SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT
裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl、1mM EDTA（pH8.0）、0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin）、1ug/ul白胃素（leupeptin）、0.7ug/ml胃酶抑素（pepstatin）、25ug/ml苯甲磺酰氟（PMSF）） 实验方法： 方法一： 1、预清除细胞裂解液： 将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4℃混合孵育2h。 离心机12,000g在4℃离心2min。 将上清转移至新的离心管中。 2、探测细胞裂解液 两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。 最大速度在4℃离心样品2min。 在新的微量离心管中收集上清。 用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。 重复洗三次。 加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统
2005－周金秋 检测蛋白质之间相互作用的实验方法有哪些？这些检测方法各有什么缺点？ 1．生化方法（Biochemical approaches） 1.1共纯化、共沉淀Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation)在不同基质上进行色谱层析 1.2蛋白质亲和层析（Affinity chromatography）将一种蛋白质固定于某种基质上（如 Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。 GST pull down：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。 Epitope-tag：表位附加标记技术就是将附加的抗原融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。 以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用；蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的；有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。 1.3免疫共沉淀（Immunoprecipitation） 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
表1蛋白质相互作用分析相关数据库及网站 208
v/Entrez）； （2）在Search后的选择栏中选择protein； （3）在输入栏输入homo sapiens adiponectin； （4）点击go后显示序列接受号及序列名称； （5）点击序列接受号NP_004788 （adiponectin precursor；adipose most abund ant gene transcript 1 [Homo sapiens]）后显示序列详细信息； （6）将序列转为FASTA格式保存（参考上述步骤使用SRS信息查询系统检索人脂联素蛋白质序列）； 2、使用BioEdit软件对人脂联素蛋白质序列进行分子质量、氨基酸组成和疏水性等基本性质分析： 打开BioEdit软件→将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列输入分析框→点击左侧序列说明框中的序列说明→点击sequence栏→选择protein→点击Amino Acid Composi tion→查看该蛋白质分子质量和氨基酸组成；或者选择protein后，点击Kyte & Doolittle Mean Hydrophobicity Profile→查看该蛋白质分子疏水性水平； 3、人脂联素蛋白质序列的蛋白质同源性分析： （1）进入NCBI/Blast网页； （2）选择Protein-protein BLAST （blastp）； （3）将FASTA格式序列贴入输入栏； （4）点击BLAST； （5）查看与之同源的蛋白质； 4、人脂联素蛋白质序列的motif结构分析： （1）进入http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN网页； （2）将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列贴入输入栏； （3）点击Scan； （4）查看分析结果（注意Prosite Profile中的motif information）； 5、人脂联素蛋白质序列的二级结构预测： （1）进入下列蛋白结构预测服务器网址： http://www.embl-heidelberg.de/predictprot ein//predictprotein.html （The PredictProtein Server）； （2）在You can栏点击default； （3）填写email地址和序列名称； （4）将人脂联素蛋白质序列的FASTA格式序列贴入输入栏点击Submit； （5）从email信箱查看分析结果；
1.药品标准中鉴别试验的意义在于（ B ） A.检查已知药物的纯度 B.验证已知药物与名称的一致性 C.确定已知药物的含量 D. 考察已知药物的稳定性 E.确证未知药物的结构 2.中国药典规定：恒重，除另有规定外，系指供试品连续两次干燥或炽灼后的重量差异在（ C ） A. 0.01 mg B. 0.03 mg C. 0.3 mg D.0.1 mg E.0.5 mg 3.盐酸溶液（1 → 1000）系指（ A ） A.盐酸1.0 mL加水使成1000 mL的溶液 B.盐酸1.0 mL加甲醇使成1000 mL的溶液 C.盐酸1.0 g加水使成1000 mL的溶液 D.盐酸1.0 g加水1000 mL制成的溶液 E.盐酸1.0 mL加水1000 mL制成的溶液 4. ChP中收载的残留溶剂检查法是（ C ） A. HPLC法 B. TLC法 C. GC法 D. TGA法 E. DSC法 5.下列试液中，用作ChP重金属检查法中的显色剂的是（B ） A.硫酸铁铵试液 B.硫化钠试液 C.氰化钾试液 D. 重铬酸钾试液 E.硫酸铜试液 6.采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有微量高铁盐存在，需加入的是（ E ） A.碘试液 B.重铬酸钾溶液 C.高锰酸钾溶液 D.过硫酸铵 E.抗坏血酸 7.下列药物中，能采用重氮化-偶合反应进行鉴别的是（ D ） A.阿司匹林 B.美洛昔康 C.尼美舒利 D. 对乙酰氨基酚 E. 吲哚美辛 8.下列药物中，可显双缩脲反应的是（ B ） A.硫酸多巴胺 B.盐酸麻黄碱 C.苯佐卡因 D. 对氨基苯甲酸 E. 氧烯洛尔 9.具芳伯氨基或经水解生成芳伯氨基的药物可用亚硝酸钠滴定，其反应条件是 第1页（共17页）
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原
金属离子与血清白蛋白的相互作用 一、实验目的： 测定过渡金属离子对蛋白质功能的影响 二、实验原理： 金属离子在许多生命过程中发挥关键作用，研究金属离子与蛋白质的结合作用是生命科学的重要内容，是化学和生命科学研究的前沿领域。血清白蛋白是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质。由于血清白蛋白在生理上的重要性和易于分离、提纯，从上世纪50年度（国内80年代末）开始，人们对血清白蛋白与金属离子（和药物分子等）的相互作用展开了大量研究，以期在分子水平上揭示相关生命过程的奥秘。 许多蛋白质含有金属离子，金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用。在人体基因组编码的蛋白质中，超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离子；所有酶中，超过40%的蛋白质含有金属离子，它们在生命活动过程中发挥着各样的生物学功能。许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关。 目前用于研究金属离子与蛋白质相互作用的研究方法主要有：（1）紫外-可见吸收光谱法；（2）荧光光谱法；（3）平衡透析法；（4）毛细管电泳法；（5）电泳法等。 （一）紫外-可见光谱法 蛋白质通常有3个明显不同的紫外吸收带：（1）210nm以下的吸收来自肽键的吸收以及许多构象因素；（2）210-250nm为芳香族和其他残基的吸收、某些氢键的吸收、与其他构象和螺旋相关的相互作用等多种因素；（3）250-290nm附近为芳香族的残基，其中酪氨酸残基在278nm（Tyr，260-290nm）附近有强吸收，色氨酸残基（Trp）在290nm附近有强吸收，而苯丙氨酸（Phe，250-260nm）的吸收较弱。外界因素如溶剂极性以及pH等会影响吸收光谱。 当金属离子与蛋白质结合时，蛋白质或金属离子吸收光谱的强度或者谱带位置会发生变化，可分为两种情况：（1）蛋白质微扰的金属离子光谱变化，可以推断金属离子的配位环境；（2）金属离子微扰的蛋白质光谱变化，可以推断生色基微环境及蛋白质结构的变化。通过对光谱的比较分析和计算，可以推断金属离子与蛋白质的结合情况。若蛋白质的吸收峰增强，则可认为小分子进入蛋白质的疏
蛋白质组学 蛋白质是生物体的重要组成部分，参与几乎所有生理和细胞代谢过程。此外，与基因组学和转录组学比较，对一个细胞或组织中表达的所有蛋白质，及其修饰和相互作用的大规模研究称为蛋白质组学。 蛋白质组学通常被认为是在基因组学和转录组学之后，生物系统研究的下一步。然而，蛋白质组的研究远比基因组学复杂，这是由于蛋白质内在的复杂特点，如蛋白质各种各样的翻译后修饰所决定的。并且，研究基因组学的技术要比研究蛋白质组学的技术强得多，虽然在蛋白质组学研究中，质谱技术的研究已取得了一些进展。 尽管存在方法上的挑战，蛋白质组学正在迅速发展，并且对癌症的临床诊断和疾病治疗做出了重要贡献。几项研究鉴定出了一些蛋白质在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和食道癌中表达变化。例如，通过蛋白质组学技术，人们可以在患者血液中明确鉴定出肿瘤标志物。表1列出了更多的蛋白质组学技术用于研究癌症的例子。 另外，高尔基体功能复杂。最新研究表明，它除了参与蛋白加工外，还能参与细胞分化及细胞间信号传导的过程，并在凋亡中扮演重要角色，其功能障碍也许和肿瘤的发生、发展有某种联系。根据人类基因组研究，约1000多种人类高尔基体蛋白质中仅有500~600种得到了鉴定，建立一条关于高尔基体蛋白质组成的技术路线将有助于其功能的深入研究。 蛋白质组学是一种有效的研究方法，特别是随着亚细胞器蛋白质组学技术的迅猛发展，使高尔基体的全面研究变为可能。因此研究人员希望能以胃癌细胞中的高尔基体为研究对象，通过亚细胞器蛋白质组学方法，建立胃癌细胞中高尔基体的蛋白质组方法学。 研究人员采用蔗糖密度梯度的超速离心方法分离纯化高尔基体，双向凝胶电泳（2-DE）分离高尔基体蛋白质，用ImageMaster 2D软件分析所得图谱，基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定蛋白质点等一系列亚细胞器蛋白质组学方法建立了胃癌细胞内高尔基体的蛋白图谱。 最后，人们根据分离出的纯度较高的高尔基体建立了分辨率和重复性均较好的双向电泳图谱，运用质谱技术鉴定出12个蛋白质，包括蛋白合成相关蛋白、膜融合蛋白、调节蛋白、凋亡相关蛋白、运输蛋白和细胞增殖分化相关蛋白。通过亚细胞器分离纯化、双向电泳的蛋白分离及MALDI-TOF MS蛋白鉴定分析，研究人员首次成功建立了胃癌细胞SGC7901中高尔基体的蛋白质组学技术路线。 蛋白质功能预测工具 也许生物信息学方法在癌症研究中最常用的就是基因功能预测方法，但是这些数据库只存储了基因组的大约一半基因的功能。为了在微阵列资料基础上完成功能性的富集分析，基因簇的功能注解是非常重要的。近几年生物学家研发了一些基因功能预测的方法，这些方法旨在超越传统的BLAST搜索来预测基因的功能。基因功能预测可以以氨基酸序列、三级结构、与之相互作用的配体、相互作用过程或基因的表达方式为基础。其中最重要的是基于氨基酸序列的分析，因为这种方法适合于微阵列分析的全部基因。 在表3中，前三项列举了三种同源搜索方法。FASTA方法虽然应用还不太广泛，但它要优于BLAST，或者至少相当。FASTA程序是第一个使用的数据库相似性搜索程序。为了达到较高的敏感程度，程序引用取代矩阵实行局部比对以获得最佳搜索。美国弗吉尼亚大学可以提供这项程序的地方版本，当然数据库搜索结果依赖于要搜索的数据库序列。如果最近的序列数据库版本在弗吉尼亚大学不能获得，那么就最好试一下京都大学（Kyoto University）的KEGG 站点。PSI-BLAST（位点特异性反复BLAST）是BLAST的转化版本，PSI-BLAST的特色是每次用profile搜索数据库后再利用搜索的结果重新构建profile，然后用新的profile再次搜索数据库，如此反复直至没有新的结果产生为
Thermo Scientific Pierce Th S i tifi Pi
蛋 蛋白相互作用的研究方法和实践 实
罗 莎 Rosa Luo Ph.D. Application Scientist Biosciences Division Thermo Fisher Scientific China
酵母蛋白质相互作用图谱
Thick blue lines represent literature-derived interactions from PreBIND+MIPS in the HMS-PCI dataset. Thin orange lines represent potential novel interactions. Courtesy MDS Proteomics
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蛋白质相互作用技术
Genetic Two Hybrid Phage Display Mutational analysis M t ti l l i Biochemical Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (C IP) C I i it ti (Co-IP) Pull-Down Assays Far Western FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Chemical Crosslinking Label-transfer FeBABE F BABE mapping i Fluorescent Immunofluorescence colocalization
3
蛋白质相互作用
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和 Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。 （1）原理： 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD 的编码序列融合形成另一个杂交体，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 (2)应用范围 1）已知蛋白之间相互作用的检测： 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸； 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。 1）二、噬茵体展示技术 2）
蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术
Sigma-Aldrich公司近日推出Imprint Methylated DNA Quantification Kit (MDQ1)，用于表观遗传学研究。Imprint Methylated DNA Quantification Kit利用类似ELISA的步骤，无需放射性同位素或层析，能在不到四小时内检测整体的甲基化情况。这个试剂盒只需要5ng的甲基化DNA，分析形式为灵活的8孔分析胶条，能够对培养的细胞、组织、血浆和其他体液样品的DNA进行高通量或手工分析。Imprint MDQ技术让科学家迅速确定生物样品中的整体甲基化状态，为改变甲基化状态的条件以及更深入的疾病研究打下基础。 目前的甲基化定量研究主要采取反向HPLC、MALDI-TOF-MS 、甲基化敏感内切酶指纹法、DNA甲基化酶分析、免疫组化染色和点杂交等方法。MDQ1试剂盒为研究人员提供了一种新的选择。MDQ1试剂盒中包含了所有必需的试剂，能让实验室自行筛选样品，而无需将样品送出去分析。 Sigma-Aldrich的销售经理Tim Fleming表示：“我们的Imprint Methylated DNA Quantification Kit为整体DNA甲基化定量提供了快速而完整的解决方案。这项激动人心的技术添加到我们的表观遗传学研究产品中，反映出Sigma- Aldrich开发可靠的平台来支持表观遗传学研究的承诺。” Sigma- Aldrich是从Epigentek集团获得MDQ技术的许可。Imprint Methylated DNA Quantification Kit 是Sigma在生命科学领域的表观遗传学研究产品线的补充，它还包括Imprint DNA Modification Kit和Imprint ChIP Kit，以及DNA纯化、qPCR、测序和反应后纯化等产品。 Epigentek的首席科技官Adam Li表示：“我们非常高兴Sigma-Aldrich选择与Epigentek在表观遗传学领域合作。这次协议强调了Epigentek在表观遗传学方面的地位，巩固了我们的策略和产品，两家公司有望合作开发新的表观遗传学技术和产品。” 关于Imprint Methylated DNA Quantification Kit以及Sigma-Aldrich表观遗传学研究产品组合的更多信息，请访问https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,/epigenetics。 关于Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich是一个领先的生命科学和高科技公司。它的生化和有机化学产品和试剂盒广泛应用于基因组学研究、生物技术、药物研发和疾病诊断，并成为药物及其他高科技生产的关键组分。该公司的客户遍布生命科学公司、大学和政府研究院、医院和工业。超过百万科学家和技术人员使用其产品。Sigma-Aldrich致力于通过在生命科学的领导地位、高科技和服务来加速客户的成功。如需Sigma-Aldrich的更详细信息，请访问其屡获大奖的网站https://www.doczj.com/doc/6e5056542.html,。 （生物通余亮） 2008年11月6日第四十六期第 10 页，共 21 页下一页 返回