1.药品标准中鉴别试验的意义在于（ B ）
A.检查已知药物的纯度
B.验证已知药物与名称的一致性
C.确定已知药物的含量
D. 考察已知药物的稳定性
E.确证未知药物的结构
2.中国药典规定：恒重，除另有规定外，系指供试品连续两次干燥或炽灼后的重量差异在（ C ）
A. 0.01 mg
B. 0.03 mg
C. 0.3 mg
D.0.1 mg
E.0.5 mg
3.盐酸溶液（1 → 1000）系指（ A ）
A.盐酸1.0 mL加水使成1000 mL的溶液
B.盐酸1.0 mL加甲醇使成1000 mL的溶液
C.盐酸1.0 g加水使成1000 mL的溶液
D.盐酸1.0 g加水1000 mL制成的溶液
E.盐酸1.0 mL加水1000 mL制成的溶液
4. ChP中收载的残留溶剂检查法是（ C ）
A. HPLC法
B. TLC法
C. GC法
D. TGA法
E. DSC法
5.下列试液中，用作ChP重金属检查法中的显色剂的是（B ）
A.硫酸铁铵试液
B.硫化钠试液
C.氰化钾试液
D. 重铬酸钾试液
E.硫酸铜试液
6.采用硫代乙酰胺法检查重金属时，供试品如有微量高铁盐存在，需加入的是（ E ）
A.碘试液
B.重铬酸钾溶液
C.高锰酸钾溶液
D.过硫酸铵
E.抗坏血酸
7.下列药物中，能采用重氮化-偶合反应进行鉴别的是（ D ）
A.阿司匹林
B.美洛昔康
C.尼美舒利
D. 对乙酰氨基酚
E. 吲哚美辛
8.下列药物中，可显双缩脲反应的是（ B ）
A.硫酸多巴胺
B.盐酸麻黄碱
C.苯佐卡因
D. 对氨基苯甲酸
E. 氧烯洛尔
9.具芳伯氨基或经水解生成芳伯氨基的药物可用亚硝酸钠滴定，其反应条件是
第1页（共17页）
（ A ）
A.适量强酸环境，加适量溴化钾，室温下进行
B.弱酸酸性环境，40℃以上加速进行
C.酸浓度高，反应完全，宜采用高浓度酸
D. 酸度高反应加速，宜采用高酸度
E. 酸性条件下，室温即可，避免副反应
10.下列药物中，不属于对氨基苯甲酸酯类的是（ C ）
A.盐酸普鲁卡因
B.苯佐卡因
C.盐酸利多卡因
D. 盐酸丁卡因
E. 盐酸氯普鲁卡因
11.下列巴比妥类药物中，可与铜盐吡啶试剂生成绿色配合物，又与铅盐生成白色沉淀的是（ C ）
A.巴比妥
B.异戊巴比妥
C.硫喷妥钠
D. 环己烯巴比妥
E. 苯巴比妥
12.能够与盐酸氯丙嗪反应生成沉淀的试剂是（A ）
A.三硝基苯酚
B.三氯化铁
C.茜素锆
D. 碱性酒石酸铜
E. 氯化钡
13.莨菪烷类生物碱的特征反应是（ E ）
A.与三氯化铁反应
B.与生物碱沉淀剂反应
C.重氮化-偶合反应
D. 丙二酰脲反应
E. Vitali反应
14.采用酸性染料比色法测定药物含量，如果溶液pH过低对测定造成的影响是（ A ）
A.使In-浓度太低，而影响离子对的形成
B.有机碱药物呈游离状态
C.使In-浓度太高
D. 没有影响
E. 有利于离子对的形成
15.硫色素反应为下列哪个药物的专属鉴别反应（ B ）
A.维生素A
B.维生素B1
C.维生素C
D.维生素D
E.维生素E
16. 需检查游离生育酚杂质的药物是（ C ）
A.地西泮
B.异烟肼
C.维生素E
D.丙黄舒
E.甲芬那酸
第2页（共17页）
17.具有β-内酰胺环结构的药物是（ E ）
A.阿司匹林
B.奎宁
C.四环素
D.庆大霉素
E.阿莫西林
18. 链霉素具有的特征反应是（ A ）
A.坂口反应
B.柯柏反应
C.硫色素反应
D.差向异构反应
E.戊烯二醛反应
19.平均片重0.30 g以下片剂重量差异限度为（ D ）
A.±1.0%
B.±3.0%
C.±5.0%
D.±7.5%
E.±10%
20.以淀粉、糊精等作为稀释剂时，对片剂的主药进行含量测定，最有可能受到干扰的测定方法是（ B ）
A. EDTA滴定法
B.氧化还原滴定法
C. HPLC法
D. GC法
E.酸碱滴定法
A. SFDA
B. ChP
C. GCP
D. GLP
E. GMP
下列管理规范的英文缩写是
D21.药品非临床研究质量管理规范
E22.药品生产质量管理规范
[23-26]
A.对氨基酚
B.酮体
C.游离水杨酸
D.二聚体
E.对氨基苯甲酸
中国药典规定下列药物需检查的特殊杂质是
C23.阿司匹林
E24.盐酸普鲁卡因
A25.对乙酰氨基酚
B26.肾上腺素
[27-30]
A.加酸水解，在酸性条件下，与亚硝酸钠、碱性β-萘酚反应，显红色
B.在三氯醋酸存在下水解、脱羧、失水，再加入吡咯加热至50℃产生蓝色
C.取供试品溶液，滴加氯化钡试液，即生成白色沉淀；分离，沉淀在盐酸或硝酸中均不溶解
第3页（共17页）
第4页（共17页）
D . 与碳酸钠试液加热水解，再加过量稀硫酸酸化后生成白色沉淀，并发生醋酸的
臭气
E . 与硫酸铜和氢氧化钠试液反应即显蓝紫色
以下药物的鉴别反应是
D27. 阿司匹林
E28. 盐酸麻黄碱
A29. 对乙酰氨基酚
B30. 维生素C
31. 药品标准中，“检查”项系检查药物的（ ABCD ）
A . 安全性
B . 有效性
C . 均一性
D . 纯度
E . 稳定性
32. 在固体供试品比旋度计算公式lc
t
D ?=?100][中（ ABC ） A . t 为测定时的温度（℃） B . D 为钠光谱的D 线
C . α为测得的旋光度
D . l 为测定管长度（cm ）
E . c 为每1 mL 溶液中含有被测物质的重量（g ）
33. 芳香第一胺类药物鉴别试验使用的试剂有（ ACD ）
A . 稀盐酸
B . 稀醋酸
C . 亚硝酸钠
D . β-萘酚
E . 硝酸银
34. 采用硫氰酸盐法检查铁盐时，加入过硫酸铵的作用有（ ABD ）
A . 将供试品中Fe 2+氧化成Fe 3+
B . 防止光线使硫氰酸铁还原
C . 防止Fe 3+水解
D . 防止硫氰酸铁分解褪色
E . 使溶液色泽梯度明显，易于区别
35. 两步滴定法测定阿司匹林片剂含量时，第一步消耗的氢氧化钠的作用有
（ABCD ）
A . 中和游离水杨酸
B . 中和阿司匹林分子中的羧基
C . 中和酸性杂质
D . 中和辅料中的酸
E . 水解酯键
36.盐酸普鲁卡因常用的鉴别反应有（AB ）
A.重氮化-偶合反应
B.水解反应
C.氧化反应
D.磺化反应
E.碘化反应
37.吩噻嗪类药物的理化性质有（ABCD E）
A.多个吸收峰的紫外光谱特征
B.易被氧化
C.可以与金属离子络合
D.杂环上的氮原子碱性极弱
E.侧链上的氮原子碱性较强
38.能直接与三氯化铁试液反应生成有色配位化合物的药物有（ACDE ）
A.水杨酸
B.阿司匹林
C.吡罗昔康
D.美洛昔康
E.对乙酰氨基酚
39.能发生羟肟酸铁反应的抗生素类药物有（ACDE）
A.青霉素钾
B.硫酸链霉素
C.氨苄西林钠
D.头孢他啶
E.阿莫西林钠
40.当注射剂中有抗氧剂亚硫酸钠或亚硫酸氢钠时，可被干扰的含量测定方法有（BCDE）
A.络合滴定法
B.亚硝酸钠滴定法
C.铈量法
D.碘量法
E.氧化还原滴定法
41.（√ ）42.（×）43.（×）44.（×）45.（√ ）
46.（√ ）47.（×）48.（√ ）49.（×）50.（√ ）
41.药品标准是对药品质量、规格及检验方法所作的技术规定。（√ ）
42. 熔点测定中，“全熔”系指供试品在毛细管内开始局部液化出现明显液滴时的温度。（×）
43. 古蔡氏检砷法中需比较供试品砷斑与标准砷斑的面积大小来判断供试品中的砷盐是否符合限量规定。（×）
44. 水杨酸可在碱性下与三氯化铁试液反应生成紫堇色配位化合物。（×）
45. 多数苯乙胺类药物基本结构中存在手性碳原子，具有光学活性。（√ ）
46. 重氮化反应中，加入适量的溴化钾的目的是加快反应速度。（√ ）
47. 为严格控制药物制剂的质量，与盐酸氯丙嗪相比，盐酸氯丙嗪制剂的有关物质检查相应严格了限制。（×）
48. 莨菪烷类抗胆碱药物都具有水解性、碱性和旋光性。（√ ）
第5页（共17页）
49. 维生素C显酸性，酸性来源为C2-OH。（×）
50. 当主药与片剂辅料的混合不均匀时，应以含量均匀度检查替代重量差异检查。（√ ）
51.简述古蔡法检查砷的原理以及加入醋酸铅棉花、酸性氯化亚锡和碘化钾的作用。
（1）原理：利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具有挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，（1分）与同等条件下一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判断药物中砷盐的限量。（1分）
（2）加入醋酸铅棉花作用：吸收供试品及锌粒中可能含有少量的硫化物在酸性条件下产生的硫化氢气体，避免其与溴化汞作用产生硫化汞色斑干扰测定结果。（1分）
（3）加入酸性氯化亚锡和碘化钾作用：
①还原As5+为As3+（1分）
②抑制SbH3的生成（1分）
③形成锌锡齐，加快反应速度（1分）
52.简述阿司匹林片两步滴定法的原理与操作要点。
因阿司匹林片剂中除存在其中水解产物水杨酸及醋酸外，在制剂工艺中添加了抑制阿司匹林水解的稳定剂酒石酸或枸橼酸。为消除片剂中酸性降解产物及稳定剂对阿司匹林测定的干扰，可采用两步滴定法测定阿司匹林的含量。（2分）
两步滴定法系指测定过程分两步进行：第一步中和制剂中的酸性水解产物和酸性稳定剂（同时中和阿司匹林的游离羧基）；第二步水解与滴定，即水解后剩余量滴定法。（1分）中和：加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）振摇，使阿司匹林溶解，加酚酞指示液，用氢氧化钠滴定液滴定至溶液显粉红色。（1分）
水解与滴定：在中和后的供试品溶液中，精密加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热水解后，用硫酸滴定液回滴定。（1分）
第6页（共17页）
第7页（共17页）
53. 对乙酰氨基酚中硫酸盐的检查
取本品2.0 g ，加水100 mL ，加热溶解后，冷却、滤过，取续滤液25 mL ，依法检
查（附录Ⅷ B ），与标准硫酸钾溶液1.0 mL （100 μg/mL S O 4）制成的对照液比较，
不得更浓。计算硫酸盐的限量。
53. 解：c = 1×10-4 g/ mL （1分）
V = 1 mL （1分） S = 2.0 g×10025=0.5 g （1分）
根据=L s cv ×100%（2分）得：L =0.02%（1分）
54. 甲氧苄啶片（标示量为50 mg ）含量测定：取本品20片，精密称定为1.2003 g ，
研细，精密称取0.05783 g 置250 mL 容量瓶中，加稀醋酸约150 mL ，充分振摇使
甲氧苄啶片溶解，加稀醋酸稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL ，置
100 mL 容量瓶中，加稀醋酸10 mL ，加水稀释至刻度，摇匀。按照紫外可见分光
光度法（附录Ⅳ A ），在271 nm 波长处测定吸光度为0.420。另取甲氧苄啶对照品
0.05134 g ，同法测定，在271 nm 波长处测定吸光度为0.416。计算甲氧苄啶的标
示量百分含量。
54. 解：本法为对照品法。
100
1025005134.0?=R c （g/mL ）（1分） X A =0.420（1分）
R A =0.416（1分）
10100250?
=D （mL ）（1分） 20
2003.1=-W （1分） W =0.05783 g （1分）
B=5?10- 2 g （1分）
第8页（共17页）
()%100%x ?????=-B
W W D A A c R R 标示量（1分） %10010
505783.010*********.0420.010010250
05134.02???????=-（1分）
55. 根据以下药物的结构，用碘量法测定含量（包括反应方程式，使用溶剂或试
剂及其目的，滴定剂，使用指示剂及滴定终点判断方法，取样量范围，并写出测
定操作过程）。
55. 答：（1）原理：（3分）
（2）溶剂、试剂及目的
① 新沸过的冷水：其目的是为了减少水中的氧对测定的影响。（1分）
② 稀醋酸：在稀HAc 酸性下进行滴定的目的是使维生素C 受空气中氧气氧化的速度减慢。（1
第9页（共17页）
分）
③ 滴定剂：I 2（0.05mol/L ）。（1分）
④ 指示剂及终点：淀粉指示剂。终点至溶液显蓝色并在30秒内不褪色。（1分）
⑤ 取样量计算：T=0.05×1×176.13=8.806 mg/mL （1分）
按消耗滴定液20~25 mL 计算：
W 1=V ×T=20 mL ×8.806 mg/mL =176.1 mg=0.1761g W 2=V ×T=25 mL ×8.806 mg/mL =220.2 mg=0.2202g
故取样范围=0.1761~0.2202 g 。
（6）测定操作过程：取本品0.1761~0.2202 g ，精密称定，加入新沸过的冷水100 mL 与稀醋
酸10 mL ，使本品溶解，加淀粉指示液1 mL ，立即用碘滴定液（0.05mol/L ）滴定，至溶液显
蓝色并在30秒内不褪色。（4分）
1. 药物的纯度是指（ B ）
A . 药物中有效成分的含量
B . 药物的纯净程度
C . 药物中杂质的量
D . 药物中有效成分和杂质的量
E . 以上均不是
2. 中国药典凡例规定：称取“2.0 g ”，系指称取重量可为（ D ）
A . 1.5～2.5 g
B . 1.6～2.4 g
C . 1.45～2.45 g
D . 1.95～2.05 g
E . 1.96～2.04 g
3. 按药典规定，精密标定的滴定液（如盐酸及其浓度）正确表示为（ B ）
A . 盐酸滴定液（0.1520 M ）
B . 盐酸滴定液（0.1520 mol/L ）
C . 0.1520 mol/L 盐酸滴定液
D . 0.1520 M 盐酸滴定液
E ．盐酸滴定液（0.1520 mol L -1）
4. 检查某药品杂质限量时，称取供试品W (g)，量取标准溶液V (mL)，其浓 度为C (g/mL)，则该药的杂质限量(%)（ D ）
A . %100?C VW
B . %100?V CW D . %100?CV
W D . %100?W VC E . %100?VW
C 5. 硫代乙酰胺法检查重金属时，受溶液pH 影响较大，适合的pH 是（ C ）
A . 11.5
B . 9.5
C . 3.5
D . 1.5
E . 9.5
6. 药物中无效或低效晶型的检查可以采用的方法是（ B ）
A.高效液相色谱法
B.红外分光光度法
C. 气相色谱法
D.原子吸收分光光度法
E. 紫外-可见分光光度法
7.下列药物中，不能发生三氯化铁反应的是（ D ）
A.二氟尼柳
B.阿司匹林
C.吡罗昔康
D. 吲哚美辛
E. 对乙酰氨基酚
8.直接酸碱滴定法测定双水杨酯原料含量时，若滴定过程中双水杨酯发生水解反应，对测定结果的影响是（ A ）
A.偏高
B.偏低
C.不确定
D. 无变化
E. 与所选指示剂有关
9.下列药物中，可显Rimini反应的是（ E ）
A.盐酸多巴胺
B.氧稀洛尔
C.苯佐卡因
D. 对氨基苯甲酸
E. 重酒石酸间羟胺
10.下列药物中，ChP直接用芳香第一胺反应进行鉴别的是（C ）
A.盐酸利多卡因
B.乙酰氨基酚
C.盐酸普鲁卡因
D. 盐酸丁卡因
E. 盐酸去氧肾上腺素
11.盐酸普鲁卡因中需检查的特殊杂质是（ D ）
A.水杨酸
B.对氨基酚
C.有关物质
D. 对氨基苯甲酸
E. 酮体
12.下列药物中，可在氢氧化钠碱性条件下与铅离子反应生成白色沉淀的是（ C ）
A.司可巴比妥
B.异戊巴比妥
C.硫喷妥钠
D. 戊巴比妥
E. 苯巴比妥
13.2位含氟取代基的吩噻嗪类药物经有机破坏后在酸性条件下与显色剂反应显色，所用的显色剂是（ E ）
A.三氯化铁
B.亚硝基铁氰化钠
C.茜素磺酸钠
D. 2，4-二硝基氯苯
E. 茜素锆
14.以下药物没有旋光性的是（ B ）
A.氢溴酸东莨菪碱
B.阿托品
C.丁溴东莨菪碱
D. 甲溴东莨菪碱
E. 氢溴酸山莨菪碱
第10页（共17页）
15.可与2，6-二氯靛酚试液反应的药物是（C ）
A.维生素A
B.维生素B1
C.维生素C
D.维生素D
E.维生素E
16.维生素B1原料药的含量测定方法是（ A ）
A.非水溶液滴定法
B.碘量法
C.酸碱滴定法
D.双相滴定法
E.酸性染料比色法
17.具有6-APA母核的药物是（A ）
A.青霉素钠
B.硫酸庆大霉素
C.盐酸土霉素
D.盐酸四环素
E.头孢克洛
18. 可用糠醛反应（Molisch反应）鉴别的药物是（ B ）
A.青霉素钠
B.庆大霉素
C.盐酸四环素
D.头孢拉定
E.盐酸美他环素
19.含量均匀度检查主要针对（A）
A.小剂量的片剂
B.大剂量的片剂
C.水溶性药物的片剂
D.难溶性药物片剂
E.以上均不对
20.以淀粉、糊精等作为稀释剂时，对片剂的主药进行含量测定，最有可能受到干扰的测定方法是（ B ）
A. EDTA滴定法
B.氧化还原滴定法
C. HPLC法
D. GC法
E.酸碱滴定法
A. BP
B. ChP
C. EP
D. Ph.Int.
E. USP
下列药典的英文缩写是
21.英国药典A
22.欧洲药典C
[23-26]
A.硝酸银试液
B.硫代乙酰胺试液
C.氯化钡试液
D.盐酸、锌粒
E.硫氰酸铵试液
下列杂质的检查所用到的试剂是
23. 铁盐E
24. 硫酸盐C
第11页（共17页）
25. 氯化物A
26. 砷盐D
[27-28]
A.对氨基酚
B.游离水杨酸
C.二聚体
D.氯化物
E.以上均不是
以下药物中存在的特殊杂质是
27.阿司匹林B
28.对乙酰氨基酚A
[29-30]
A.重氮化-偶合反应
B. Vitali反应
C.麦芽酚反应
D.硫色素反应
E.与三氯化铁呈色反应
以下药物的特征鉴别试验是
D29.维生素B1
B30.氢溴酸山莨菪碱
31.《中国药典》内容包括（BCD ）
A.前沿
B.凡例
C. 正文
D.附录
E.索引
32.中国药典规定“熔点”系指（CDE ）
A.供试品在毛细管内收缩时的温度
B.固体全熔呈透明液体时的温度
C.固体熔化时自初熔至全熔的一段温度
D.固体熔融同时分解的温度
E.固体熔化成液体的温度
33.盐酸去氧肾上腺素常用的鉴别反应有（BC ）
A.重氮化-偶合反应
B.三氯化铁显色反应
C.双缩脲反应
D. 氧化反应
E. Rimini反应
34.非水碱量法最常使用的试剂有（ABCE ）
A.冰醋酸
B.高氯酸
C.结晶紫
D.甲醇钠
E.醋酸汞
35.采用两步酸碱滴定法测定阿司匹林片含量的目的是（ABD ）
第12页（共17页）
A. 消除稳定剂（枸橼酸或酒石酸的干扰）
B.消除空气中二氧化碳的干扰
C.消除空气中氧气的干扰
D.消除水解产物（水杨酸、醋酸）的干扰
E.便于操作
36.下列药物中，可采用亚硝酸钠滴定法测定含量的有（CD ）
A.苯巴比妥
B.盐酸丁卡因
C.苯佐卡因
D.盐酸普鲁卡因胺
E.盐酸去氧肾上腺素
37.氢溴酸东莨菪碱中其他生物碱的检查方法是（BE ）
A.水溶液加入氨试液产生浑浊
B.水溶液加入氨试液不得发生浑浊
C.加入氢氧化钾试液则有浑浊
D.加氢氧化钾试液无浑浊
E.加氢氧化钾试液数滴，只发生瞬即消失的类白色浑浊
38.维生素E的鉴别方法有（ACE ）
A.硝酸反应
B.三氯化锑反应
C.三氯化铁反应
D.硫色素反应
E.紫外光谱法
39.具有旋光性的抗生素类药物有（ABCDE ）
A.盐酸四环素
B.头孢苄氨
C.氨苄西林钠
D.盐酸土霉素
E.硫酸庆大霉素
40.药物制剂的检查中，以下说法正确的有（CE ）
A.杂质检查项目应与原料药的检查项目相同
B.杂质检查项目应与辅料的检查项目相同
C.除杂质检查外还应进行制剂方面的常规检查
D.不再进行杂质检查
E.杂质检查主要是检查制剂生产、贮存过程中引入或产生的杂质
41.（×）42.（×）43.（×）44.（√）45.（×）46.（√）47.（×）48.（√）49.（×）50.（√）
第13页（共17页）
41.旋光度是药物的物理常数。（×）
42.“恒重”指连续两次干燥或炽灼后称重的差异在0.5 mg以下的重量。（×）
43.采用水解后剩余量滴定法测定阿司匹林含量时，需进行空白试验校正，其目的是消除空白溶剂中杂质有机酸的影响。（×）
44.某些苯乙胺类药物分子结构中具有邻苯二酚（或酚羟基）结构，可与重金属离子配位呈色。（√）
45.重氮化反应速度的快慢与芳伯氨基的碱性强弱有关，碱性强反应速度就快。（×）
46. 莨菪烷类抗胆碱药物是由莨菪烷衍生的氨基醇与不同有机酸缩合成酯的生物碱。（√）
47. 硫色素荧光反应为维生素B1的专属性反应，是测定维生素B1原料药的首选方法。（×）
48. β-内酰胺类药物的β-内酰胺环不稳定，易水解开环。（√）
49. 维生素C分子中的烯二醇基具极强的还原性，易被氧化为二酮基而成为无生物活性的去氢抗坏血酸。（×）
50. 凡规定检查溶出度的制剂，不再检查崩解时限。（√）
51.简述古蔡法检查砷的原理以及加入醋酸铅棉花、酸性氯化亚锡和碘化钾的作用。
答：（1）原理：利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具有挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，（1分）与同等条件下一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判断药物中砷盐的限量。（1分）（2）加入醋酸铅棉花作用：吸收供试品及锌粒中可能含有少量的硫化物在酸性条件下产生的硫化氢气体，避免其与溴化汞作用产生硫化汞色斑干扰测定结果。（1分）
（3）加入酸性氯化亚锡和碘化钾作用：
①还原As5+为As3+（1分）
②抑制SbH3的生成（1分）
③形成锌锡齐，加快反应速度（1分）
52.亚硝酸钠滴定法测定芳胺类药物的原理是什么？在测定中应注意哪些反应条件？
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答：测定的基本原理是芳伯氨基或水解后生成芳伯氨基的药物在酸性溶液中与亚
硝酸钠定量发生重氮化反应，生成重氮盐，可用永滴定法指示终点。（2分）重氮
反应的速度受多种因素的影响，亚硝酸钠滴定液及反应生成的重氮盐也不够稳定，
因此在测定中应注意以下主要条件：
（1） 加入适量溴化钾加快反应速度。（1分）
（2） 加过量盐酸加速反应。（1分）
（3） 反应温度：滴定一般在低温下进行。（1分）
（4） 滴定速度：重氮反应速度相对较慢，故滴定速度不宜太快。（1分）
六、计算题 （本题2小题，53 题6分，54 题10分，共16分）
53. 取乙酰唑胺2 g ，加水100 mL 加热溶解后，迅速放冷，滤过，取滤液25 mL ，
依法检查氯化物，规定含氯化物不得超过0.014%，应取标准氯化钠溶液（每1 mL
相当于0.01 mg Cl -）多少mL ？
53. 解：c = 1×10-5 g/ mL （1分） S = 2 g×10025=0.5 g （1分）
L = 1.4×10-4（1分）
根据=L s cv ×100%（2分）
得：V =%
100??c S L = 7 mL （1分）
54. 司可巴比妥钠原料药含量测定：取本品0.1022 g ，置250 mL 碘瓶中，加水10
mL ，振摇使溶解，精密加溴滴定液（0.05 mol/L ）25 mL ，再加盐酸5 mL ，立即密
塞并振摇1分钟，在暗处静置15分钟后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10 mL ，
立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液（0.1038 mol/L ）滴定，至近终点时，加
淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白试验校正。每1 mL 溴滴
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定液（0.05 mol/L ）相当于13.01 mg 的C 13H 17N 2NaO 3。按干燥品计算，含C 13H 17N 2NaO 3不得少于98.5%。已知样品消耗硫代硫酸钠滴定液（0.1038 mol/L ）15.73 mL ，空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液（0.1038 mol/L ）23.21 mL 。
54. 解：0
B V =23.21 mL （1分） S B V =15.73 mL （1分）
T =13.01（mg/mL ）（1分）
1
.01038.0=F （1分） W =0.1022 g （1分）
()%100)(%0???-=W
T F V V A B S B B 含量（2分） %1001022
.01001.131.01038.0)73.1521.23(3????
-=
-（1分） =98.8%（1分）
测定结果大于98.5%，故本品含量合格。（1分）
七、设计题 （本题12分）
55. 已知普鲁卡因的结构式如下，请根据药物的结构设计三种鉴别方法。
55. 答：（1）重氮化-偶合反应。取供试品约50 mg ，加稀盐酸1mL ，必要时缓缓煮沸使溶解，放冷，加0.1 mol/L 亚硝酸钠溶液数滴，滴加碱性β-萘酚试液数滴，
生成橙黄色到猩红色沉淀。（4分）
（2）水解产物的反应。普鲁卡因具有氨基苯甲酸酯的结构，加热可水解，产生挥发性二乙氨基乙醇，能使湿润的红色石蕊试纸变为蓝色；同时产生对氨基苯甲酸，为不溶于水的白色沉淀。（4分）
（3）红外吸收光谱。主要特征峰如下：3315 cm-1、3200 cm-1伯胺中N—H产生的伸缩振动；1645 cm-1N—H的弯曲振动；1604 cm-1、1520 cm-1为苯环上C=C 伸缩振动；1692 cm-1为C=O伸缩振动；1350～1250 cm-1为芳胺中C—N伸缩振动；1300～1000 cm-1为酯基中C—O伸缩振动。（4分）
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举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
DNA-蛋白质相互作用的研究方法2008-02-21 12:21一、凝胶阻滞试验 1.试验原理 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2.主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。 其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE 分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原
Thermo Scientific Pierce Th S i tifi Pi
蛋 蛋白相互作用的研究方法和实践 实
罗 莎 Rosa Luo Ph.D. Application Scientist Biosciences Division Thermo Fisher Scientific China
酵母蛋白质相互作用图谱
Thick blue lines represent literature-derived interactions from PreBIND+MIPS in the HMS-PCI dataset. Thin orange lines represent potential novel interactions. Courtesy MDS Proteomics
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蛋白质相互作用技术
Genetic Two Hybrid Phage Display Mutational analysis M t ti l l i Biochemical Immunoprecipitation (IP) Co-Immunoprecipitation (C IP) C I i it ti (Co-IP) Pull-Down Assays Far Western FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Chemical Crosslinking Label-transfer FeBABE F BABE mapping i Fluorescent Immunofluorescence colocalization
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?技术与方法? 生物技术通报 B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N 2006年增刊 蛋白质相互作用研究方法及其应用 王海波 安学丽 张艳贞 王爱丽 李巧云 晏月明 (首都师范大学生命科学学院,北京 100037) 摘 要: 过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。 关键词: P DT Y2H T AP FPET SPR Approaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi es W ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing (College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037) Ab s tra c t: W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2 teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced . Key wo rd s: P DT Y2H T AP FPET SPR 作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@https://www.doczj.com/doc/0818197300.html, 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 1 噬菌体展示技术(P DT ) 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人 [1] 将R I 核酸内切酶基因片段 连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott 等人 [2] 利用噬菌体展示技术构建了随机多
检测蛋白之间相互作用的方法 酵母双杂交技术 实验目的 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain AD).GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 试验流程
酵母双系统正是利用GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为： 1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。 3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中 4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。 1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。 2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。 3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 GST-Pull Down技术 实验原理 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST 与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离.
研究蛋白质的相互作用的方法 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附 上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术
蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.doczj.com/doc/0818197300.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。 六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用[/url]的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三
蛋白质-蛋白质相互作用 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之 间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂 交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间 的相互作用。 四、荧光能量转移技术
研究蛋白质与DNA相互作用的主要方法 一、引言 在许多的细胞生命活动中，例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。 重组DNA技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要： a、鉴定分析参与基因表达调控的DNA元件； b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子； 这些问题的研究都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用。 研究DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括： a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验； c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验；f、拉下实验。 二、凝胶阻滞实验 1、概念： 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），要叫做DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay）是在八十年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 2、原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果某种DNA分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基本原理。 3、过程: 首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子） 用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子的结合位点） 这种被标记的探针DNA同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生DNA-蛋白质复合物 在控制使DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 最后进行放射自显影，分析电泳结果 4、实验结果的分析： a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针DNA相互结合的转录因子蛋白质；
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用 ① FRET技术（in vivo） FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示： 以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。 ②酵母双、三杂交技术（in vivo） 酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。 一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示： 如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。 将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。 酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示： 如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。 ③ Pulldown技术（in vitro） Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。
蛋白质相互作用的主要研究方法
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A 或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆