微生物基因敲除技术分析
牟福朋 20071401105
山东大学生命科学学院
摘要：基因敲除技术是上个世纪80年代出现的新型分子生物学实验技术。到现在经过近30年的发展，已经出现了很多前沿技术。微生物由于它本身特有的性质一直成为基因敲除的热点。本文主要考察基因敲除技术的现状及其发展方向，并对基因敲除的应用提出自己的观点。关键词：基因敲除微生物前沿进展
一常规基因敲除
1 常规基因敲除的步骤
基因敲除的一般流程见图1。用引物扩增目的基因之后，使用内切酶切开基因，连入有相同粘性末端的抗生素基因如四环素抗性基因或者报告基因例如lacZ等；将载体转化入目的菌内，通过筛选，筛选出含有标记基因的菌株，然后要通过PCR等进行复证。
使用双标记法可以判断发生交换的次数。如果只发生第一次重组，则两个标记都会被插入宿主DNA中；而若发生了两次重组，则阴性标记会被丢失，细菌要么是野生型的，要么能检测到阳性标记。
图1 常规基因敲除的主要流程和机理
2 常规基因敲除的成功率分析
首先，DNA的同源重组频率不是很高。况且，此处要求发生两次同源重组，这使得重组概率大大下降。加长两端的同源序列有助于重组，但这样一来内切酶效率就得不到保证。这一问题解决的方法，主要是进行大量的培养，实验中，往往可以得到较多的敲除子。
第二，图中可以看出，在第一次重组和第二次重组之间，由于敲出基因载体的整个插入，基因仍然有一部分是完好的（载体的一段和宿主的另一端融合而成）。解决这一问题的方法已如前述：即引入两个标记。
3 常规基因敲除的主要缺点
①速度慢，效率低。基因敲除需要一般的基因工程方法来进行转化和表达，周期较长，在这个过程中载体是关键；
②对细胞感受态要求较高。基因敲除和普通基因工程相比，有一定的不同：因为目的基因必须采用特殊载体装载，保证转化率很关键。对于这一点，现在可以采用基因枪法或者电转化来解决。
③基因敲除对于酵母、丝状真菌等真核微生物研究较少，主要原因是对于一般的转化方法，对于真核生物转化不容易；而且在真核生物中，表达周期要更长，因此效率要更低；真核生物基因调控的手段很复杂，即便是进行了敲除之后，由于某些原因，可能并不表现一定的形状，导致敲除失败。
二常规基因的改进方法
1 基因捕获
基因捕获是功能基因组学的研究方法，本来应用于表达基因的寻找。但它本身的操作方法可以用来构建基因敲除体系。它的主要机制如下图所示。
图2 基因捕获的机制
以带有报告基因的基因捕获载体转化到细胞中。由于这一序列本身不含有启动子，所以只有转化到有启动子的（能够表达的）DNA序列上，也就是只有转化到基因里，才能够表达报告基因。结合cDNA文库和DNA芯片，由此便可以报告一个功能基因的位置。
如果采用大量的转化载体和大量的细菌细胞进行实验，则可以得到很多随即插入序列的不同细胞。类似于CDNA文库那样，这一系列的细菌便可以作为一个体系。
因此，基因捕获也可以当做基因敲除文库来使用。原核生物，例如大肠杆菌，功能基因的数量远不如真核生物多。因此，原本用于真核生物的基因捕获在原核生物的应用就变得特别容易。现在，已经得到了基因捕获体系的大肠杆菌文库，可以进行很多细菌分子生物学实验和分析。
2 基因捕获的优缺点
基因捕获的主要优缺点是并存的，那就是它只能够敲除表达的基因（事实上是所有基因都能被敲除，但是只能够报告出表达的基因），这一方面为筛选带来了方便，另一方面又难以对深入的调控问题做研究。
3 线形转化敲除法
1998年,Murphy等报道了利用λ噬菌体的线性Red同源重组系统获得高重组率。Red 系统主要包含3种蛋白质分子,分别称为Exo、Beta和Gam，这三者是λ噬菌体中的高效重
组蛋白质。采用这样的转化体系时，宿主DNA被直接切断，转化基因直接插在切口中。因此，这种转化效率是很高的，可以用来弥补基因敲除需要两次重组的低效率。
线性转化进行基因敲除的方法还有一个有点就是需要的同源序列很短，只有50-60bp，可以进行人工合成，繁琐的酶切和连接。
此外，尚有结合转化敲除法以及温度敏感型质粒敲除法等，转化效率和实验进行速度都比常规敲除有了很大提高，更适合于微生物场合下的基因敲除。新兴敲除技术的出现使得微生物分子生物学研究处在了新的历史舞台上，结合微生物研究本身的特点，一定能够成为新知识、新技术的诞生地。
三特殊场合的基因敲除技术
1基因条件敲除技术
基因条件敲除可以研究某些基因在微生物发育的不同阶段，或者不同的生长时期的表达情况，或者在发育生物学中进行基因表达的研究。关于这方面的技术，目前有报道的还很少，但是这种技术在研究实践中一定有很广阔的应用前景。目前，对基因的条件敲除技术有一些报道。他们主要应用的基因敲除体系是四环素诱导的基因敲除方法。
图3 基因敲除的四环素诱导法。
将tTA整合到宿主DNA上之后，再以基因转运的方式将原基因带回宿主内，前边加上了依赖四环素转录激活子tTA转录起始位点。须要基因敲除时，只需要向体系中添加四环素，则tTA蛋白构象发生变化，失去启动转录的活性，被沉默的目的基因就不能表达。于是便实现了人工控制时间的条件基因沉默。
对比原来常规的基因沉默技术来说，基因条件沉默并不是直接将原来的基因一味地破坏掉，而是相当于对基因启动子的人工开启或者关闭，相对而言，这更接近于字面意义的“沉默”。这一沉默方法极大地方便了发育生物学和对人类疾病病理和发展进程的生物学研究。
2 基因自敲除技术和基因链锁敲除技术
与条件敲除相类似，基因自敲除技术是使用细胞内部已知的产物，通过细菌自身的操纵
子的作用进行的基因敲除。这种基因敲除还可以连锁进行，可以用来研究细胞对于外界环境作出反应时都调用了哪些基因，以及一效多因的研究。
3基因定向敲除技术
所谓基因定向敲除，就是在基因敲除过程中，尤其是在基因捕获的过程中，对于所要敲除的基因减少了随机性，而是在一些插入热点的地方进行基因的敲除。这样一来，基因敲除减少了盲目性。
四 RNAi技术
RNA干扰是近几年来研究的热点之一。RNA干扰采用小的mRNA，它的序列和已知有功能的基因转录出的mRNA能形成互补双链区，导致RNA不能被核糖体识别而不能转录，所以只能被降解。
在原核生物如大肠杆菌中，基因的转录和翻译是同时进行的。传统的基因敲除是直接将基因破坏掉了，这样不容易在同一体系中同时判断该基因的其他功能，做研究是需要很多平行试验，很费时费力。RNAi的出现，使得在不破坏目的基因的情况下敲除目的基因变得容易。只要知道目的基因的mRNA序列，就可以设计DNA片段，编码一个反义的RMA，将这个DNA以载体转化至宿主细胞，就可以将所要敲除的DNA从表达谱上掩盖掉。
这种敲除没有对原来的基因做出改动，因而目的基因在细胞内是完好存在的。如果配上可以调控表达的体系，那么就可以人为调整反义基因的表达量或者是否表达，从而可以在一个体系中对目的基因进行开关。因此，反义基因也被称作是“按钮”。
一个应用的例子是在不同菌体内基因表达环境下大肠杆菌的蛋白质组差异分析。使用RNAi沉默了一些奢侈基因和一些持家基因，然后在沉默条件下和不沉默条件下，还有几个基因的共沉默条件下，提取了细胞的蛋白质组和mRNA组，进行了比对研究，发现了很多原先不知道的调控机理，已经几个基因之间相互作用中，起作用的其他基因的表达情况。同样的还有采用单次性敲除的方法研究代谢途径变化的方法。单次性敲除即为向细菌菌体中一次性添加过量某目的基因的反义mRNA的方法。这种方法的特点在于可以瞬时将细菌中某基因的表达降低到零，这种条件下，细菌会有很多非同寻常的反应，这也是目前基因敲除和功能基因组学研究前沿的方向之一。
RNA在基因沉默的应用也不是没有缺点。主要缺点是序列必须已知，反义DNA必须人工合成，对于较大的蛋白质来说，人工合成反义基因不容易。其次是基因沉默的时效性和遗漏。如果反义DNA的转录量不够，那么很容易发生遗漏。
五对基因敲除一些想法
基因敲除和基因沉默的不同之处在于，基因沉默的机制在于沉默子的作用和调节。基因敲除的目的是让目的基因的表达降为零，这可以通过多个层面来实现，也即基因表达调控的七个层面：转录、终止、转录后调控、mRNA寿命、翻译、翻译后调控、酶活性调控等。在这里面的每一个层次其实都应该是基因敲除的考虑层次。之前的基因沉默的目光聚集在前两个层次，而RNAi的基因沉默则主要体现在翻译层次。其实其他的层次的敲除也应该是可行的，而且相对于常规基因敲除来说会有很多意想不到的实验结果，并且可以出现很多之前从未见过的实验技术。因此，我认为基因敲除技术的发展，应该思路在宽一些，而不是只在几个层面上进行。总的来说，基因敲除技术现在得到了非常广泛的应用，但是人们对它的改进和研究还是做得不够。而且基因敲除有一个致命的硬伤，就是不得不承认很多情况下将一
个基因从菌体中敲除之后，并没有引起什么变化和改变。基因复杂的表达和调控机制仍然是一个谜，基因之间的合作关系更是难以预料，关于这一点，人们所知甚少、例如，在基因捕获的过程中，曾报道过将酵母菌40%的基因沉默掉，酵母菌仍能够正常生长；大肠杆菌的致命基因（缺失或突变之后不能在完全培养基上生长的基因）可能只有总基因组的10%左右。基因的表达制约着人们对它真实面目的研究。但是坚信人们有一天会解开生物界最终秘密的。
参考文献：
1谢承佳,何冰芳,李霜，基因敲除技术及其在微生物代谢工程方面的应用。生物加工过程第5卷第3期，2007年8月
2 王又红基因敲除技术的应用现状与发展前景国外医学1999 26-5
3张勇，赵南明，刘强，人工调控基因表达。科学通报，第44卷第24期1999年12月声明：本文大部分内容均为本人原创，并非网络抄袭。
基因工程的发展与前景 摘要：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。本文将从基因工程的概况、发展、应用与前景进行介绍和总结。 关键词：基因工程；发展；前景 1 基因工程的概况 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程。 2 基因工程的发展 1860至1870年，奥地利学者孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律。 1909年，丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词，用以表达孟德尔的遗传因子概念。 1944年，3位美国科学家分离出细菌的DNA（脱氧核糖核酸），并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。 1953年，美国人沃森和英国人克里克通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型。 1969年，科学家成功分离出第一个基因。 1980年，科学家首次培育出世界第一个转基因动物转基因小鼠。 1983年，科学家首次培育出世界第一个转基因植物转基因烟草。 1988年，K.Mullis发明了PCR技术。 1990年10月，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。 1994年，中科院曾邦哲提出转基因禽类金蛋计划和“输卵管生物反应器
第九章微生物与基因工程 计划学时：2 重点：基因工程的基本操作过程，基因工程的应用。 一、基因工程的发展历史 基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。 早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。 1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。 1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。 1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。 二、基因工程的基本过程 生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤： ①分离或合成基因； ②通过体外重组将基因插入载体；
微生物基因组研究 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、 环保等诸多领域。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50％是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。 微生物间的相互作用机制也相当奥秘。例如健康人肠道中即有大量细菌存在，称正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。 随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在分子水平上研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学来说是一场革命。 以人类基因组计划为代表的生物体基因组研究成为整个生命科学研究的前沿，
转基因技术 一、发展过程 转基因植物技术始于20世纪70年代初，最早进行转基因食品研究的是美国，世界上第一例进入商品化生产的转基因食品是1994年投放美国市场的可延缓成熟的转基因番茄。进入21世纪以后，全世界转基因作物种植发展异常迅速，1998年全球转基因植物种植面积仅2780hm2（公顷）。美国最多，占74%；中国不到1%。转基因植物按种植面积多少排序为大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯。转基因性状主要是抗除草剂和抗虫，分别占77%和22%。1999年全球转基因植物种植总面积达4000hm2，其中美国、加拿大、阿根廷三国占99%，此外中国、印度等国也有一定量的种植。 2002年，全世界转基因作物种植总面积为5870hm2，主要生产国为美国、阿根廷、加拿大、中国。主要农作物有：抵抗昆虫的玉米，抵抗杀虫剂的大豆，抵抗病虫害的棉花，富含胡萝卜素的水稻，耐寒抗旱的小麦，抵抗病毒的瓜类和控制成熟速度及硬度的西红柿等等。 二、优缺点 优点：转基因食品有较多的优点：可增加作物产量；可以降低生产成本；可增强作物抗虫害、抗病毒等的能力；提高农产品耐贮性。例如：转基因食品土豆；缩短作物开发的时间；摆脱四季供应；打破物种界限，不断培植新物种，生产出有利于人类健康的食品。 缺点：转基因食品也有缺点：所谓的增产是不受环境影响的情况下得出的，如果遇到雨雪的自然灾害，也有可能减产更厉害。同时在栽培过程中，转基因作物可能演变为农田杂草；可能通过基因漂流影响其他物种；转基因食品可能会引起过敏等。 三、根据转基因食品来源的不同可分为如下三种不同类型： （1）植物性转基因食品。所谓植物性转基因食品，是指以含有转基因的植物为原料的转基因食品。培育出高产、抗虫、抗病、抗逆、生长快、高蛋白的基因改良植物。木瓜：据悉，市场上卖的95%以上的木瓜都是，这或许出乎很多人的想象。大豆及豆制品：（包含大豆油）非转基因大豆：椭圆形，稍扁。肚脐为浅褐色。豆大小不一。打出来的豆浆为乳白色。转基因大豆：滚圆形。肚脐为黄色或黄褐色。豆大小相近。打出来的豆浆淡黄，用此豆制作的豆制品都有点黄色。部分水稻及大米：在国内取得转基因大米合法种植权的地区是湖北，细长的很亮的米有可能为转基因大米。容易与东北“长粒香”混淆。玉米及玉米油：2011年国内转基因棉花种植比例高达71.5%，国内批准的国产转基因棉花品种太多，至少数百。转基因玉米：甜脆、饱满、体形优美、头尾颗粒差不多，俗称甜玉米（但是并非所有的甜玉米都是转基因的），全部进口玉米基本都为转基因玉米。转基因玉米油：在超市购买玉米油时，可以查看标签分辨是否为转基因玉米油。菜籽及菜籽油：转基因菜籽出油率高，目前国家已经确认的是黄籽油菜渝黄1号和2号。非转转基因菜籽是指我国原先有的一些菜籽品种，这种菜籽产量低，出油率也低。白菜及辣椒等：福山大包头，这是国家目前已经确认含有转基因的白菜品种。 （2）动物性转基因食品。所谓动物性转基因食品，是指以含有转基因的动物为原料的转基因食品。动物的转基因食品，主要是利用胚胎移植技术培养生长速率快、抗病能力强、肉质好的动物或动物制品。截至2013年，生长速率快、抗病力强、肉质好的转基因兔、猪、鸡已经问世，生长激素基因，导入黑龙江野鲤，选育出了“超级鲤”。另外，有人将疫苗的基因转移入羊的乳腺，使这些产物随乳汁而分泌，比用工程茵生产成本更低、产量更大。999年2月19日下午2时15分诞生的中国首例转基因试管牛“陶陶”，产奶量可望高达10000kg，比山羊高20多倍。 （3）微生物转基因食品。所谓微生物转基因食品，是指以含有转基因的微生物为原料的转基因食品。转基因微生物食品，主要是利用微生物的相互作用，培养一系列对人类有利的新物种。20世纪80年代中期，猪、牛等胰岛素、干扰素、生长素基因克隆人微生物，“工程菌”推入市场，开创了微生物生产高等动物基因产物的新途径。 四、国内现状 2006年3月20日开始实施的《农业转基因生物标识管理办法》，只要求被列入目录的转基因生物产品必须进行标识。 在一些超市中发现，很少有食品标注“转基因产品”或“以转基因原料制成”等标识。有些产品倒是在精
微生物基因组研究进展及其意义 近年来，病原微生物的基因组研究取得了飞速的进展。所谓基因组研究是指对微生物的全基因进行核苷酸测序，在了解全基因的结构基础上，研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能。由于过去人们大多从表型分析入手，寻找已知功能的编码基因，实际只了解微生物中极少数的基因，如链球菌的链激酶基因、结核杆菌编码的热休克蛋白基因等。还有大量未知基因未被发现。通过基因组研究，则从根本上揭示了微生物的全部基因，不仅可发现新的基因，还可发现新的基因间相互作用、新的调控因子等。这一研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。此外，新发现的微生物酶及蛋白还可能有在工农业生产上的应用价值。因此，全球除已完成了70余株覆盖重要病毒科的病毒代表株全基因组研究外，据美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）报道，目前已完成了19种微生物基因组测序，其中11种与人类及疾病相关（嗜血流感杆菌，生殖道支原体，肺炎支原体，幽门螺杆菌，枯草杆菌，伯氏疏螺旋体，结核杆菌，梅毒螺旋体，沙眼衣原体，普氏立克次体）。另外，还有40余种微生物已被登记正在进行测序，预计在1999～2000年完成〔1〕。 病毒基因组研究进展 病毒因其基因组小，是进行基因组研究最早的生物体。早在1977 年已完成了噬菌体DNA的全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中的SV40，是最早完成全基因测序的与疾病相关的病毒；此后，许多病毒均已完成了全基因测序，并根据序列的开放阅读框架（ORF）对编码蛋白进行了推导。已对相当一些病毒蛋白进行了重组表达，还对一些病毒基因编码的调控序列进行了研究。除一般大小的病毒已完成了基因组测序，对大基因组病毒，疱疹病毒科，如水痘病毒基因组为0.125Mb(Mega-basepair,兆碱基对)〔2〕。巨细胞病毒，基因组为0.229Mb〔3〕。我国已对痘苗病毒天坛株（约0.2Mb）进行了全基因测序，发现与国外的痘苗毒株序列有明显的差异〔4〕。我国还对甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒进行了国内毒株的全基因测序。近来还对国内2株发现的虫媒病毒毒株完成了全基因测序。我国从不同来源的标本中发现了不少乙肝病毒变异株，有的具有特殊的生物学特性〔5〕。对病毒基因中调控因子的分析，发现了与乙肝病毒增强子作用的新细胞核因子〔6〕。 因此，目前对病毒的基因组研究已进入了后基因组阶段，即从全基因水平研究病毒的生物学功能，同时发现新的基因功能。对于医学病毒学当前主要方向是研究病毒基因组中与致病及诱生免疫应答相关的基因，从而揭示和解决迄今尚未解决的问题，以达到控制或消灭一些重要病毒感染的目的。 建议目前可进行后基因组研究的领域为： 1．病毒持续性感染：基因组中与持续性感染相关的基因，基因变异或调控因子研究。已报道的乙肝病毒的前核心基因出现终止密码突变，
基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？
(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法
微生物（细菌）全基因组重测序文库构建实验方案 一、重测序原理 全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。 二、技术路线 ↓基因组DNA提取 细菌DNA（纯化） ↓超声波打断 DNA片段化 ↓ 文库构建 ↓Ion OneTouch 乳液PCR、ES ↓Ion PGM、Ion Proton 上机测序 ↓ 生物信息学分析 三、实验方案 1.细菌总DNA的提取 液氮速冻、干冰保存的细菌菌液：若本实验室可以提供该细菌生长的条件，则对菌液进行活化，培养至对数期时，对该细菌进行DNA提取；若本实验室不能提供该细菌的生长条件，则应要求客户提供尽可能多的样本，以保证需要的DNA量。 细菌DNA采用试剂盒提取法（如TianGen细菌基因组提取试剂盒）。 取对数生长期的菌液，按照细菌DNA提取试剂盒操作步骤进行操作。提取完成后，对基因组DNA进行纯度和浓度的检测。通过测定OD260/280，范围在1.8-2.0之间则DNA较纯，使用Qubit对提取的DNA进行定量，确定提取的DNA 浓度达到文库构建的量。
2.DNA片段化 采用Covaris System超声波打断仪（Covaris M220），将待测DNA打断 步骤： 1）对待打断的DNA进行定量，将含量控制在100ng或者1μg 2）打开Covaris M220安全盖，将Covaris AFA-grade Water充入水浴容器内，至液面到最高刻度线（约15mL），软件界面显示为绿色 3）将待打断DNA装入Ep LoBind管中，其中DNA为100ng或1μg，加入Low TE 至总体积为50mL 4）将稀释的DNA转移至旋钮盖的Covaris管中（200bp规格），转移过程中不能将气泡带入，完成后旋紧盖子 5）选择Ion_Torrent_200bp_50μL_ScrewCap_microTube，将对应的小管放入卡口，关上安全盖，点击软件界面“RUN” 6）打断结束后，将混合液转移至一支新的1.5mL离心管中 3.末端修复及接头连接 3.1 末端修复 使用Ion Plus Fragment Kit进行，以100ng DNA量为例，各组分使用前瞬时离心2s 步骤： 1）加入核酸酶free水至装有DNA片段的1.5mL离心管中，至总体积为79μL 2）向体系中加入20μL 5×末端修复buffer，1μL末端修复酶，总体积为100μL 3）室温放置20min 3.2 片段纯化 片段纯化使用Agencourt AMpure XP Kit进行 步骤： 1）加入180μL Agencourt AMpure XP Reagent beads于经过末端修复的1.5mL离心管中，充分混匀，室温放置5min
转基因技术 编辑 转基因即转基因技术。 转基因技术（Genetically Modified，简称GM），是指运用科学手段，从某种生物体基因组中提取所需要的目的基因，或者人工合成指定序列的基因片段，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有特定的遗传性状个体的技术。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。转基因技术的理论基础来源于分子生物学。人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的同义词（但如今人们对改变原有动植物性状的技术称为转基因技术（狭义），将对微生物的操作称为遗传工程技术（狭义）。经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"（Genetically modified organism，简称GMO）。 目录 1发展历史 2基本技术过程 3分类 人工转基因 植物转基因 动物转基因 微生物基因重组 自然转基因 4转基因技术产物 转基因生物 转基因食品 5技术特点 组合原理 植物 动物 6与杂交的区别 种基根杂交技术 植物杂交 杂交畜牧 7转基因技术现状 转基因食品 技术应用 商业化 8媒体报道 9转基因植物转化方法 农杆菌介导转化 花粉管通道法 核显微注射法 基因枪法 精子介导法 核移植转基因法 体细胞核移植法
10影响 减少温室气体排量 疑问 对环境系统 对生态物种 动物试验 11社会 学者批评 转基因标识法案 12相关事件 动物异常事件 转基因水稻争议 巴西坚果事件 普斯泰事件 转基因玉米事件 俄转基因食品事件 广西迪卡玉米事件 转基因大米试验 实验鼠致癌事件 猕猴喂养实验 律师申请公开遭拒 13批准作物一览 1发展历史 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔医生奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 2基本技术过程 (1)从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段；或者人工合成目的基因。 (2)在体外, 将带有目的基因的DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上, 形成重组DNA分子。 (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞) 。 (4)带有重组体的细胞扩增,获得大量的细胞繁殖体。 (5) 从大量的细胞繁殖群体中,筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。 (6)将选出的细胞克隆的目的基因进一步研究分析,并设法使之实现功能蛋白的表达。 3分类 转基因过程按照途径可分为人工转基因和自然转基因，按照对象可分为植物转基因技术,动物转基因技术和微生物基因重组技术。 人工转基因 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术(Transgene technology)。人们常说的“遗传工
基因工程与微生物 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 一、基因工程的概况 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程 二、基因工程的基本步骤 （1）提取目的基因 获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。 要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。 直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。 目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA 为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
转基因技术 转基因产品（GMOs）是通过基因重组技术获得的基因改良生物及其加工产品。对转基因产品，用转基因产品定性检测方法（qualitative detection）对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。 实时荧光PCR法 是目前最有发展前途的定量检测方法，也是目前最适合出入境检验检疫的检测技术之一。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法可以有效提高检测的准确性和灵敏度。它既能做定性检测，加入标准品也能做定量检测。 酶联检测方法， 应称作酶联免疫吸附测定，是把抗原及抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机地结合而发展起来的,用酶作为标记物或指示剂进行抗原或抗体定性和定量测定的综合技术。试纸条检测方法也是转基因产品抗血清检测方法。这两种方法是中国与美国谷物化学家协会（AACC）联合研究的。中方主要承担转基因玉米和大豆两个品种的抗血清特异性、灵敏度以及定量检测的研究内容。目前，这两种方法已上升为ISO标准，即将发布。其技术创新点为： 研究制定了《基因检验实验室技术要求》，建立了我国口岸系统转基因产品检测实验室体系。建立了转基因产品的亲和诱捕技术，较好解决了DNA提取的技术难点，该方法特别适用于食品和饲料等多组分样品。 建立了精炼植物油和深加工食品中核酸的提取方法。针对食用油脂中DNA含量极低、破坏严重的特点，建立了食用油脂中DNA提取方法。 建立了边界序列的测定方法和转基因作物品系鉴定方法，首次测定出番茄棉花边界序列。对转基因的检测不仅能检测种类，而且还能检测品系，如对基因玉米、马铃薯、大豆等都能进行鉴定。 行设计了实时荧光PCR定量（性）检测引物32对和相对应的探针，建立了转基因产品实时荧光PCR定量（性）检测方法，该方法能检测目前国内外已报道的主要商品化转基因品种。建立了转基因产品的基因芯片检测方法。自行研究设计了基因芯片检测的引物和探针，优化基因芯片杂交条件和多重PCR反应条件，首次建立了高通量的转基因产品基因芯片检测方法。 研究制定了12项行业标准，7项国家标准。
微生物与生化药学问答题 第二章基因工程制药 1. 利用基因工程技术生产药物的优点？ 答：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究， 从而扩大这些物质的应用围； 3、可以发现、挖掘更多的源性生理活性物质； 4、源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程 进行改造和去除； 5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 2. 基因工程药物制造的主要步骤？ 答：目的基因的克隆； 构建DNA 重组体； 将DNA 重组体转移入宿主菌构建工程菌； 工程菌的发酵； 外源基因表达产物的分离纯化； 产品的检验等。 3. 化学合成目的基因的先决条件？ 答：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成，其先决条件：已知目的基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA 的碱基序列。 4. 人工合成基因的限制有哪些？ 答：1、不能合成太长的基因，50~60 个碱基对； 2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码带来很大的困难： 3、费用高。 5. 基因工程宿主菌应满足那些要求？目前应用最广泛的宿主菌有哪些？ 答：1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用廉价易得的原料； 3、不致病、不产生毒素； 4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代调控； 6、容易进行DNA 重组技术操作； 7、产物的产量、产率高，产物容易提取。 宿主菌可分两大类：1、原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 2、真核细胞：酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。 6. 表达载体须具备哪些条件？常用载体有哪些？ 答：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2、具多个限制酶切点，但每种切口最好只有1 个，以便与外源基因连接。 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。 4、所产生的mRNA 必须有翻译的起始信号。
第十章微生物与基因工程 基因工程(genetic engineering)或重组DNA技术(recombinant DNA technology) 就是指对遗传信息的分子操作与施工,即把分离到的或合成的基因经过改造,插入载体中,导入宿主细胞内,使其扩增与表达,从而获得大量基因产物,或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作,也可泛指它所涉及的技术系统,其核心就是构建重组体DNA的技术。因此,基因工程与重组DNA技术有时也就成为同义词。 基因工程就是在现代生物学、化学与化学工程学以及其她数理科学的基础上产生与发展起来的,并有赖于微生物学的理论与技术的发展与运用,微生物在基因工程的兴起与发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现就是本世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件,它使得生物科学获得迅猛发展,并带动了生物技术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作,大规模生产基因产物,并且去设计与创建新的基因、新的蛋白质与新的生物物种,这也就是当今新技术革命的重要组成部分。 第一节基因工程概述 一、基因工程的发展历史 基因工程就是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础,这三项技术就是:DNA的特异切割、DNA的分子克隆与DNA的快速测序。 早在50年代,阿尔伯(Arber)的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体,60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统,即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯(Smith)等人从流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)中分离出特异切割DNA 的限制酶。次年,内森斯(Nathans)等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA,最先绘制出DNA的限制图谱(restriction map)。1973年史密斯与内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA,限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现与使用限制酶中的功绩,1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯与史密斯。 1973年,科恩(Cohen)与博耶(Boyer)等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素与卡那霉素的抗性基因相融合,并将重组体DNA转化大肠杆菌,首次实现了DNA的分子克隆。 1975年桑格(Sanger)实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特(Gilbert)实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆与测序方法的建立,使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特与桑格,以肯定她们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。 1977年板仓(Itakura)与博耶用人工合成的生长激素释放抑制素(Somatostatin, SMT)基因构建表达载体,并在大肠杆菌细胞内表达成功,得到第一个基因工程的产品。1982年,在建立转基因植物与转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合,从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中,然后移植到母鼠子宫内,由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间,基因工程在实践中迅速成熟,日趋完善。 二、基因工程的基本过程 生物的遗传性状就是由基因(即一段DNA分子序列)所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因,才能在体外用酶进行“剪切”与“拼接”,然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体,并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞,使其复制(无性繁殖),由此获得基因克隆(clone,无性繁殖系的意思)。基因还可通过DNA聚合酶链式反应(PCR)在体外进行扩增,借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变与改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件,使转入的基因在细胞内得到表达,即能产生出人们所需要的产品,或使生物体获得新的性状。这种获
α互补 人们发现lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（α肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做α互补（α-complementation）。 pUC18 pUC18是适合于双脱氧法DNA测序的载体，通常运用于重组dna 的分子克隆中，首先我们制备大肠杆菌的感受态细胞（能接受外来重组的dna），这种感受态菌株必须不同外来DNA分子发生遗传重组，通常是rec基因缺陷型的突变体，同时它们必须是限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，即具有具有这三种缺陷（rk mk rec ），同时对氨苄青霉素敏感（ap）。 植物抗病基因（R基因） 从广义上讲植物抗病基因(resistance gene)与防御反应基因(defense gene)都是在植物抗病反应过程中起抵抗病菌侵染及扩展的有关基因。所谓抗病基因就是Flor经典遗传学基因对基因(gene-for-gene)假说中所指的与病原菌无毒基因相对应的，存在于植物特定品种中，在植物生长的整个周期或其中某个阶段为组成型表达的植物抗病品种所特有的一类基因。植物防御反应基因的特点是，在抗病和感病品种中均存在，其差异主要体现在基因表达的时间、空间及产物含量的不同，为组成型或诱导型表达的一类基因。 植物抗病基因工程所首选的最佳目的基因是来自植物自身的抗病基因。但由于植物的基因组十分庞大，加之人们对抗病基因产物的功能了解甚少，以及克隆手段的限制，直到1992年以后，才出现成功克隆抗病基因的报道，使植物抗病基因工程出现了质的飞跃。
微生物基因组研究：前景与目标 金奇 微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物等在内的一大类生 物群体，它个体微小，却与人类生活密切相关。微生物在自然界中可谓“无处不 在，无处不有”，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、医药、工农业、 环保等诸多领域。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50％ 是由病毒引起。世界卫生组织公布资料显示：传染病的发病率和病死率在所有疾 病中占据第一位。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。 在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感 染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致 病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株 发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间 可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大 流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设 计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核 感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有 益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医
药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选 出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广 泛应用于工业发酵，生产乙醇、食品及各种酶制剂等；一部分微生物能够降解塑 料、处理废水废气等等，并且可再生资源的潜力极大，称为环保微生物；还有一 些能在极端环境中生存的微生物，例如：高温、低温、高盐、高碱以及高辐射等 普通生命体不能生存的环境，依然存在着一部分微生物等等。看上去，我们发现 的微生物已经很多，但实际上由于培养方式等技术手段的限制，人类现今发现的 微生物还只占自然界中存在的微生物的很少一部分。 微生物间的相互作用机制也相当奥秘。例如健康人肠道中即有大量细菌存在， 称正常菌群，其中包含的细菌种类高达上百种。在肠道环境中这些细菌相互依存， 互惠共生。食物、有毒物质甚至药物的分解与吸收，菌群在这些过程中发挥的作 用，以及细菌之间的相互作用机制还不明了。一旦菌群失调，就会引起腹泻。 随着医学研究进入分子水平，人们对基因、遗传物质等专业术语也日渐熟悉。 人们认识到，是遗传信息决定了生物体具有的生命特征，包括外部形态以及从事 的生命活动等等，而生物体的基因组正是这些遗传信息的携带者。因此阐明生物 体基因组携带的遗传信息，将大大有助于揭示生命的起源和奥秘。在分子水平上 研究微生物病原体的变异规律、毒力和致病性，对于传统微生物学来说是一场革 命。