第三章、转基因微生物与生物医药
（微生物反应器）
一、 基因工程菌的制备和表达
（一） 基因工程菌的制备
1 目的基因的获得和表达载体构建
2 菌种的选择
基因工程的宿主菌多种多样：
（1）原核细胞
大肠杆菌：方便，采用最多。但缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统。
枯草芽孢杆菌
链霉菌
（2）真核细胞
酵母：应用广泛。可对真核生物蛋白质的修饰加工。
丝状真菌
3 菌种的转化和鉴定
（二） 基因工程菌的培养
1、基因工程菌的培养设备
发酵罐组成：发酵罐体、搅拌器、温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。（图）
发酵罐要求：提供菌体生长最适生长条件；培养过程不得污染；保证纯菌培养；培养及消毒过程不能干扰细菌代谢等。
2、基因工程菌的培养方式
（1）补料分批培养
将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。
（2）连续培养
将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。
（3）透析培养
利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。
（4）固定化培养
以多孔陶瓷为载体吸附法固定重组大肠杆菌。
（三） 基因工程菌的表达
1、外源基因在大肠杆菌中的表达诱导（例如启动子是Lac）
筛选到的阳性重组子菌株
↓
用LB培养基在37℃培养过夜
↓
以1%的比例接种至100ml的表达用培养基中
↓
37℃培养至OD≈0.7-0.8
↓
加入 IPTG (异丙基- β -D- 硫代半乳糖苷)
（终浓度0.5nmol/L）
↓
37℃，振摇培养一段时间
↓
4℃，低温离心，收集菌体备用2、外源基因在大肠杆菌中的表达形式
（1） 外源蛋白在宿主细胞中以包涵体的形式表达
包涵体：大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。
优点：容易表达，可以抵抗宿主细胞中蛋白水解酶的降解。通过超声波破碎，离心等能比较容易地对其进行初级纯化。
缺点：纯化过程中需变性／复性，过程繁杂。经变性／复性后正确折叠的蛋白质的产量不稳定，有时会很低，相对分子质量较大的蛋白质基本上不能进行正确重叠。
（2） 以分泌型蛋白表达外源药物基因
通常需用位于细菌某蛋白质Ｎ端的一段氨基酸
序列（称为信号肽）帮助蛋白通过细胞膜。或将大肠杆菌（革兰氏阴性菌）改造为分泌型细菌。
优点：目的蛋白易于分离；目的蛋白末端完整
缺点：外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。且容易被宿主菌中蛋白水解酶降解。
（3） 以融合蛋白形式表达外源药物基因
融合表达：是指将目的药物基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，使二者以融合蛋白形式表达。
用于融合的表达标签蛋白和多肽： β-半乳糖苷酶（LacZ）和谷胱甘肽转移酶(GST)等。
优点：* 目的蛋白稳定性高：保护外源蛋白不受宿主内蛋白酶的降解。
* 目的蛋白易于分离：利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白的纯化过程。
缺点：融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获的目的蛋白。
（四）影响基因工程菌发酵和外源基因表达的因素
基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：
（1）生物材料方面：基因工程菌带外源基因
（2）生产目的方面：使外源基因高效表达
微生物发酵目的是为了获得初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标，而基因工程发酵是为了获得最大量的外源基因表达产物。
（3）生长速率方面：较慢
1、培养基的影响
要求：提高工程菌的生长速率；保持工程菌的稳定性；使外源基因高效表达。
常用碳源：有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。
常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和、氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。
其他：另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。 对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。如无机磷
例如：在基础培养基中加入氨基酸能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。
不同的碳源对菌体的生长和外源基因表达有较大的影响。使用葡萄糖和甘油对菌体比生长速率及呼吸强度相差不大。但使用甘油菌体得率较大，而使用葡萄糖菌体产生的副产品较多。
葡萄糖对lac启动子有阻遏作用，乳糖对lac启动子有利。
在氮源中，酪蛋白水解物有利于产物的合成与分泌。色氨酸对trp启动子控制的基因有影响。
2、接种量的影响
接种量：指移入的工程菌种子量和培养液体积的比例。
接种量小，菌体延迟期较长，使菌龄老化，不利于外源基因的表达；
接种量大，缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，减少污染机会，适于表达外源基因。
接种量过大，
使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。
3、诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达（升温可以使阻遏蛋白失活，使启动子启动转录，提高目的基因的表达效率）
4、温度的影响
* 影响各种酶的反应速度，影响代谢调控机制。
* 影响菌体自身基因和外源基因的复制、转录和表达。
* 影响蛋白质的活性和包涵体蛋白的形成。
适宜的发酵温度: 既适合菌体生长，又适合外源基因表达。
5、溶解氧的影响
对于好氧发酵，溶解氧浓度是重要的参数。
提高溶氧速度和氧的利用率，可以提高菌体生长和发酵产率，
也可以提高外源基因的高效表达和翻译。
通常采用调节搅拌转速的方法，改善培养过程中的氧供给。
6、控制控制菌的生长速率和高浓度代谢副产物乙酸的产生
控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。
分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等，可以控制控制菌的生长速率，减少乙酸的产生。
高浓度的代谢副产物乙酸能明显抑制菌体的生长。
加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。
采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，可阻止乙酸产生。
7、pH的影响
pH对细菌的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响。
采取两段培养工艺，可以兼顾二者：
培养前期，重点是优化工程菌的生长条件，其最佳pH6.8～7.4；
培养后期，重点是优化外源蛋白的表达条件，其最佳pH6.0～6.5。
8、外源基因的表达水平不仅与基因的来源，基因的性质以及载体有关，还取决于宿主细胞本身。
9、增加基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定现象，分为：
分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
质粒不稳定产生的原因：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌的生长比速率差异的大小。
提高质粒稳定性的方法：
* 二阶段培养法：第一阶段先使菌体生长至一定密度，第二阶段诱导外源基因的表达。
* 在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。
* 调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度等。如间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性；间歇供氧和改变稀释数率，也可以提高质粒稳定性。
总之，必须不断优化，选用合适的宿主菌，构建正确的高效表达载体，建立工程菌最
佳发酵工艺，以期获得: 最快周期、最高产量、最好质 量、最低消耗、最大安全性、最佳废物处理效果、最佳速度、最低失败率等。
二、基因工程药物的分离和纯化
（一）分离纯化的基本过程
分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般包括4～5个步骤，包括：
细胞破碎
固液分离
浓缩与初步纯化
高度纯化
成品加工
（二）、分离纯化技术
分离纯化技术要求：
（1）技术条件要温和
（2）选择性要好
（3）收率要高
（4）两个技术之间要能直接衔接
（5）整个分离纯化过程要快
分离纯化技术：
1、细胞破碎与固液分离：
（1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。
（2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。
机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压；
非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法。
（3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。
2、目的产物的分离纯化
主要依赖色谱分离方法。
（1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）: 基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。
（2）反相色谱（reversed phase chromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography, HIC）:
反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。
（3）亲和色谱（ affinity chromatography,AC）: 亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的 。包括：配基固定化; 吸附目的产物；样品解吸。
（4）凝胶过滤色谱: 凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。
3、非蛋白质类杂质的去除
在纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质，它们是DNA、热原质和病毒
（1）DNA的去除
（2）热原质的去除
（3）病毒的去除
选择分离纯化方法的依据：
1、根据产物表达形式来选择
2、根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异选择。n
三、基因工程菌药物的质量控制
（一）、原材料的质量控制
确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安
全性和一致性。
（二）、培养过程的质量控制
在工程菌菌种贮存中，要求种子克隆纯而稳定，始终能排除外源微生物污染；在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；在重复发酵中，工程菌表达稳定。
（三）、纯化工艺过程的质量控制
产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致；病毒、DNA与热原都控制在规定限度下。
（四）、目标产品的质量控制
基因工程药物质量控制主要包括以下几项要求：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。
1、产品的鉴别
（1）肽图分析：肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进行分离分析。
（2）氨基酸成分分析：对目的产物的纯度仍可以提供重要信息。
（3）部分氨基酸序列分析：可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。
（4）重组蛋白质的浓度测定和相对分子质量测定：
浓度测定方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林－酚法和紫外光谱法等。
相对分子质量测定最常用的方法有凝胶过滤法（测定完整的蛋白质）和SDS－PAGE法（测定蛋白质亚基）。
（5）蛋白质二硫键分析：方法有对氯汞苯甲酸法（PCMB）和5,5’－二硫双基－2－硝基苯甲酸法（DTNB）等。
2、纯度和活性分析
纯度分析是基因工程药物质量控制的关键项目。
（1）目的蛋白质含量测定：通常采用的方法有还原性及非还原性SDS－PAGE法、等电点聚焦、各种HLPC、毛细管电泳等。
（2）杂质限量分析
蛋白类杂质：主要的是纯化过程中残余的宿主蛋白。它的测定基本上是采用免疫分析的方法，同时需辅以电泳等其他检测手段。
非蛋白质类杂质：主要有病毒和细菌等微生物、热原、热原质、内毒素、致敏原及DNA。
3、生物活性测定：需要进行动物体内试验和通过细胞培养进行体外效价测定。
4、稳定性和产品一致性：
复习题
问题：
1. 利用微生物生物反应器生产基因工程药物的基本过程。
2. 基因工程菌药物的质量控制环节。
3. 基因工程菌药物的分离和纯化技术。
4. 影响基因工程菌发酵和外源基因表达的因素。
5. 外源基因在大肠杆菌中的表达诱导方式和表达形式。