第十章微生物与基因工程
基因工程（genetic engineering ）或重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指对遗
传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作，也可泛指它所涉及的技术系统，其核心是构建重组体DNA的技术。因此，基
因工程和重组DNA技术有时也就成为同义词。
基因工程是在现代生物学、化学和化学工程学以及其他数理科学的基础上产生和发展起来的，并有赖于微生物学的理论和技术的发展和运用，微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现是本世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，它使得生物科学获得迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并且去设计和创建新的基因、新的蛋白质和新的生物物种，这也是当今新技术革命的重要组成部分。
第一节基因工程概述
一、基因工程的发展历史
基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三
项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。
早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末
进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰-限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬
菌体DNA 1970年史密斯（Smith ）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus in flue nzae ）中分离出特异切割DNA 的限制酶。次年，内森斯（Nathans ）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA最先绘制出DNA
的限制图谱（restriction map ）。1973年史密斯和内森斯提出修饰-限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发
现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。
1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。
1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert ）
实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以
产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术
中的贡献。
1977年板仓（Itakura ）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT ）基因
构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基
因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植
物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因
工程在实践中迅速成熟，日趋完善。
二、基因工程的基本过程
生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首
先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得
基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR在体外进行扩
增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得
新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和
“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤：
①分离或合成基因；
②通过体外重组将基因插入载体；
③将重组DNA导入细胞；
④扩增克隆的基因；
⑤筛选重组体克隆；
⑥对克隆的基因进行鉴定或测序；
⑦控制外源基因的表达；
⑧得到基因产物或转基因动物、转基因植物。上述步骤可用图10-1 来表示。
图10-1 基因工程基本操作过程示意图
三、微生物学与基因工程的关系微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明：
①基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成；
②基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的；
③微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使
外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中；
④为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的；
⑤微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；
⑥有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、
植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。
第二节微生物与克隆载体
外源DNA片段进行克隆，需要一个合适的载体，将其运送到细胞中并进行复制与扩增。这种以
扩增外源DNA为目的载体，称为克隆载体（cloning vector ）。作为克隆载体的基本要求是：（1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制。因此载体应是一个独立的复制子（replicon ），
具有复制起始序列，可在细胞中进行有效扩增。
（2）载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入。并且由于这些酶切位点
位于载体复制的非必需区，故插入适当大小外源DNA片段后载体仍然能够进行正常的复制。
（3）载体必须具有可供选择的遗传标记，例如具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别
和筛选。
（4）载体DNA须易于生长和操作。
到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体；入噬
菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。
一、质粒克隆载体
1. 质粒克隆载体的特性当前分子克隆中所用的克隆载体，绝大多数是利用细菌的质粒，经人工修饰改造而成。质粒作为克隆载体，具有十分有利的特性：
（1）具有独立复制起点作为克隆载体的质粒，通常都含有一个复制起点，这是质粒在宿主细胞
中进行扩增的必要条件。
(2)具有较小的分子量质粒是染色体外DNA通常由环形双链DNA勾成，其分子大小约为1?200Kb。低分子量有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15Kb。
( 3)具有较高拷贝数每个细胞可含有10?200 个拷贝的松弛型复制质粒。当加入蛋白质合成抑
制剂(如氯霉素等)，还可大大增加细胞中质粒的拷贝数，每个细胞可含有高达数千个拷贝的质粒，使外源DNA 得以大量扩增。
( 4) 具有便于选择的标记某些质粒中存在着抗生素的抗生基因，便于对克隆基因的检测和筛选。
( 5) 易于导入细胞质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。
(6)具有安全性作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有外源DNA的重组质粒扩散至实验
室外，以免造成危害。
2．质粒pBR322 的结勾特点
大肠杆菌质粒PBR322是基因工程中最常用和最具代表性的质粒( 图10- 2)，它是由博利瓦
( Bolivar )等人于1977年勾建而成的，是一个典型的人工质粒载体。
质粒pBR322是环状双链DNA分子，由4361bp组成。可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA 若超过10kb，质粒在复制时就会变得不稳定。它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷具数，每个细胞含有20?30个拷贝。当加入氯霉素扩增之后，每个细胞可含有1000?3000 个拷贝，大大有利于重组质粒在细胞中的扩增。此外，PBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个
是四环素抗性基因(Tet r)另一个是氨苄青霉素抗性基因(Amp)。已知有24种主要限制酶在pBR322
上都只有一个切点，其中有7种限制酶( EcoRV、NheI、BamHI、SphI 、SalI 、XmaIII 、NruI )的切点位于四环素抗性基因之内，还有 3 种限制酶( ScaI 、PvuI 和PstI )的切点位于氨苄青霉素抗性基因之内。外源DNA片段插入这些位点之中任一位点时，将导致相应的抗性基因的失活。这种因外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活( in sertio nal in activation )。
图10-2 质粒pBR322结构图
插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体(图10- 3)，例如若在质粒pBR322的BamHI的
位点插入外源DNA然后转化大肠杆菌(Tet s、Amp )。含有重组质粒(即带有外源DNA的质粒)的
宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。
图10-3 插入失活示意图
3. 其它质粒载体
现在已构建许多新的质粒载体(如pUC系列和pGEM系列的质粒载体)，它们具有更多有用的特
点并且使用起来更方便。这些载体的优点之一，在质粒载体上含有一个人工构建的多接头位点(polylinker) 或多克隆位点(multiple cloning site) ，这是一个带有不同限制酶单一识别位点的
短的DNA片段，外源基因可随意插入任何一个切点。同时又由于多克隆位点常位于一个基因的编码区之中，因此，基因的插入失活极易被检测到。
除大肠杆菌质粒外，枯草芽孢杆菌质粒也可作为质粒载体之用。此外，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )的2m m质粒常作为酵母细胞外源基因的克隆或表达载体。
为了便于基因工程工作，人们先后构建了一系列不同类型的穿梭质粒载体( shuttle plasmid vector )。这是一类同时含有两种细胞的复制起点(特别是同时含有原核与真核生物的复制起点)，能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。其中最为常见和被广泛应用的是大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，这种质粒同时含有大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点，故既可在大肠杆菌细胞中复制又可在酵母细胞中进行复制。此外还有其他穿梭质粒载体系统。
二、入噬菌体克隆载体
入噬菌体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有很多优点：
①它的分子遗传学背景十分清楚。
②入噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。而入噬菌体载体却能容纳大
约23kb的外源DNA片段。
③具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只有
0.1 %。以上优点为克隆较大片段的外源DNA提供了有利条件，并可大大增加构建基因库的效率。
1.入噬菌体载体的构建
野生型入噬菌体DNA不适于作为克隆载体，因为它的DNA分子很大，基因组结构复杂，限制酶
有很多切点，并且这些切点多数位于必需基因之中等等。为了避免上述问题，需经一系列改造。
构建入噬菌体克隆载体的基本原则是：
①删除基因组中非必需区，使基因组变小，有利于克隆大的DNA片段。
②除去多余的限制位点。现已构建了各种各样的入载体。这些载体可分为两类：一类称为插入
型载体(insert vector )其限制酶位点可用于外源DNA的插入；另一类称为取代型载体 (replacement vector )具有成对限制酶位点，外源DNA可取代两个限制位点上的DNA区段。重组DNA与包装蛋白
混合，可在体外包装成有感染力的重组噬菌颗粒。
虽然入噬菌体载体是一类极为有用的克隆载体，但是由于入噬菌体头部组装时容纳DNA的量是
固定的，因此插入外源DNA的长度必须控制在使重组DNA为野生型入DNA长度的78%?105%之间，否则不能正常组装。
三、柯斯质粒载体
柯斯质粒载体(cosmid vector )即粘粒载体，是由入噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。cosmid
一词的意思是带有cos位点的质粒。柯斯质粒载体含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，以及来自入噬菌体粘性末端的DNA片段，即cos位点。它对于将DNA包
装成入噬菌体粒子是必需的。
柯斯质粒载体的优点：
①具有噬菌体的高效感染力。而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在。
②具有质粒DNA的复制方式。重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制。
③具有克隆大片段外源DNA的能力。这是柯斯质粒的最大优点。柯斯质粒本身一般只有5?7kb
左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb,远远超过质粒载体及入噬菌体载体的克隆能力。
四、M13噬菌体载体
M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA大小为6407bp。感染雄性(F+或Hfr )大
肠杆菌并进入细胞后，转变成复制型(RF) dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA每当复制出单位
长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式(即宿主细胞不被裂解)被释放至胞外。
野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体(图10-4 )。在M13基因组中，除基因间隔区(IG)外，其他均为复制和组装所必需的基因。外源DNA插入IG区，可不影响M13活动，因此对野生型M13的改造主要在IG区中进行。
图10-4噬菌体载体M13 mp 18的结构示意图
(1)插入B-半乳糖苷酶选择标记在IG区中插入B-半乳糖苷酶N端一小段编码序列及其
调控序列，该序列编码B-半乳糖苷酶的a肽，a肽可与大肠杆菌LacZ突变基因QM15进行a互补，
产生具有活性的B-半乳糖苷酶。若将M13和宿主细胞涂布在含有异丙基硫代-3 -D-半乳糖苷(IPTG)
和呈色物质5-溴-4-氯-3-吲哚-3 -D-半乳糖苷(X - gal)培养基的平板上时，可形成蓝色噬菌斑。
（2）插入一小段多克隆位点区在a肽的编码区内插入一小段密集限制酶单一位点的DNA片段，当外源DNA插入到这一区段，则会破坏a互补作用。这时若将M13（含外源DNA和宿主细胞涂
布在含有IPTG和X- gal培养基的平板上，则形成无色噬菌斑。
M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300?400bp的外源DNA片段，它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链DNA因此，它主要被用于制备测序用单链DNA莫板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。也可用于噬菌体展示（phage display ）。
五、噬菌质粒载体
噬菌质粒（phagemid或phasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点，
这类载体具有来自M13或f 1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复
制起点，抗药性标记，一个多克隆位点区等。例如pUC118噬菌质粒载体就是在野生型M13的基因间
隔区插入质粒载体pUC18构建而成的。
噬菌质粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA当用辅助噬菌体M13感染宿主细
胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA并被包装成噬菌体粒子，以出芽方式释放至胞外。
噬菌质粒载体在应用上具有许多优点：
①载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作。
②克隆外源DNA勺容量较M13噬菌体载体大，可克隆10kb外源DNA片段。
③可用于制备单链或双链DNA克隆和表达外源基因。
现将上述几类大肠杆菌克隆载体的克隆能力及其主要用途列表比较（表10-1 ）
六、真核生物的克隆载体
以上主要讨论了原核生物的克隆载体。但是关于真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，是原核生物载体所无法解决问题。因此为了适应真核生物基因工程的需要，现已构建了一系列真核生物载体，主要有以下几大类：
1.酵母质粒载体
酵母质粒载体都是利用其2m质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有以下三种（图10-5）:
图10-5酵母质粒载体
（1）附加体质粒（episomal plasmid ）
该质粒载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素
抗性基因（Am0）。此外还有来自酵母2m m质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3），这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，当重组质
粒导入酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。
（2）复制质粒（replicating plasmid ）
该质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因
（Am0）和四环素抗性基因（Tet r）。还有来自酵母染色体的自主复制序列（ARS，以及作为酵母
选择标记的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1），故这种质粒是穿梭质粒，能在大肠杆
菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。
（3）整合质粒（integrating plasmid ）
该质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性
基因（Amp）、四环素抗性基因（Tet r）。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞
中进行自主复制。一旦导入酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。
2. 真核生物病毒载体
（ 1 ）哺乳动物病毒载体这类病毒载体具有许多突出优点：例如动物病毒能够有效识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中，以及高拷贝和强启动子等，有利于真核外源基因的克隆与表达。目前
利用许多哺乳动物病毒如SV40,腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。
（2）昆虫病毒载体
昆虫中的杆状病毒的衍生物作为载体具有许多优点，主要为高克隆容量，克隆外源DNA片段大
小可高达100kb;其次具有高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25 %左右，甚至更多；此外，它具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和哺乳动物疾病。
（3）植物病毒载体
一些RNA病毒和DNA病毒已被改造为植物基因工程载体。目前植物基因工程操作较多使用双链DNA病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。
七、人工染色体
酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC ）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。它是由默里（Murray ）于1983年首次构建成功的。伯克（Burke ）等于1987年用以构建成YAC克隆库。
酵母染色体的控制系统主要包括三部分：
①着丝粒（centromere, CEN它的作用是使染色体的附着粒与有丝分裂的纺锤丝相连，保证染色体在细胞分裂过程中正确分配到子代细胞。
②端粒（telomere, TEL）位于染色体两个末端，它的功能是保护染色体两端，保证染色体的正常复制，防止染色体DNA复制过程中两端序列的丢失。
③酵母自主复制序列（auto no mously replicati ng seque nee, ARS ），其功能与酵母细胞复制
有关。
酵母人工染色体（图10- 7）除有端粒、着丝粒、自主复制序列等外，还有选择标记基因（如TRP1 和URA3等）。
图10-7 酵母人工染色体（YAC）
YAC克隆外源DNA能力非常大，一个YAC可插入长达100万碱基以上DNA片段。因此YAC既保证所插入外源基因结构的完整性，又大大减少基因库所要求克隆的数目。目前YAC已成为构建高等
真核生物基因库的重要载体，并在人类基因组的研究中起着重要作用。
除酵母人工染色体外，现已构建细菌人工染色体（BAC更便于基因工程操作，在人类基因组研究中正被广泛应用。
第三节微生物与基因工程工具酶基因工程操作需要用到一些基本的工具酶。例如在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对DNA进行准确切割。在构建重组DNA时，需在DNA连接酶的催化下，使目的DNA 片段与载体DNA进行连接。此外，重组DNA技术还需要一些其他的工具酶。值得注意的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。
一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease )或简称为限制性酶(restrition enzyme)是
指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。在细菌细胞内
限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，禾U用限制酶降解进入细胞内的外源DNA
同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA以避免被酶降解。
1?限制性内切酶的命名与分类
限制性酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成三个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。例如ECO RI中的E表示大肠杆菌属名第一个字母，co表示种名头
两个字母，R表示株名，I表示该菌中第一个被分离出来的酶。如限制酶是来自同一属的细菌，而且种名的头两个字母完全相同，这时其中一个菌的酶命名的第三个字母可用种名的词头后的另一个字母代替。例如副流感嗜血杆菌( Haemophilus parainfluenzae )的酶表示为Hpa和Hpa i ;而副溶
血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus )的酶表示为Hph。
根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、山三种类型，I型和III型由于
基因工程的发展与前景 摘要：基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。本文将从基因工程的概况、发展、应用与前景进行介绍和总结。 关键词：基因工程；发展；前景 1 基因工程的概况 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程。 2 基因工程的发展 1860至1870年，奥地利学者孟德尔根据豌豆杂交实验提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律。 1909年，丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词，用以表达孟德尔的遗传因子概念。 1944年，3位美国科学家分离出细菌的DNA（脱氧核糖核酸），并发现DNA是携带生命遗传物质的分子。 1953年，美国人沃森和英国人克里克通过实验提出了DNA分子的双螺旋模型。 1969年，科学家成功分离出第一个基因。 1980年，科学家首次培育出世界第一个转基因动物转基因小鼠。 1983年，科学家首次培育出世界第一个转基因植物转基因烟草。 1988年，K.Mullis发明了PCR技术。 1990年10月，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。 1994年，中科院曾邦哲提出转基因禽类金蛋计划和“输卵管生物反应器
第九章微生物与基因工程 计划学时：2 重点：基因工程的基本操作过程，基因工程的应用。 一、基因工程的发展历史 基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。 早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。 1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。 1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。 1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。 二、基因工程的基本过程 生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得新的性状。这种获得新功能的微生物称为“工程菌”，新类型的动、植物分别称为“工程动物”和“工程植物”，或“转基因动物”和“转基因植物”。基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤： ①分离或合成基因； ②通过体外重组将基因插入载体；
基因工程与微生物 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 一、基因工程的概况 基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。所谓基因工程（genetic engineering)是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（Waclaw Szybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯（Daniel Nathans）、亚伯（Werner Arber）与史密斯（Hamilton Smith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程 二、基因工程的基本步骤 （1）提取目的基因 获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。 要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。 直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。 用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。 目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA 为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，
精编高一下册《基因工程及其应用》知识点 梳理：生物篇 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的剪刀：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的针线：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的运载工具：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。
c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。 5.转基因生物和转基因食品的安全性
（生物科技行业）微生物工 程
微生物工程 壹.名词解释 微生物工程：指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的壹种技术。 拮抗作用：当多种物质联合作用时，其中的壹种物质会通过壹定渠道降低另壹种物质的作用（通常是有害作用），使机体维持平衡状态。例如当人体血糖含量较高时，胰岛素分泌增加，胰高血糖素分泌减少，俩种激素桔抗作用使血糖的含量降低。当血糖含量较低时，胰岛素分泌减少，胰高血糖素分泌增加，结果是使血糖的含量升高。 生物测定：利用某些生物对某些物质(如维生素、氨基酸)的特殊需要，或对某些物质(如激素、抗生素、药物等)的特殊反应来定性、定量测定这些物质的方法。载体：能够插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，且在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。 质粒：细胞中独立于染色体之外，能够独立复制的共价闭合环状DNA. 菌落原位杂交：是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上和放射性同位素标记过的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，且和平板上的菌落对位。 效价：抗生素的计量单位，是抗生素等生物制品有效成分含量高低的指标，能够通过仪器的方法测得。 复制起始位点：指在DNA转录时RNA聚合酶和之结合，起始转录的特定核苷酸序列，决定转录起始位点和转录频率。 BOD（生物需氧量）：通常表示水中有机物等需氧污染物质含量的壹个综合指示。水中有机物由于微生物的生化作用进行氧化分解，使之无机化或气体化时所
消耗水中溶解氧的总数量。 半连续发酵：指在发酵过程的后期周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法。这种发酵能够重复多次。 半连续发酵semi-continuousfermentation：是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。 补充发酵：指在发酵过程中以壹定的速率排出成熟的发酵液，同时以相同的速率加入新鲜培养基，使整个发酵过程基本维持在稳定期的发酵方法。 抗生素：是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的壹类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。 下游处理：特指生物工程产品生产程序中的后期加工。指的是生物产品特别是发酵液的分离、纯化、加工、剂型制备等，直至达到产品质量要求的整个处理过程。 二.简答题 1.基因工程在微生物工程的应用表当下哪些方面？每壹方面举例1-2个说明。答：①生产药物疫苗中的引用：这类基因工程药物的生产是当前基因工程最重要的应用领域，发展迅速。例如：有抗肿瘤.抗病毒功能干扰素.白细胞等；用于生理调节的胰岛素和其他生长激素等。 ②改造传统工业发酵菌种：例如生产抗生素.氨基酸.有机酸.酶制剂等，这类菌种基本上都要经过长期的诱变或重组育种，生产性能很难再大幅度的提高。要打破这壹局面，必须使用基因工程的手段才能解决。目前在氨基酸.酶制剂等领域已有大量成功的例子。 ③环境保护：在环境保护方面，利用基因工程可培育同时能分解多种有毒物质
高三生物知识点归纳：基因工程及其应用 1.概念：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 高考生物知识点归纳 2.原理基因重组 3.工具： A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。 4.基因操作的基本步骤： ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基
因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。
微生物与生化药学问答题 第二章基因工程制药 1. 利用基因工程技术生产药物的优点？ 答：1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障； 2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究， 从而扩大这些物质的应用范围； 3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工 程进行改造和去除； 5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 2. 基因工程药物制造的主要步骤？ 答：目的基因的克隆； 构建DNA 重组体； 将DNA 重组体转移入宿主菌构建工程菌； 工程菌的发酵； 外源基因表达产物的分离纯化； 产品的检验等。 3. 化学合成目的基因的先决条件？ 答：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成，其先决条件：已知目的基因的核苷酸序列或蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA 的碱基序列。
4. 人工合成基因的限制有哪些？ 答：1、不能合成太长的基因，50~60 个碱基对； 2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码带来很大的困难： 3、费用高。 5. 基因工程宿主菌应满足那些要求？目前应用最广泛的宿主菌有哪些？ 答：1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用廉价易得的原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA 重组技术操作； 7、产物的产量、产率高，产物容易提取。 宿主菌可分两大类：1、原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌； 2、真核细胞：酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。 6. 表达载体须具备哪些条件？常用载体有哪些？ 答：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2、具多个限制酶切点，但每种切口最好只有1 个，以便与外源基因连接。 3、具有某些标记基因，便于进行筛选。 4、所产生的mRNA 必须有翻译的起始信号。
第十章微生物与基因工程 基因工程(genetic engineering)或重组DNA技术(recombinant DNA technology) 就是指对遗传信息的分子操作与施工,即把分离到的或合成的基因经过改造,插入载体中,导入宿主细胞内,使其扩增与表达,从而获得大量基因产物,或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作,也可泛指它所涉及的技术系统,其核心就是构建重组体DNA的技术。因此,基因工程与重组DNA技术有时也就成为同义词。 基因工程就是在现代生物学、化学与化学工程学以及其她数理科学的基础上产生与发展起来的,并有赖于微生物学的理论与技术的发展与运用,微生物在基因工程的兴起与发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现就是本世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件,它使得生物科学获得迅猛发展,并带动了生物技术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作,大规模生产基因产物,并且去设计与创建新的基因、新的蛋白质与新的生物物种,这也就是当今新技术革命的重要组成部分。 第一节基因工程概述 一、基因工程的发展历史 基因工程就是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础,这三项技术就是:DNA的特异切割、DNA的分子克隆与DNA的快速测序。 早在50年代,阿尔伯(Arber)的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体,60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统,即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯(Smith)等人从流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)中分离出特异切割DNA 的限制酶。次年,内森斯(Nathans)等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA,最先绘制出DNA的限制图谱(restriction map)。1973年史密斯与内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA,限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现与使用限制酶中的功绩,1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯与史密斯。 1973年,科恩(Cohen)与博耶(Boyer)等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素与卡那霉素的抗性基因相融合,并将重组体DNA转化大肠杆菌,首次实现了DNA的分子克隆。 1975年桑格(Sanger)实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特(Gilbert)实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆与测序方法的建立,使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特与桑格,以肯定她们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。 1977年板仓(Itakura)与博耶用人工合成的生长激素释放抑制素(Somatostatin, SMT)基因构建表达载体,并在大肠杆菌细胞内表达成功,得到第一个基因工程的产品。1982年,在建立转基因植物与转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合,从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中,然后移植到母鼠子宫内,由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间,基因工程在实践中迅速成熟,日趋完善。 二、基因工程的基本过程 生物的遗传性状就是由基因(即一段DNA分子序列)所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因,才能在体外用酶进行“剪切”与“拼接”,然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体,并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞,使其复制(无性繁殖),由此获得基因克隆(clone,无性繁殖系的意思)。基因还可通过DNA聚合酶链式反应(PCR)在体外进行扩增,借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变与改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件,使转入的基因在细胞内得到表达,即能产生出人们所需要的产品,或使生物体获得新的性状。这种获
基因工程及其应用集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
第2节基因工程及其应用（第1课时） 知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究 传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？
第17章微生物与寄生虫学习题 细菌形态与结构 一、名词解释 1.微生物 2．荚膜 3．芽胞 4．质粒 5．L型细菌 二、填空题 1.根据微生物的细胞结构及化学组成，可将其分为、 、三种类型。 2．细菌物形态多种多样，根据外形可归纳为、和 。 3．细菌的基本结构包括、、和等。 4．细菌的特殊结构有、、和。 5．异染颗粒对鉴定有意义。 6．细胞膜的主要功能有、、。 7．核质与细菌的、有着密切的关系。 ★8. 溶菌酶的作用机理是切断N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的连结，破坏的骨架，引起革兰阳性菌裂 解；青霉素则是干扰之间的连 结，使革兰阳性菌不能合成而导致死亡。 ★9. 菌体中的RNA均存在于核蛋白体上，当m RNA与核蛋白体连成时，即成为合成蛋白质的场所。细菌核蛋白体沉降系数 为。由和两个亚基组成，链霉素能与细 菌核蛋白体的亚基结合，红霉素能与 亚基结合从而干扰蛋白质的合成而致细菌死亡。 三、判断改错题 1.细菌是一类含有完整细胞器的单细胞微生物。（） 2.芽胞形成是细菌的繁殖方式.( ) 3.临床上常以杀死细菌的芽胞作为彻底灭菌的指标.( ) 4.荚膜本身具有毒性,所以有荚膜的细菌毒力强.( ) 5.鉴别细菌最常用,最重要的染色法是革兰染色法和抗酸染色法.( ) 6.性菌毛与细菌遗传物质传递及耐药菌形成有关.( ) 四、选择题 1.细菌的测量单位是( )
A.nm B. um C. mm D. cm 2.细菌细胞壁的共有成分是( ) A.多糖 B.脂多糖 C.肽聚糖 D.磷壁酸 3.细菌能维持其一定外形是因为( ) A.细菌壁的半渗透性 B.细胞质是溶胶状物质 C.细胞壁坚韧且具有弹性 D.细胞浆具有渗透压 4.革兰氏染色法的染色步骤是( ) A.初染-脱色-复染-媒染 B. 初染-复染-媒染-脱色 C.初染-脱色-媒染-复染 D. 初染-媒染-脱色-复染 5.与细菌体内遗传有关的物质是( ) A.核糖体 B.中介体 C.染色体 D.质粒 6.有关细菌芽胞的正确描述是( ) A.是某些细菌的特殊结构 B.当环境适宜时可发芽为多个繁殖体 C.是细菌保持生命力的一种形式 D.根据芽胞的形状,位置及大小有助于鉴别细菌 7.细菌涂片标本制作步骤包括有( ) A.涂片 B.固定 C.染色 D.干燥 五、简答题 1.G+菌与G-菌细胞壁的结构主要有何不同? 2.简述显微镜油镜的使用及保护法. ★3.细菌有哪两种菌毛?各有何功能? 4.举例说明微生物与人类的关系. 5．列表说明细菌特殊结构的种类及医学意义。 细菌的生长繁殖与代谢 一、名词解释 1.培养基 2．热原质 3．抗生素 二、填空题 1.细菌生长繁殖的条件有、、、 . 2．将细菌接种于液体培养基中，经37℃培养小时，可出现 、、生长现象。 3．细菌合成代谢产物与致病性有关的是、，
高二生物导学案班级 班级姓名使用时间 一、学习目标 1.举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。 2.关注基因工程的进展。 3.认同基因工程的应用促进生产力的提高。 二、学习重点 1.DNA重组技术的基本工具（三方面） 2.基因工程的基本操作程序（四方面） 三、学习难点 1.DNA重组技术的基本工具（三方面） 2.基因工程的基本操作程序（四方面） 一、植物基因工程硕果累累 提高农作物的（如）能力、改良农作物的，和利用植物生产等。
一、动物基因工程前景广阔 二、基因工程药物异军突起 1、方式：利用基因工程培育来生产药品。 2、成果：利用工程菌可生产、、、等。 3、什么是工程菌？ 四、基因治疗 1、概念：把导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。 2、成果：将导入患者的淋巴细胞。 3、途径：分为和。 4、注意：基因治疗治疗疾病的最有效手段。 5、基因治疗用于临床治疗了么？ 作业：1．下列关于基因工程的应用，说法正确的是() A．我国转基因抗虫棉是转入了植物凝集素基因培育出来的 B．可用于转基因植物的抗虫基因只有植物凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因 C．抗真菌转基因植物中，可使用的基因有几丁质酶基因和抗毒素合成基因 D．提高作物的抗盐碱和抗干旱的能力，与调节渗透压的基因无关 2．运用现代生物技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因整合到棉花细胞中，为检测实验是否成功，最方便的方法是检测棉花植株是否有()
A．抗虫基因B．抗虫基因产物 C．新的细胞核D．相应性状 3．科学家已能运用基因工程技术，让羊合成并由乳腺分泌抗体，相关叙述中正确的是() ①该技术将导致定向变异 ②DNA连接酶能把目的基因与载体黏性末端的碱基对连接起来 ③蛋白质中的氨基酸序列可为合成目的基因提供材料④受精卵是理想的受体 A．①②③④B．①③④ C．②③④D．①②④ 4．下列不．属于基因工程药物的是() A．从大肠杆菌体内获取的白细胞介素B．从酵母菌体内获取的干扰素 C．从青霉菌体内获取的青霉素D．从大肠杆菌体内获取的胰岛素 5．在转基因植物(如抗虫棉)的培育中，成功与否最终要看() A．用什么方法获得目的基因B．选择运载体是否得当 C．重组DNA分子的结构和大小D．是否赋予了植物抗性 6．若利用基因工程技术培育能固氮的水稻新品种，其在环境保护上的最重要意义是() A．减少氮肥使用量，降低生产成本B．减少氮肥生产量，节约能源 C．避免使用氮肥过多引起的环境污染D．改良土壤的群落结构 7．利用基因工程技术将生长激素基因导入绵羊体内，转基因绵羊生长速度比一般的绵羊提高30%，体型大50%，在基因操作过程中生长激素基因的受体细胞最好采用() A．乳腺细胞B．体细胞C．受精卵D．精巢 8．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是() A．人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍B．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵 C．在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中D．人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA 9．“工程菌”是指() A．用物理或化学方法诱发菌类自身某些基因得到高效表达的菌类细胞株系 B．用遗传工程的方法，把相同种类不同株系的菌类通过杂交得到新细胞株系 C．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系 D．从自然界中选取能迅速增殖的菌类 10．抗病毒转基因植物成功表达后，以下说法正确的是() A．抗病毒转基因植物可以抵抗所有病毒 B．抗病毒转基因植物对病毒的抗性具有局限性或特异性 C．抗病毒转基因植物可以抗害虫 D．抗病毒转基因植物可以稳定遗传，不会变异 11．要彻底治疗白化病必须采用() A．基因治疗B．医学手术C．射线照射D．一般药物 12．下列与基因诊断有关的一组物质是() A．蛋白质、核酸B．放射性同位素、蛋白质 C．荧光分子、核酸D．放射性同位素、糖类 13．下列关于基因工程成果的概述错误的是（） A在医药卫生方面主要用于诊断治疗疾病
第2课时 ●教学过程 ［课前准备］ 1.教师准备 （1）教师将听证会规则、程序、角色扮演的程序和具体要求以及评价标准复印好，分发给各学习小组。 （2）教师整理《转基因生物和转基因食品利弊争论的要点》，印发给各学习小组。 （3）收集转基因生物和转基因食品安全性的资料信息，转基因生物技术的利弊关系的资料，请有关专家学者到学校做有关基因工程知识的讲座。 （4）教师设计并参与制作计算机教学课件，在校园网上制作网页，查找大量资料，完善网页内容，建立内容丰富的“基因工程知识资源库”。 （5）教师根据学生的资料准备状况、知识的准确性、抢答的积极性、讲述的条理性、姿态的自然性、课件的美观性编制《学生听课记录和评价表》。 （6）教师编制《研究性学习课题研究专题报告》。 2.学生准备 （1）学生预习教材，对教材中的内容做宏观地了解。 （2）利用课余时间，通过看书、看报及看电视，收集有关基因工程的成果与发展前景的资料或信息并制成课件，也可以走访有关的专家、学者了解该内容。 （3）分组预习并完成教师下发的有关资料。 （4）按听证会的要求摆好课桌椅，根据各小组的选择按辩论的正方和反方分成左右两个大组。 ［情境创设］ 教师：通过课件向学生展示基因工程给人类带来巨大成就的图片。同时述说如下：基因工程自1973年诞生后，由于基因工程技术具有可以直接控制基因，将基因从一个物种转移至另一个物种，创造出新的物种或新的品种的显著特点，也就是说，可按照人们的主观愿望，创造出自然界中原先并不存在的新的生物类型，使人类从单纯地认识生物和利用生物的传统模式跳跃到随心所欲改造生物和创造生物的新时代。经过30多年的发展历程，取得了惊人的成绩，特别是近10年来，基因工程的发展更是突飞猛进。基因转移、基因扩增多技术的应用，不仅使生命科学的研究发生了前所未有的变化，而且在实际应用领域中，为农牧业、食品工业、医药卫生、环境保护等方面开拓了广阔的发展前景。 今天就由同学们来阐述自己的认识和看法。 ［师生互动］ 教师：首先请各小组汇报课前收集到的有关基因工程应用的事例资料。 学生分组汇报并交流课前收集资料的情况。 学生1：基因工程在农业上的应用主要表现在两方面： （1）通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。 （2）用基因工程的方法可培育出具有各种抗逆性的作物新品种。现在已培育出一批分别具有抗病、抗虫、抗除草剂、抗盐碱、抗病毒、抗干旱等性状的转基因农作物。1996至2000年的短短五年间，全球转基因作物从170×104 hm2发展到4 420×104 hm2，其推广速度是前所未有的…… 学生2：基因工程在畜牧养殖业中的应用 基因工程在畜牧养殖业上的应用也具有广阔的前景，科学家将某种特定基因与病毒DNA构成重组DNA，然后，通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中，并由这种受精卵发育成新个体，这就是我们在前面提到的转基因动物。通过转基因动物人们
微生物和基因工程 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程微生物的构建包括以下基本步骤： 用限制性内切酶对质粒的特定位点进行切割，形成粘性末端； 用同样的限制性内切酶对含有目标基因的外源DNA分子进行切割，两端形成与质粒上的粘性末端相互补的单链； 将切割好的质粒和基因片段混合并通过DNA连接酶键合在一起完成基因重组并重新成为环状分子； 将重组质粒转化到微生物细胞内。 基因工程的基本过程： 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 限制性内切酶： 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子 分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 基因载体的结构和功能： 生物学来源： 细菌质粒噬菌体病毒其它 多个不同来源独立的元件，包括高等生物的一些基因组元件结合使用，从而产生了一系列新的基因载体 质粒载体的结构和功能 大部分为双链闭环超螺旋DNA分子，也有线性质粒，质粒的分子规模从2kb到1mb。 质粒主要见于细菌，也见于古细菌和酵母菌。 质粒编码的性状一般包括抗性特点，如抗生素抵抗，不利环境抵抗（重金属抗性），产毒特性和抗毒特性等。 从质粒本身的特性来看，质粒具备复制特性，分离特性，判别特性和进化特性。 基本特性 复制子遗传标记多克隆位点其它 许多元件往往只在一定的生物宿主环境下才表现出对应的生物学特点 遗传筛选标记 抗生素抗性标记 抗突变标记 人工插入失活和α互补标记 抗生素标记： 氨苄青霉素抗性（ampr）基因编码β-内酰胺环水解酶，分泌到细菌膜周隙水解氨苄青霉素。卡那霉素抗性基因（kanr）其决定质粒对氨基糖苷类抗生素的抵抗。在质粒在大肠杆菌使用，
基因工程及其应用 一：【考点解读】 1、简述基因工程的基本原理 2、举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用 3、关注转基因生物和转基因食品的安全性 【学习重点：】基因工程的基本原理和安全性问题 【学习难点：】基因工程的基本原理和转基因生物与转基因食品的安全性 二：【知识梳理】 1. 基因工程概念： 2.原理： 3.基因工程的基本工具：（1）.基因的“剪刀” 限制性内切酶能够对DNA分子进行切割，它具有和特异性。即一种内切酶只对DNA分子内特定的碱基序列中的特定位点发生作用，把它切开。（2.）基因的“针线”能够将限制酶切开的黏性末端连接起来，从而使两个DNA片段连接起来。 注：限制酶与连接酶作用的位点都是键 （3）.基因的运载体作用：将外源基因送入受体细胞 种类：和。其中质粒是基因工程中最常用的运载体，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。特点：是细胞染色体外能的很小的环状DNA 分子，存在于许多细菌及酵母菌等生物中。 条件：(1)能在宿主细胞内并稳定保存，并对宿主细胞正常生活没有影响； (2)具有个限制酶切点，便于与外源基因连接 4.基因工程的基本步骤： 三：【例题精析】 在植物基因工程中，用土壤农杆菌中的Ti质粒作为运载体，把目的基因重组入Ti质粒上的T—DNA 片段中，再将重组的T—DNA插入植物细胞的染色体DNA中。 （1）科学家在进行上述基因操作时，要用同一种分别切割质粒和目的基因，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就可通过而黏合。 （2）将携带抗除草剂基因的重组Ti质粒导入二倍体油菜细胞，经培养、筛选获得一株有抗除草剂特性的转基因植株。经分析，该植株含有一个携带目的基因的T—DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论
第十章微生物与基因工程 一、要点提示 1．基因工程，又称基因操作或重组DNA技术，是体外对DNA分子进行加工、剪切、操作及施工，把不同来源的DNA分子重新组合构建载体后，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，获得大量基因产物，或者使生物体表现出新的形状。基因工程是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学和工程学原理和方法而开拓的技术领域。它的出现改变了生物科学的面貌，促使现代生物技术迅猛发展，并带动了现代生物技术产业的兴起。 2．基因工程的基本过程是目的基因的获得→重组载体的构建→重组载体导入宿主细胞→阳性重组子的筛选→基因的测序和鉴定→基因的控制表达。基因工程的每一个环节都离不开微生物的参与。 3．基因工程给人类带来的正面影响是十分巨大的，基因工程产品及其技术在医学、工业、农业及其他领域的应用愈来愈广泛，并已经带来了令人可喜的结果。但是基因工程潜在的危害性也不容忽视，任何滥用和非和平的开发(生物战争)都会给人类带来毁灭性的灾难。 二、重点、难点剖析 1．微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下6个方面可以说明。 (1)微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；目的基因的获得可以是通过构建基因文库或cDNA文库来筛选目的基因片段；或通过PCR技术进行基因的体外扩增，包括对活的不可培养微生物基因的体外扩增，并对基因进行定点诱变和分子定向进化。 (2)基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成。
(3)基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。 (4)微生物细胞是基因克隆的宿主，基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主是原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母。即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中。 (5)大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导人大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，构建成工程菌，然后利用微生物发酵工程来实现。 (6)有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此，微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。 2．微生物与基因克隆载体。 (1)克隆载体的基本要求。 ①载体在细胞中必须能够独立自主地复制。 ②载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，位于载体复制的非必需区，便于外源DNA的插入。 ③载体必须具有可供选择的遗传标记，例如：具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。 ④载体DNA须易于生长和操作。 (2)基因工程中使用的载体。到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6大类：质粒载体，λ噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，真核细胞的克隆载体，人工染色体等。原核生物大肠杆菌的克隆载体比较见表10-1。
第十章微生物与基因工程 基因工程（genetic engineering）或重组DNA技术(recombinant DNA technology) 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。基因工程这个术语可以用来表示特定基因操作，也可泛指它所涉及的技术系统，其核心是构建重组体DNA的技术。因此，基因工程和重组DNA技术有时也就成为同义词。 基因工程是在现代生物学、化学和化学工程学以及其他数理科学的基础上产生和发展起来的，并有赖于微生物学的理论和技术的发展和运用，微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着不可替代的作用。基因工程的出现是本世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，它使得生物科学获得迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。它的出现标志着人类已经能够按照自己意愿进行各种基因操作，大规模生产基因产物，并且去设计和创建新的基因、新的蛋白质和新的生物物种，这也是当今新技术革命的重要组成部分。 第一节基因工程概述 一、基因工程的发展历史 基因工程是在本世纪70年代初开始出现的。三项关键技术的建立为基因工程奠定了基础，这三项技术是：DNA的特异切割、DNA的分子克隆和DNA的快速测序。 早在50年代，阿尔伯（Arber）的实验室就已发现大肠杆菌能够限制侵染的噬菌体，60年代末进而证明大肠杆菌细胞内存在修饰–限制系统，即给宿主自身DNA打上甲基化标记并切割入侵的噬菌体DNA。1970年史密斯（Smith）等人从流感嗜血杆菌（Hemophilus influenzae）中分离出特异切割DNA的限制酶。次年，内森斯（Nathans）等人用该酶切割猴病毒SV40 DNA，最先绘制出DNA 的限制图谱（restriction map）。1973年史密斯和内森斯提出修饰–限制酶的命名法。限制性核酸内切酶可用以在特定位点切割DNA，限制酶的发现使分离基因成为可能。为表彰上述科学家在发现和使用限制酶中的功绩，1978年的诺贝尔医学奖被授予阿尔伯、内森斯和史密斯。 1973年，科恩（Cohen）和博耶（Boyer）等将pSC101质粒作为载体与R质粒的四环素和卡那霉素的抗性基因相融合，并将重组体DNA转化大肠杆菌，首次实现了DNA的分子克隆。 1975年桑格（Sanger）实验室建立了酶法快速测定DNA序列的技术。1977年吉尔伯特（Gilbert）实验室又建立了化学测定DNA序列的技术。分子克隆和测序方法的建立，使重组DNA技术系统得以产生。1980年诺贝尔化学奖被授予伯格、吉尔伯特和桑格，以肯定他们在发展DNA重组与测序技术中的贡献。 1977年板仓（Itakura）和博耶用人工合成的生长激素释放抑制素（Somatostatin, SMT）基因构建表达载体，并在大肠杆菌细胞内表达成功，得到第一个基因工程的产品。1982年，在建立转基因植物和转基因动物的技术上均获得重大突破。借助土壤农杆菌Ti质粒可将外源基因导入双子叶植物细胞内并发生整合，从而使植株获得新的遗传性状。同年通过基因工程方法把大鼠生长激素基因注射到小鼠受精卵的雄核中，然后移植到母鼠子宫内，由此培育出巨型小鼠。仅仅10年时间，基因工程在实践中迅速成熟，日趋完善。 二、基因工程的基本过程 生物的遗传性状是由基因（即一段DNA分子序列）所编码的遗传信息决定的。基因工程操作首先要获得基因，才能在体外用酶进行“剪切”和“拼接”，然后插入由病毒、质粒或染色体DNA片段构建成的载体，并将重组体DNA转入微生物或动、植物细胞，使其复制（无性繁殖），由此获得基因克隆（clone，无性繁殖系的意思）。基因还可通过DNA聚合酶链式反应（PCR）在体外进行扩增，借助合成的寡核苷酸在体外对基因进行定位诱变和改造。克隆的基因需要进行鉴定或测序。控制适当的条件，使转入的基因在细胞内得到表达，即能产生出人们所需要的产品，或使生物体获得