2015.11.01细菌转化：
1.将质粒和感受态细胞从冰箱中取出，放入冰上
2.在无菌操作台中，将质粒1微升加入到感受态菌20-30微升中（不要用手捂菌，手也不要碰到EP管盖）
3.冰上30min，每隔5min轻摇EP管
4.将混合液在42℃中热激90s，将质粒粘附在感受态细胞表面，立即冰上静置1min
5.加入200微升LB培养基，轻轻摇匀，37℃振荡1-2h(45min)，使菌恢复正常
6.涂板，倒扣平板12-24h
7.挑取单克隆，扩大培养（培养基中加入相应抗生素，每100ml培养基加100微升抗生素）37℃摇菌（不超过16h）
8.提质粒
Attention：涂布平板时三角涂布棒刚烧完后记得冷却一下！！！！！
涂布平板的方法：用枪将液体滴加到中间，然后从内往外画圆稀释菌，以便最后在边缘处得到单克隆
扑灭酒精灯：盖的时候多盖几下
在倒扣平板前要先让培养基吸收菌，故先正放十几分钟，然后再倒扣起码14h 让菌张起来。这个过程中不要开摇晃，直接37℃放置就好。
DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理 实质是基因重组 R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R 型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。当“转化因 子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌染色体组上的同源区段配对，并使受体染色体组的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。随着受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。 转化之所以会发生： 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种后代，不象许多人认为的（R型直接变成S 型）； 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。
1、红细胞及血红蛋白绝对性增多 ①继发性红细胞增多症 ②真性红细胞增多症 2、红细胞及血红蛋白生理性减少： 婴幼儿和15岁以下儿童、部分老年人、妊娠中、晚期 3、红细胞结构异常 嗜碱性点彩、染色质小体、卡—波环、有核红细胞 4、白细胞减少：白细胞总数低于正常值 5、中性粒细胞数量变化的临床意义 （1）中性粒细胞增多： 急性感染、严重组织损伤及大量血细胞破坏、急性大出血、急性中毒、白血病、骨髓增殖性疾病、恶性肿瘤（ （2）中性粒细胞减少： 感染、血液系统疾病、物理化学因素损伤、单核-吞噬细胞系统功能亢进、自身免疫疾病 6、粒细胞缺乏症：中性粒细胞绝对值低于*109/L 7、核左移：周围血中出现不分叶核粒细胞（杆状核粒细胞、晚幼粒、中幼粒、早幼粒等）的百分率增高（超过 5%）时称为核左移 核右移：周围血中若中性粒细胞核出现5叶或更多分叶，其百分率超过3%者称为核右移 8、中性粒细胞中毒性改变： 细胞大小不均中毒颗粒空泡形成杜勒小体核变性 9、中毒颗粒：中性粒细胞胞质中出现粗大，大小不等、分布不均、染色呈深紫红或紫黑色，谓之为~ 10、淋巴细胞增多的临床意义 感染性疾病、肿瘤性疾病、急性传染病的恢复期、移植排斥反应 11、网织红细胞：是晚幼红细胞脱核后的细胞。 [ 12、血小板减少的临床意义： （1）血小板的生成障碍 （2）血小板破坏或消耗增多 （3）血小板分布异常 13、血细胞比容：又称血细胞压积（PCV），是指血细胞在血液中所占容积的比值 14、溶血性贫血：是指各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，而骨髓造血功能不能相应代偿而 发生的一类贫血。 15、血细胞发育过程中形态演变的一般规律 （1）细胞体积 胞体逐渐大→小 （2）细胞质 量：少→多 染色：深蓝→浅染，甚至淡红 颗粒：无颗粒→嗜天青颗粒→特异性颗粒 （3）细胞核 · 大小：大→小 形态：规则→不规则 染色质：细致疏松→粗糙致密
Trizol 法提取RNA实验步骤 需要的试剂： 氯仿 异丙醇 75%乙醇（in DEPC-treated water) RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC是为了减少RNase 的降解) to 0.01% (v/v)。静置过夜，然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水] 1、组织匀浆 (1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。 (2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。 (3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。 2、相分离 加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。RNA 只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。 3、RNA沉淀 将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 rpm ，10 minutes，2 - 8°C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。 4、RNA洗涤 去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。 5、RNA再溶解 去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。 用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60°C。测浓度后-20°C保存。 6、测浓度：取2μl 储存液加入另一个EP管中，再加入98μl无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，测OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml 较准。浓度太高要稀释以后再测定。 7、RNA鉴定：甲醛变性琼脂糖电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。 注意事项: 在使用TRIZOL的时候要带手套和眼罩，避免接触到皮肤和衣服，使用化学通风橱，防止蒸汽吸入。 除非特别说明，所有的操作均在15-30°C下进行，所用的试剂均放置于15-30°C。 组织在加入氯仿之前是可以在-60—-70°C放置一个月。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8°C下至少可以放置一周，在–5— -20°C至少可能放置一年。
大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养 2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用 3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时 8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天 9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12.离心,弃上清液
13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散 15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
提蛋白及WB得步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、 当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心 管、细胞刮板、开低温高速离心机 细胞裂解液配制: 1ml celｌlｙsis 10ul NP－40(离心机后) 25ul 焦磷酸钠 ４0ul ＮaＦ 1ul β—甘油磷酸 2 ul Na3VO４ 1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱) 10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒) 细胞裂解与收集 1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻 摇),倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。 3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从 上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、 细胞破碎 4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到 离心管得壁与底部) 超声波设置: 工作功率5% 工作时间３min 开机时间15s,关机时间３０s 温度０度, 报警温度1度 5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,) 蛋白保存 6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保 存。 注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。 ＢCA测定蛋白浓度 1、测空白板,选差异较小得孔。 BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595 2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。 取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS
细菌DNA的提取方法 针对一些不易于提取的细菌的方法: 试验试剂： 抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0) 25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl 10MLiCl 2MLiCl DEPC-water（抑制RNA酶活性） 3MNaAc(pH5.2) 96%乙醇 70%乙醇 试验步骤： 1、抽提缓冲液65℃预热。 2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。 3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。 4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。 5、重复再作一次步骤4。 6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C 下沉淀。
7、以2,000rpm，离心10min。 8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。 较为常用的细菌DNA提取方法： 实验步骤： 1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。 2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。 3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul 的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h. 4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。 5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。 6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇． 真菌DNA提取总结的两种方法： 第一种方法： 试验步骤： 1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。 2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。
R型细菌如何转化成S型细菌 R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。当“转化因子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌DNA的同源区段配对，并使受体DNA的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。随着受体菌DNA进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此DNA发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。 转化之所以会发生： 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种后代，不象许多人认为的（R型直接变成S型）； 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。 三、真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同，不会发生转化（转化本身只发生在同种菌株间或近缘菌株间）。我们可以放心去吃想吃的东西，包括被加热杀死的S型肺炎双球菌。 四、S型可以变成R型吗？当然可以！产荚膜细菌由于有黏液物质，菌落表面湿润、有光泽、黏液状，称光滑型—S型（smooth）；无荚膜细菌由于无黏液物质，菌落表面干燥、粗糙，称粗糙型—R型（rough）。自然状态下通过基因突变来完成，不是转化。人工方法是诱变，物理、化学方法都行，变过来的还能再变回。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/5c4581380.html, 布鲁氏菌病实验室诊断技术 作者：王勤 来源：《湖北畜牧兽医》2018年第04期 摘要：对实验室常用的几种布鲁氏菌病检测方法进行了分析，为实验室检测不同动物群体选择相应的诊断方法提供参考。 关键词：实验室；布鲁氏菌病；检测方法 中图分类号：S858 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2018）04-0025-01 布鲁氏菌病（简称布病）是一种危害性极大的传染性人兽共患病，在世界范围内广泛流行。其主要临床症状为雌性动物流产、生育力下降，雄性动物睾丸炎，甚至不育，给畜牧业造成严重的损失。 1 病原学方法 从疑似感染布病的个体中提取血液或其他样本，对样本处理后在选择培养基上培养，如有菌落生长则通过细菌染色、生化试验等方法鉴别是否为布鲁氏菌，该方法准确性高，但危险性高、操作难度大、分离时间长，对试验环境要求严格，需在特定试验条件下进行。 2 PCR技术 随着分子生物学技术的发展和普及，可通过 PCR、荧光定量PCR以及环介导等温扩增（LAMP）等技术对布病进行诊断。其中PCR技术具有特异性高、灵敏度好、操作较简单等优点，可用于鉴别不同种属的布鲁氏菌。荧光定量PCR 技术相较于传统 PCR 技术具有灵敏度高、高通量和方便快捷等优势，但由于其引物和探针设计较为困难，且限制较多，对专业技术有较高要求。LAMP可用于对奶、组织等样本的检测，具有操作方便、可视性强、特异性高和试验条件要求低等优点，其灵敏性可达10 pg/反应，且可以在普通水浴下完成反应，适于基层检测使用。但是LAMP存在多重扩增较为困难，样本污染等问题，且对引物设计要求很高限 制了该技术的进一步使用。 3 血清学检测方法 3.1 虎红平板凝集试验（RBPT） BRPT是在平板上将30 μL抗原与30 μL血清样品混合，4 min内观察是否出现凝集来判定阴阳性，该法使用方便、结果判定简单、价格低廉，适用于各种家畜布病的田间筛选，在国际上广泛应用，但是特异性较差，易出现假阳性。
Western blot实验蛋白提取及定量、相关试剂配制、电泳、转膜及显色过程步骤 高征 2014年6月
第一部分 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提过程(碧云天试剂盒) 一、原理 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的两个细胞组份就是细胞核和细胞浆。分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如EMSA(也称gel shift)，footprinting等。 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白与细胞浆蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞核蛋白与细胞浆蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。 本试剂盒是通过细胞浆蛋白抽提试剂A和B，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。本试剂盒可以抽提50个样品，如果每个样品的数量为约二百万细胞或约30-50毫克组织。 二、注意事项 1.需自备PMSF。PMSF一定要在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。 2.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 3.本试剂盒对于组织样品，仅适合于新鲜组织，对冻存过的组织抽提效果很差。可以抽提的组织样品数通常不足100个。 4.使用本试剂盒抽提到的细胞核蛋白与细胞浆蛋白均可直接用碧云天生产 的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋白浓度。但不适合用Bradford法测定蛋白浓度。 5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 三、使用说明 1. 准备溶液：室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF 的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。（蛋白酶抑制剂可酌情翻倍） 2. 对于贴壁细胞：用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液（0.5%
一、肺炎双球菌转化实验和噬菌体侵染细菌实验的比较 （1）肺炎双球菌转化实验中的相互对照 S DNA R 型 糖类 + 型 相互对照 ○ 1DNA 是遗传物质 细 蛋白质 脂质 细 ○ 2其他物质不是遗传物质 菌 DNA 分解物 菌 肺炎双球菌转化实验的结论：证明DNA 是遗传物质，蛋白质不是遗传物质。 噬菌体侵染细菌实验结论:证明DNA 是遗传物质，不能证明蛋白质不是遗传物质，因蛋白质没有进入细菌体内。 二、有关碱基数量计算的归类与应用 1. DNA 分子自我复制的碱基配对 A-T,G-C,T-A,C-G 。 （2）“转录”中的碱基互补配对：A-U,G-C,C-G,T-A 。 (3)“翻译”时的碱基互补配对：A-U,G-C,U-A,C-G 。 (4) “逆转录”时的碱基互补配对:A-T,U-A,G-C,C-G 。 3． DNA 复制过程中的碱基数量计算
某DNA分子中含某碱基a个， （1）复制n次需要含该碱基的脱氧核糖核苷酸数为a(2n-1); (2) 第n次复制，需要含该碱基的脱氧核苷酸数为a2n-1 4.碱基比例的运用 由核酸所含碱基种类及比例可以分析判断核酸的种类。 （1）若有U无T，则该核酸为RNA。 （2）若有T无U，且A=T,G=C，则该核酸一般为双链DNA。 （3）若有T无U，且A≠T,G≠C，则该核酸一般为单链DNA。 三、与中心法则相关的几个问题 1．中心法则中遗传信息的流动过程为： RNA 蛋白质（性状） （1）在生物生长繁殖过程中遗传信息的传递方向为 （基因） mRNA 蛋白质 (2)在细胞内蛋白质合成过程中传递信息的传递方向（如胰岛细胞中胰岛素合 DNA mRNA 蛋白质 （含胰岛素基因） (3)含逆转录酶的RNA病毒在寄主细胞内繁殖过程中，遗传信息的传递方向的 为 RNA DNA mRNA蛋白质 （4）DNA病毒(如噬菌体)在寄主细胞内繁殖过程中，遗传信息的传递方向为（基因）mRNA蛋白质 （5）RNA病毒（如烟草花叶病毒）在宿主细胞内繁殖过程中，遗传信息的传递方向为 RNA蛋白质 2．中心法则体现了DNA的两大基本功能 （1）图中○1体现了对遗传信息的传递功能，它是通过DNA复制完成的，发生于 亲代产生子代的生殖过程或细胞增殖过程中。 逆转录
在提取植物内生菌之前，植物需要表面灭菌，其具体操作为将植物浸泡在添加了0.02%的Tween-20的质量分数为1%的次氯酸钠溶液中1 min，再将植物浸泡在70%酒精中1 min，然后用硫代硫酸盐/Ringer’s（林格氏液）清洗3次，每.次1 min。根和茎（土表面以上1 cm处）都要灭菌处理，将根茎切成片状。为了更好地分析细菌的位置，灭菌后茎表皮撕下，茎内部按照之前的方法灭菌。表皮组织和根最后一次淋洗液中的细胞都用来提取DNA。 植物不同组织的内生菌群落DNA提取通过直接研磨植物组织，步骤为溶解、提取和纯化步骤（方案一），或者在DNA提取前从片状植物组织中淋洗出细胞（方案二）。 东南景天表面灭菌方法：整株植物用自来水冲洗30 min，用蒸馏水洗3次，每次3 min。用吸水纸吸去植物表面水分，用无菌剪刀在根基部将根系剪下，与植物地上部分开。将根系用70 %酒精浸泡2 min，无菌水洗3次，3 % NaClO浸泡2次，每次1 min，然后用无菌水冲洗3次，每次2 min，最后一次清洗液涂LB平板。 1. 将2 g左右消毒后植物组织于无菌研钵中，加5 mL磷酸钠缓冲液（19.9 g Na2HPO4·H2O，1.27 g NaH2PO4·2H2O，H2O 定容到1 L）研磨至匀浆。 2. 将植物匀浆转移至50 mL无菌离心管中，摇床200 rpm振荡1-2 h，使细菌细胞尽可能的从植物组织中释放出来。 3. 取4 mL悬液于新的无菌离心管中，12 000×g离心10 min收集菌体细胞。 4. 弃上清，将收集的菌体细胞重新溶于550μL 1×TE buffer（Tris-EDTA；pH8）中加入10 mg mL-1溶菌酶10μL，37℃水浴1-4h。 5. 加入50μL 20% SDS和8μL 20 mg mL-1蛋白酶K，混匀，65℃水浴3h，期间轻轻上下颠倒混匀数次。 6. 加入200μL 5M NaCl，涡旋振荡15 s，12000×g离心10 min。 7．取上清液，并向上清液中加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），彻底混匀，12000×g离心10 min。 8. 上清液转移至新的无菌离心管中，重复步骤7一次。 9. 上清液转移至新的无菌离心管中，加入0.6倍体积（0.6 vol）的冰冷的异丙醇，4℃放置1 h。 10. 4℃，12000×g离心10 min，弃上清。 11. 沉淀用70%冰乙醇清洗，离心，弃上清。 12. DNA沉淀室温风干后，用无菌超纯水溶解。 13. DNA纯化采用TIANquick Midi Purification Kit。
蛋白提取实验步骤： 1、细胞总蛋白提取 A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。 B、对于贴壁细胞: a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。 b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。 c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。 C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 2、组织蛋白提取： A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。 B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。 C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。 注意事项 1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。 2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。 3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打， 或再加入适量裂解液以保证充分裂解。 5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保 存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复 冻融。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
格里菲思肺炎双球菌体内转化实验出现S型活细菌的可能性及排除 Yong037整理 实验目的：研究肺炎双球菌是如何使人患肺炎的 实验材料：小鼠、肺炎双球菌（S型和R型） 实验过程： 实验结论：第一组说明R型肺炎双球菌无毒性，不会使小鼠患败血症死亡； 第二组说明S型肺炎双球菌有毒性，使小鼠患败血症死亡； 第三组说明加热杀死的S型肺炎双球菌无毒性，不会使小鼠患败血症死亡； 第四组说明已经被加热杀死的S型细菌中，必然含有某种促成将R型细菌转化形成有毒性的s型活细菌的活性物质——转化因子，这种转化因子将无毒性的R型活细菌转 化为有毒性的S型活细菌。 第四组出现S型活细菌的可能性及排除： 1、基因突变：R型活细菌和S型活细菌均有三种亚型：I-R型、Ⅱ-R型、Ⅲ-R型和I-S型、Ⅱ-S 型、Ⅲ-S型（构成各亚型S细菌荚膜的多糖存在差异）；格里菲斯通过实验发现，某亚型的S型菌通过连续的多代培养，其中极少数可能突变成相应亚型的非致病的R型肺炎双球菌，即I-S型—I-S型、Ⅱ-S型一Ⅱ-R型、Ⅲ-S型一Ⅲ-R型；他还发现，向小鼠皮下注射大量R型活细菌，有时可获得相应亚型的S型菌；即R型肺炎双球菌与S型肺炎双球菌只能发生同型突变。格里菲斯在进行实验时，采用的是Ⅱ-R型菌与加热后杀死的Ⅲ-S型菌，将它们混合后注入小鼠体内培养，最终在小鼠体内只分离得到了Ⅲ-S型的活细菌。如果S型菌是R型菌通过基因突变产生的，则分离得到的应该是Ⅱ-S型细菌，而实际得到却是Ⅲ-S型的活细菌，故第四组出现的有毒性的S型菌不是R型菌通过基因突变而来的。 2、S型细菌“复活”：加热会破坏蛋白质的空间结构，且该过程不可逆；也会使DNA变性：加热会使氢键断裂，DNA双螺旋解开成单链，当温度缓慢降低时单链又可以重新形成双链，称为DNA复性，但蛋白质变性失活后，降温也不可能再恢复其功能，所以，加热杀死的S菌的蛋白质失活了，生命活动就不可能再恢复，而其DNA还是有作用的；再者，1933年，阿洛维将Ⅱ-R型细菌和Ⅲ-S型细菌的无细胞提取液（所有完整细胞、细胞碎片、荚膜分子都通过离心和过滤从提取物中去掉）混合，培养皿上仍长出了Ⅲ-S型细菌。这否认了R型细菌以某种方式使加热杀死的S型细菌“复活”。 3、转化（基因重组）：R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40min内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R型菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）通过自溶过程，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称之为“转化因子”。当“转化因子”遇到“感受态”的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4×106～5×106的DNA片段，然后双链拆开，随后其中一条链被细胞膜上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条单链推进受体细胞（该过程称为DNA的结合和摄取），与受体菌DNA上的同源区段配对，并使受体菌DNA的相应单链片段被切除，从而将其替换，形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，可能呈
细菌DNA提取方法综述 姓名：刘燕 学号：1430170088 班级:周二班 摘要：高效稳定的细菌基因组DNA提取方法对后续分子生物学的研究有着重要的意义。不同的方法提取的DNA产量和纯度等方面有差异，会对后续步骤产生很大影响。本文综述了目前广泛使用的DNA 提取方法。 关键词：细菌、基因组DNA、提取方法 现代分子生物学技术如DNA 重组技术(又称基因工程)、分子克隆技术、PCR技术等，为进一步认识生命活动的本质，更好地利用其规律为人类服务提供了重要手段(马尧等, 2005)。但是，DNA 分离是成功利用这些技术的第一步，也是非常重要的一步，可以说DNA 质量的好坏直接决定了后续实验的成败。 [1] 基因组DNA提取方法不同，对细菌DNA降解程度的影响也不同，因此，从细菌中提取基因组DNA的潜在困难较大。目前国内外很多学者都在积极探索并研究各种高效的细菌基因组DNA提取方法，本文就近10年来国内外有关细菌基因组DNA的提取方法进行综述。[2] 1 DNA细菌提取方法 综合国内外文献，大致将细菌基因组DNA取提方法分为3大类：机械法、化学法和酶法。机械法包括冻融法、超声波法和玻璃珠法等; 化学法包括加入SDS 和苯酚等; 酶法包括加入裂解酶、蛋白酶K和溶解酶等。[3] 1.1机械法 液氮冷冻研磨破碎细胞壁的方法通常用于植物总基因组DNA的提取破碎细胞的物理方法。对于不同的样品，需要根据具体的实际情况对超声条件进行优化。超声波法常与其他方法结合使用，如与复合螯合剂( 脱氧胆酸钠+PEG +Chelex 100) 等结合使用。微珠振荡法也是常被研究者们采用的一种DNA 提取方法。赵文怡等[10]比较不同方法破除金黄色葡萄球菌细胞壁时，发现玻璃微珠法可以
细菌学诊断技术 随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。 一、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。Rosa 等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。 Delise等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。 二、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术 在细菌诊断中利用免疫学的各种方法日益受到人们的极大关注，从而简化了病原微生物的鉴定手续。 1．抗血清凝集技术 早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，今天广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。 2．乳胶凝集实验 将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157；H7 3．荧光抗体检测技术
细菌总蛋白和膜蛋白提取方法 一、从新鲜样品中提取总蛋白（简易法） 1、自配裂解液（pH ）：50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA, 100 mM NaCl，% Triton X-100，调pH 值至备用；用前加入100 μg/ml 溶菌酶，1μl/ml 的蛋白酶抑制剂PMSF。该裂解液用量为10-50ml 裂解液/1g湿菌体。 2、将40ml 菌液在12000g，4℃下离心15分钟收集菌体，沉淀用PBS悬浮洗涤2遍，沉淀加入1ml裂解液悬浮菌体。 3、超声粉碎，采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min，反复冻融超声3次至菌液变清或者变色。 4、1000g离心去掉大碎片，上清可直接变性后PAGE电泳检测，或者用1% SDS溶液透析后冻存。 缺点：Western blotting结果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。 二、从Trizol裂解液中分离总蛋白 1、Trizol溶解的样品研磨破碎后，加氯仿分层，2-8℃下10000g离心15min，上层水相用于RNA提取，体积约为总体积的60%。 2、用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。每使用1ml Trizol加入无水乙醇混匀，室温放置3min，2-8℃不超过2000g离心5min。 3、将上清移至新的EP管中，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml Trizol加入异丙醇，室温放置10min，2-8℃下12000g离心10min，弃上清。 4、用含有0.3M 盐酸胍的95%乙醇洗涤。每1ml Trizol加入2ml洗液，室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清，重复洗涤2次。最后加入2ml无水乙醇，涡旋后室温放置20min，2-8℃下7500g离心5min，弃上清。 5、冷冻干燥5-10min，1%SDS溶液溶解，反复吹打，50℃温浴使其完全溶解，2-8℃下10000g 离心10min去除不溶物。 6、替代方案：将3中的酚醇上清液移至小分子量透析袋中，在2-8℃的1% SDS溶液中透析3次，1000g离心10min去除沉淀，上清可直接用于蛋白实验。 三、从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白（Triton X-114去污剂法） 1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至备用。
优选精品资源欢迎下载选用 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
细菌转化实验原理和操作步骤 转化（ transformation ）是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。 关键词：细菌转化细菌转化 一．实验目的 1 ．以 pGLO 质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本原理及方法。 2 ．验证 DNA 是遗传物质，加深对中心法则的理解。 二．实验原理 转化（ transformation ）是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转化方法有 CaCl 2 法 ( 化学转化法 ) 和电转化法。本实验是用 pGLO 细菌转化试剂盒中提供的 pGLO 质粒来转化大肠杆菌，所用方法为 CaCl 2 转化法。 pGLO 质粒： pGLO 质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光蛋白 (GFP) 的基因，一个为抗生素氨苄青霉素抗性基因。此外，该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。
三．实验材料 受体菌：K12 HB101 质粒： pGLO plasmid 转化液（ CaCl2 ） 氨苄青霉素（ amp ） 阿拉伯糖（ ara ） 培养基：固体 LB 、液体 LB 接种环、移液器等 四．实验步骤 1. 准备平板：每组： 1 块 LB 平板， 2 块 LB/amp 平板， 1 块 LB/amp/ara 平板 2. 准备感受态细胞：用250 μ l 无菌水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受态细胞。 3. 活化受体细胞：挑取 1 环K12 HB101 菌液，于 LB 培养基上 37 ℃活化16-24h 。 4. 转化： 1）在两只无菌离心管 上分别标 记 +DNA, -DNA 。 2）在上述两管中分别 加入 250 μ l 转化液。 3) 迅速置于冰上。 4）各挑取活化好的受 体菌的一 个单菌落，悬浮于两管 转化液中。 5）在标有 +DNA 的管 中加入一 环质粒 DNA ，而标有 -DNA 的管中不加。 6）将上述两管于冰上 放置 10min 。
实验三细菌染色体D N A的提取和检测
实验三细菌染色体DNA的提取和检测 一、实验目的 学习和掌握提取细菌核酸的方法； 理解DNA电泳的基本原理和各种影响因素； 学习制胶、水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 二、实验原理 核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞、血液、组织、唾液、尿液等多种标本中，其分离方法是多样的。总的来说核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提，分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收集。本实验细菌染色体DNA的提取主要是用溶菌酶、SDS和蛋白酶K处理细菌，将蛋白质变性使其与DNA分离。 电泳是指混悬于溶液中的电荷颗粒,在电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的现象。DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片断的分离，重组了的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：一是聚丙烯酰胺凝胶电泳：适合分离1kb以下的片断，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。二是琼脂糖凝胶电泳：可分离的DNA片断大小因胶浓度的不同而异。电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1h 即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中经常使用。 三、实验材料和仪器 1、实验材料：某细菌
2、实验仪器:1.5mL离心管；枪头；移液器；摇床；台式高速离心机；电泳槽；电泳仪；微波炉；电泳板和梳子；紫外分析仪；数码相机等 四、实验试剂 （一）： 1、TE缓冲液（10：1）：10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA,pH 8.0。本次试验略去。 2、裂解缓冲液（1mL体系：40mmol/L Tris-HCl，pH8.0，40ul；2mmol/L CH3COONa，6.6ul；1mmol/L EDTA，2ul；10%SDS，1ul；其余用水补齐）（现用现配，老师处） 3、溶菌酶：100μg/mL（已配好，老师处） 4、Proteinase K：10mg/mL （已配好，老师处） 5、10%SDS（已配好，老师处） 6、NaCl：5mol/L 7、Tris饱和苯酚（老师处加样） 8、三氯甲烷（老师处加样） 9、无水乙醇、70%乙醇（已配好，老师处） （二）： 1、50*TAE电泳缓冲液：242.0gTris碱；100mL0.5mol.L-1/EDTA(pH8.0)；57.1mL冰醋酸。定容1L。（老师已配好） 2、EB母液（溴化乙锭，储存液用水配制为1mg.mL-1）：称取一定量的EB溶于无菌水中，室温闭光保存；EB为强诱变剂，实验中要防止污染。（老师已配好）