我国新生隐球菌的基因分型和分子流行病学分析
中文摘要
本研究通过分子生物学技术，如PCR指纹法、PCR特异扩增、PCR-RFLP、MLST、系统发育研究来分析我国新生隐球菌临床分离株的分子特征，旨在阐明我国新生隐球菌基因型和交配型在临床中的分布及其分子流行病学特征。主要工作包括以下三个部分：
一、PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较
目的探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％～97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％～100％之间。分子发育树中，VNI
－VNIV基因型、VGI－VGIV基因型分别聚在一类。结论针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。
二、国内110株新生隐球菌临床株变种、基因型和交配型分析
目的对国内部分地区的新生隐球菌临床株进行分子流行病学调查，分析其变种、基因型和交配型的构成和分布。方法1、PCR指纹分型法：以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物对模板进行PCR扩增，将所有受试菌株鉴定到8种主要基因型水平。2、利用变种和交配型特异性引物扩增分型法，区分格鲁比、新生和格特变种，同时鉴定α和a交配型。结果 110株临床株中，98株（89.1％）为格鲁比变种，均为VNI基因型和α交配型；9株（8.2％）格特变种，包括VGI基因型、α交配型8株（7.3％）和VGII 基因型、α交配型1株（0.9％）；2株（1.8％）为AD杂合体，VNIII 基因型，-/α和α/-交配型各1株；1株（0.9％）为新生变种，VNIV 基因型和a交配型。结论我国新生隐球菌临床株包含3个变种和AD 杂合体。与国外情况比较，相似的是国内临床株中绝大部分为α交配型菌株，且格鲁比变种中的VNI基因型占了其中的大部分；但未发现VN II、VG III和VGIV基因型菌株。
三、我国致病格特隐球菌的基因亚型分析
目的分析我国致病格特隐球菌的基因型和基因亚型，探讨其与世界范围内格特隐球菌的亲缘关系和分子流行病学联系。方法扩增国内9株格特隐球菌临床株的3个非连锁位点即IGS1（基因内间隔
区）、PLB1（磷脂酶编码基因）和GEF1（交配型位点内基因）部分可变区片段，检索GenBank上相应位点的核酸序列信息，进行多位点的序列比对和系统发育分析；选择针对MF基因(编码性激素) 的PCR特异扩增法鉴定交配型。结果1、国内8株VGI基因型和α交配型菌株在IGS1、PLB1和GEF1位点上的所测序列与以菌株WM276为代表的一种基因亚型完全相同；国内首株VGII基因型和α交配型菌株在IGS1和PLB1位点所测序列与以菌株R272为代表的一种基因亚型一致。2、针对GEF1基因部分片段的序列和聚类分析准确鉴定受试格特隐球菌的基因型和交配型。结论1、多位点序列分析表明，我国致病格特隐球菌VGI基因型与世界上分布较广的一种基因亚型相似，国内首株VGII基因型菌株与温哥华岛致病性弱的VGIIb基因亚型亲缘关系接近。2、GEF1基因的序列和聚类分析可用于格特隐球菌基因型和交配型的双重鉴定。
关键词：新生隐球菌；基因型；PCR指纹分型；PCR-RFLP；变种；基因型；交配型；格特隐球菌；基因亚型；系统发育分析
GENOTYPING AND MOLECULAR EPIDEMIOLOGIC ANALYSIS OF THE CRYPTOCOCCAL ISOLATES FROM CHINA
ABSTRACT
In this study, several molecular typing techniques, such as PCR fingerprinting, PCR assays with specific primers, PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), multilocus sequence typing (MLST) and phylogenetic analysis, were conducted to analyze the population structure and molecular characteristics of the clinical cryptococcal isolates from China. Our aim is to elusidate the geographic distribution of the molecular types and mating types of clinical cryptococcal isolates and the traits of molecular epidemiology of this pathogen in China. The whole work was classified into three parts as follows:
Part one:Comparison of PCR-RFLP analysis and PCR fingerprinting in genotyping of Cryptococcus neoformans species complex
Objective To evaluate the role of PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) aimed at structure gene g6341 in genotyping
of Cryptococcus neoformans and compare it with the PCR fingerprinting analysis. Methods Cryptococcus neoformans isolates were subtyped with PCR fingerprinting, in which the minisatellite-specific core sequence of wild-type phage M13 was used as single primer. Structure gene g6341 was selected for PCR-RFLP analysis by sequence alignments of multiple genes. A pair of primers was developed based on conserved region of g6341 gene. PCR products were digested with appropriate restriction endonucleases and RFLP profiles were analyzed. Partial sequence analysis of the gene g6341 of distinct molecular types of Cryptococcus neoformans was done. Phylogenetic analysis was used to study the relatedness between these molecular types. Results Multiple gene sequence analysis showed，g6341 was suitable for RFLP analysis. In subtyping of 76 Cryptococcus neoformans isolates, the results obtained by PCR-RFLP were coincidence with those from PCR fingerprinting. Sequence analysis of g6341 gene showed, strains of eight major molecular types shared 84-97％ homology and strains affiliated to same major molecular type shared 99-100% homology. Two major clusters were apparent in the phylogram, in which cluster 1 included VNI-VNIV molecular types and cluster 2 included VGI-VGIV molecular types. Conclusion PCR-RFLP analysis aimed at structure gene g6341 is a useful tool in genotyping of C ryptococcus neoformans. Sequence analysis of g6341 genes can be used to investigate the relatedness of distinct
molecular types of C ryptococcus neoformans.
Part two:Analysis of variety, molecular and mating type of 110 clinical cryptococcal isolates from China
Objective To investigate the molecular epidemiology of clinical cryptococcal isolates from China by analyzing the variety, molecular and mating type (MAT) of them. Methods i) PCR fingerprinting, PCR amplification were performed by using the minisatellite-specific core sequence of wild-type phage M13 as single primer. Genotypes of the 110 cryptococcal isolates from China were assigned by comparison to the reference strains of the eight major molecular types loaded on gel. ii) Identification of variety and mating type were carried out by PCR using variety and mating type specific primers. Results Of 110 clinical cryptococcal isolates, strains of C. neoformans var. grubii with molecular type VNI and MATαwere the most represented (89.1%), followed by strains of C. neoformans var. gattii (8.2%), including isolates of molecular type VGI, MATα(7.3%) and molecular type VGII, MATα(0.9%); AD hybrids with molecular type VNIII, MAT-/αand molecular type VNIII, MATα/- (1.8%); and isolate of C. neoformans var. neoformans with molecular type VNIV and MATa (0.9%). Conclusion Of the clinical isolates from China, all three varieties and AD hybrids
were found. The vast majority (>99%) of strains possessed the α allele in MAT locus and most of them were C. neoformans var. grubii with molecular type VNI, which accorded with most studies of clinical molecular epidemiology in other geographic areas. However, no molecular type VNII, VGIII and VGIV isolates were found in this study.
Part three:Molecular analysis of the clinical Cryptococcus gattii isolates from China at subgenotypic levels
Objective Molecular analyses of the clinical Cryptococcus gattii isolates from China at genotypic and subgenotypic levels were conducted to elucidate the relatedness and epidemiological links between the isolates and those from other parts of the world. Methods The partially variable regions of the three unlinked loci, namely IGS1 (the intergenic spacer region), PLB1 (coding phospholipase B) and GEF1 (a gene located at mating type locus), were amplified and sequenced, and the bioinformation in these loci was obtained in GenBank for multilocus sequence alignments and Phylogenetic analyses. The specific amplification of MF gene (coding pheromone) based on PCR reaction was conducted to identify the mating types of Cryptococcus gattii isolates. Results Eight isolates of genotype VGI and mating type α from China had the same allele in all three fragments listed above, respectively, which were all identical with the reference strain WM276, a representative
isolate in a subgenotype. The first isolated genotype VGII and mating type α isolate from China had identical sequence with strain R272 in IGS1 and PLB1 loci. ii) Sequence and Phylogenetic analysis of the fragment of GEF1 gene which located at mating type locus successfully identified the genotypes and mating types of total Cryptococcus gattii isolates in this study. Conclusion i) Multi-locus sequence analyses show that the causative agents of genotype VGI in China are more related to strains from a widely distributed subgenotype in the world, and the first VGII isolate from China resembles a subgenotype VGIIb at Vancouver islands which is less virulent. ii) The Sequence and Phylogenetic analyses of GEF1 gene have the potential value in identification of the genotypes and mating types of Cryptococcus gattii simultaneously.
Key words: Cryptococcus neoformans; Molecular type; PCR fingerprinting; PCR-RFLP; Variety; Molecular type; Mating type; Cryptococcus gattii; Subgenotype; Phylogenetic analysis
上海交通大学
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前言
新生隐球菌是导致人类和动物发生致命感染的病原真菌，在免疫抑制患者，尤其是AIDS患者中发病率更高。根据不同的地理分布、生物学特性、致病特点将其分为3个变种，即格鲁比（Cryptococcus neoformans var. grubii）、新生（C. neoformans var. neoformans）和格特变种（C. neoformans var. gattii）。其中，格鲁比和新生变种主要侵犯免疫受损患者，包括恶性肿瘤、AIDS、血液病、器官移植、免疫抑制剂和糖皮质激素应用人群等；而格特变种可以感染免疫力正常人群。新生隐球菌除了对人类致病，还能引起野生动物和家畜感染。两者间的临床表现各异，在人类通常引起肺部感染和脑膜脑炎，而在动物中的表现多样，包括皮下结节、上呼吸道感染、鼻腔肿块、肺炎、视神经炎、脑膜脑炎和播散性感染等。
新生隐球菌是一种带有荚膜的担子菌酵母，在临床和环境中多以无性期的酵母相存在。1975年Kwon-Chung KJ发现该菌具有异宗配合的有性生活周期，其交配体系中存在α和a两种交配型，即MATα和MATa。交配过程中，相对交配型为α和a的单倍体细胞融合成双核菌丝，并产生融合的锁状联合，双核菌丝的末端分化成担子，在担子中进行细胞核的融合和减数分裂，最终在担子的顶端产生四条担孢子链。对交配与致病性关系的研究发现，担孢子比酵母细胞具有更强的感染能力，且有发生毒力变异的可能；α交配型菌株具有更广的分布，且格鲁比变种占了其中的大部分。动物实验证实MATα的致病性
强于MATa。Nielsen K等发现，同时感染小鼠时，MATα比MATa更易侵入中枢神经系统。为进一步研究变种、交配型的构成和致病性的关系，基于交配型位点内部分基因的特异性PCR扩增分型方法应运而生。
从免疫学上，根据新生隐球菌细胞外荚膜抗原的不同，将其分为A、B、C、D和AD 5个血清型。近年来，采用不同的分型手段，包括针对小卫星和微卫星序列的PCR指纹法、PCR－RFLP分析、序列测定、AFLP法等，将全球范围内的新生隐球菌分为8种主要的基因型，即VNI－VNIV和VGI－VGIV。研究表明，以上分型间的关系为：VNI和VNII(格鲁比变种，A型)、VNIII(AD杂合体, AD型)、VNIV(新生变种，D型)、VGI-VGIV(格特变种，B、C型)。不同主要基因型菌株间存在较大的遗传差异以及同一主要基因型内菌株遗传相似性高的特点，使得PCR-RFLP分析成为新生隐球菌基因分型中便捷和低成本的有效工具。本文首次对结构基因g6341（位于4号染色体）进行PCR －RFLP和序列分析，并与广泛采用的PCR指纹分型法进行比较，从而探讨该基因在新生隐球菌基因分型中的作用。
格特隐球菌原名新生隐球菌格特变种，2002年Kwon-Chung KJ 等将格特变种上升至种的水平，并命名其为格特隐球菌，现正被国际上普遍接受。与新生隐球菌不同，格特隐球菌主要分布于热带和亚热带地区，大多感染免疫力正常人群。根据遗传上的差异，可将其分为VGI、VGII、VGIII和VGIV 4种相对独立的基因型，且已被多种基因分型方法如PCR指纹法、PCR-RFLP、IGS和ITS位点以及多个结
构基因（如PLB1等）测序证实。多位点序列分型技术（MLST）表明，各基因型内存在多种基因亚型，另外，由于该方法分辨率高，可进一步分析不同地区菌株间的分子流行病学关系。IGS位点是rDNA 家族中进化最快的区域，其中IGS1区更是以其富有的碱基置换、插入和缺失序列而具有很高的遗传多态性，使其在基因分型中具有更高的分辨能力。PLB1基因作为PCR-RFLP的分型靶位点，其DNA序列分析同样应用于较多的基因亚型分析中。研究显示，基于格特隐球菌α交配型位点内SXI1α基因序列的系统发育树中，具有不同等位序列的α交配型菌株按基因型的不同而聚类分布。而本文通过分析格特隐球菌交配型位点内另一结构基因GEF1（共存于α和a交配型位点内）的序列，在获知交配型位点内更多基因序列特征的同时，结合上述IGS1和PLB1位点，对我国格特隐球菌临床株的基因亚型进行分析，以期初步阐明我国致病格特隐球菌的分子流行病学特征及与世界其它地区菌株的亲缘关系。
迄今为止，对我国新生隐球菌的分子流行病学研究开展的还很少，尤其是交配型的分布，国内更是没有相关报道。本研究旨在鉴定国内新生隐球菌临床株变种的基础上，进一步分析基因型和交配型的构成和分布，以期更系统的阐明我国隐球菌病的分子流行病学特征。
第一部分
PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较
新生隐球菌是导致人类及动物发生致命感染的重要病原真菌，根据其不同的地理分布、生物学特性、致病特点和遗传差异（包括DNA指纹和URA5基因序列差异）将其分为3个变种，即格鲁比(C. neoformans var. grubii)、新生(C. neoformans var. neoformans)和格特变种(C. neoformans var. gattii)[1]。从免疫学上，根据其细胞外荚膜抗原的不同，将其分为A、B、C、D和AD 5个血清型。近年来，采用不同的分型手段，包括针对小卫星和微卫星序列的PCR指纹法、PCR －RFLP分析、序列测定、AFLP法等，将全球范围内的新生隐球菌分为8种主要的基因型，即VNI－VNIV和VGI－VGIV[2-7]。研究表明，以上分型间的关系为：VNI和VNII(格鲁比变种，A型)、VNIII(AD杂合体, AD型)、VNIV(新生变种，D型)、VGI-VGIV(格特变种，B、C型)[2-5]。不同主要基因型菌株间存在较大的遗传差异以及同一主要基因型内菌株遗传相似性高的特点，使得PCR-RFLP 分析成为新生隐球菌基因分型中便捷和低成本的有效工具[2,5]。本文首次对结构基因g6341（位于4号染色体）进行PCR－RFLP和序列分析，并与广泛采用的PCR指纹分型法进行比较，从而探讨该基因在新生隐球菌基因分型中的作用。
材料与方法
1. 新生隐球菌菌株：8种主要基因型的标准株：WM148、WM626、WM628、WM629、WM179、WM178、WM161、WM779。国内临床株35株，国外临床和环境株33株（配合多巴和尿素培养基鉴定，GCB培养基区分新生和格特变种）。标准株及部分国外菌株由J. Heitman教授提供，其余菌株由比利时热带病研究所和意大利米兰大学卫生与预防医学研究所提供。
2. 主要试剂和仪器：rTaq酶、PCR试剂、EX－Taq、PMD18- T载体及限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR指纹分型所用Taq酶购自天根生物化学有限公司。培养基原料购自Sigma公司和国药集团化学股份有限公司。感受态细胞（大肠杆菌Top10）由复旦大学遗传所任大明教授实验室保存。测序仪为英骏生物技术有限公司提供的ABI-3730。
3. 新生隐球菌基因组的提取：实验菌株于YPD斜面培养基37℃培养2天后，取一环菌接于无菌蒸馏水，离心取沉淀，后续步骤参照W.Meyer等的高分子量DNA提取方法[6]。
4. PCR指纹分型：以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列（5’ GAGGGTGGCGGTTCT ’3）为单引物扩增新生隐球菌基因组中高变异的重复序列[6]，结合Cross Checker 2.91软件，分析比较受试菌株与8种主要基因型标准株扩增条带的异同(根据条带的有无，不考虑亮度上的差异)，进行分型归类。
5. 结构基因g6341的筛选和序列分析：在Genbank中检索已知主要基因型菌株的g6341、LAC1、TEF1、MPD1、CAP10、PLB1等结构基因和rDNA-IGS1、rDNA-ITS（包括ITS1、5.8S、ITS2）、18SrDNA、25SrDNAD1/D2区部分序列信息，采用ClustalW 1.83软件进行序列分析。
6. g6341基因部分序列的扩增和RFLP分析：从Genbank上获取VNI、VNIV、VGI和VGII基因型菌株g6341基因序列信息（登录号AF542529、 AF542531、AY710430、DQ096809），设计引物扩增和克隆基因型为VNII（WM626）、VGIII （WM161）、VGIV（WM779）菌株g6341基因片段（2.2kb），经测序和序列分析证实。于序列保守区设计8种主要基因型的通用引物g1F（5’ TCATTCTCGCCAGCCAT C ’3）、g1R（5’ GCAAGCGTATCGAACCAAT’3）、g2F (5’ CATTCTCGCCAGCCATCTCT ’3)、g2R(5’ CGCTCCACCATGCCTTTC ’3)。引物g1F－g1R的PCR反应条件为95℃ 5min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，32个循环；72℃ 8min。引物g2F－g2R的PCR 反应条件为95℃ 5min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 1.5min，32个循环；72℃8min。采用限制性内切酶Hinc II酶切g1F-g1R和g2F-g2R扩增产物，EcoT14 I 酶切g2F-g2R扩增产物。酶切产物电泳后，分析酶切谱型。
7. 测序、序列比对和系统发育分析: g1F-g1R扩增各主要基因型部分菌株（WM628、WM626、WM178、BT16、BLS48、BLS63、WM161、ATCC32608、WM779）所
得PCR产物经纯化回收，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，利用氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆送测序。另外，从Genbank中获取部分基因型菌株g6341基因序列，通过ClustalW 1.83软件进行序列分析。利用MEGA3.1软件进行系统发育分析，采用最小演化法构建系统发育树，bootstrap检验系统树各分支的置信限，重复值为500次，分析各基因型间的遗传距离和进化关系。
结果
1.PCR指纹分型：与8个标准株的扩增带型进行比较，确定另外68株新生隐球菌的基因型，结果显示，所有菌株都可归类到这8种基因型中（图1）。基因型的构成如下：VNI(n=32)、VNII(n=1)、VNIII(n=4)、VNIV(n=4)、VGI(n=15)、VGII(n=3)、VGIII(n=6)、VGIV(n=3)，其中，国内临床株包括了VNI(n=27)、VNIII(n=1)、VGI(n=7) 3种基因型。
图1 PCR指纹分型的部分电泳结果泳道1~6：阴性对照、菌株BLS90、BLS82、BLS71、YD53、MAS92-0006；M：Marker；7~16：D2K、XH41、BLS1、BLS37、XH11、XH34、WM148、WM626、WM628、WM629
2.g6341基因的选择：VNI－VGIV基因型参考株在IGS1、LAC1、MPD1、g6341、PLB1、CAP10、TEF1、ITS、25S D1/D2和18S位点的序列同源性依次为：71％～98％、76％～98％、83％～98％、84％～97％、87％～98％、86％～99％、88％～99％、98％～99％、99％～100％、99％～100％。结果显示，各主要基因型菌株在以上位点的序列同源性程度存在明显差异。考虑到PCR-RFLP分析对通用引物设计、序列间差异程度和稳定性的要求，选择g6341基因进行后续研究。
3.g6341基因的PCR-RFLP分析结果：引物g1F－g1R扩增76株新生隐球菌g6341基因后，均获得1kb片段，PCR产物经Hinc II酶切后电泳显示，76株新生隐球菌可归纳为5种谱型：H1－H5（图2）。引物g2F－g2R扩增新生隐球菌g6341基因获得1.8kb片段，经Hinc II酶切后显示7种谱型：C1－C7（图3），其中31株新生隐球菌格特变种分为4种谱型；经EcoT14 I酶切后，将格鲁比变种分为E1和E2 2种谱型(图4)。
图2 g1F-g1R扩增产物经Hinc II酶切结果M：Marker；泳道1~8：菌株WM148、WM626、WM628、WM629、WM179、WM178、WM161、WM779；9：Marker；10~15：BLS65、YD48、XH10、BLS63、BLS48、ATCC32608；H1-H5：RFLP 谱型
图3 g2F-g2R扩增产物经Hinc II酶切结果M：Marker；泳道1~8：菌株WM148、WM626、WM628、WM629、WM179、WM178、WM161、WM779；C1-C7：RFLP谱型
图4 g2F-g2R扩增产物经EcoT14 I酶切结果M：Marker；泳道1~4：菌株WM148、BLS90、WM626、1033；E1、E2：RFLP谱型
4.PCR－RFLP与PCR指纹法分型的对照结果：经比对，76株新生隐球菌的PCR-RFLP结果与PCR指纹分型结果一致，具体如下，H1＝C1＝VNI、VNII，H2＝C2＝VNIII，H3＝C3＝VNIV，H4＝VGI、VGII，H5＝VGIII、VGIV，C4＝VGI，C5＝VGII，C6＝VGIII，C7＝VGIV，E1＝VNI，E2＝VNII（表1）。
表1 部分菌株PCR－RFLP与PCR指纹分型法的对照结果
PCR-RFLP谱型
菌株 PCR指纹分型
1kb片段 1.8kb片段
来源
WM148 BLS90 WM626 1033
WM628 BLS37
XH10
WM629 BLS1 ATCC34874 WM179 BLS63
XH5
WM178 ATCC32609 ICB179 WM161 ATCC32608 BLS65 WM779 YD48
BT16 VNI
VNI
VNII
VNII
VNIII
VNIII
VNIII
VNIV
VNIV
VNIV
VGI
VGI
VGI
VGII
VGII
VGII
VGIII
VGIII
VGIII
VGIV
VGIV
VGIV
H1
H1
H1
H1
H2
H2
H2
H3
H3
H3
H4
H4
H4
H4
H4
H4
H5
H5
H5
H5
H5
H5
C1(E1)
C1(E1)
C1(E2)
C1(E2)
C2
C2
C2
C3
C3
C3
C4
C4
C4
C5
C5
C5
C6
C6
C6
C7
C7
C7
澳大利亚
比利时
澳大利亚
美国
澳大利亚
比利时
中国
澳大利亚
比利时
美国
澳大利亚
比利时
中国
澳大利亚
美国
巴西
美国
美国
比利时
南非
意大利
波扎那
5.g6341基因的序列比对和系统发育分析：部分菌株g6341片段测序后，经比对显示：8种主要基因型菌株间的同源性在84％～97％之间，同一主要基因型菌株间的同源性在99％～100％之间。同为VGIII基因型的血清C型菌株ATCC32608和血清B型菌株WM161的同源性为99％。系统发育分析显示：格特变种各基因型间的遗传距离较为接近，格鲁比变种VNI和VNII基因型遗传距离接近；变种间的遗传距离较远，其中格鲁比与新生变种相对接近，与原本将新生隐球菌分为两个变种的结论相符；另外，AD型菌株WM628包含2个等位基因，1个与VNI基因型高度同源，另1个与VNIV基因型高度同源。
讨论
以噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物进行的PCR反应，可扩增全基因组中高度可变的重复序列[8]，是对新生隐球菌遗传特征的总体反映，而对编码基因及rDNA的序列研究则从另一个角度反映了菌株间的遗传进化关系。rDNA-ITS较18SrDNA和25SrDNA具有更快的进化速度，常用于真菌的菌种鉴定，而rDNA-IGS，尤其是IGS1区具有较多的插入缺失片段，使得该区具有较高的序列多态性[3]。作者通过比较Genbank中新生隐球菌ITS、IGS1、18S、25S D1/D2区和10个结构基因的相应序列（部分数据未显示），总结如下：1、18S和25S D1/D2区保守性最高，不能完全区分主要基因型，甚至变种，故不适用于种内分型。2、ITS区在不同主要基因型间序列差异小，且无法区分VNI和VNII基因型，限制了其在新生隐球菌种内分型研究中的进一步应用。3、IGS1区进化速度快，种内变异和多态性程度高，但不适合主要基因型的RFLP分析。
4、结构基因的序列变异程度介于IGS1和ITS之间，其中部分基因适用于主要基因型的RFLP鉴定。
针对g6341基因的PCR-RFLP分析中，根据H1-H5谱型可鉴别新生隐球菌3个变种和AD杂合体；根据C1-C7谱型可鉴定7种主要基因型，如须区分VNI和VNII基因型，可用EcoT14 I酶切。PCR-RFLP显示，5株血清AD型菌株皆有来自A型和D型的酶切谱带，测序结果证实AD型菌株WM628在g6341位点具有与A型和D型高度同源的2个等位基因，结果支持血清AD型菌株是A型和D型的杂合体[9]。与Meyer观点一致的是[2]，作者通过测序发现VGIII基因型的血清B、C型菌株g6341基因序列间具有高度的同源性（99％），同时在Genbank上比对了URA5、PLB1和FTR1基因部分序列，也发现类似情况，表明两者在遗传上十分相似。系统发育分析显示，8种主要基因型的遗传差异与变种的分类一致，更进一步阐明了各基因型间的遗传距离与进化关系。有研究表明，导致温哥华岛爆发流行新生隐球菌病的致病株绝大部分为VGII基因型，且具有极强的交配能力[7]，说明部分VGII基因型菌株与伴有较强的交配能力、重组的发生及毒力变异有关。上述资料表明，基因分型是比血清分型更能真实反映新生隐球菌遗传特征、种群构成、进化关系和致病特点的研究工具。
传染病学重点知识点 一. 感染过程的表现： 1.清除病原体：非特异性免疫和特异性免疫 2.隐性感染（covert infection）：又称亚临床感染。是指病原体侵入人体后，仅诱导机体产生特异性免疫应答，而不引起或只引起轻微的组织损伤，因而在临床上不显出任何症状、体征，甚至生化改变，只能通过免疫学检查才能发现。大多数病原体感染都以隐性感染为主。结局：大多数获特异性免疫，病原体被清除；少数人转变为无症状携带者，病原体持续存在于体内。 3.显性感染（overt infection）：又称临床感染。是指病原体侵入人体后，不但诱导机体发生免疫应答，而且通过病原体本身的作用或机体的变态反应，而导致组织损伤，引起病理改变和临床表现。结局：病原体被清除，感染者获较为稳固的免疫力；免疫力不牢固，再受感染而发病；小部分成为慢性病原携带者。 4.病原携带状态（carrier state）：无明显临床症状而携带病原体。 按病原体种类分：带病毒者，带菌者，带虫者 按发生和持续时间长短分：潜伏期携带者，恢复期携带者，慢性携带者 按携带持续时间分：急性携带者（<3months），慢性携带者(>3months) 5.潜伏性感染（latent infection）病原体感染人体后寄生于某些部位，由于机体免疫功能足以将病原体局限化而不引起显性感染，但又不足以将病原体清除时，病原体便可以长期潜伏起来，待机体免疫功能下降时，则可引起显性感染。在此期间，病原体一般不排出体外（系非感染源，不同于病原携带状态）。注意：1）隐性感染最常见，病原携带状态次之，显性感染所占比重最低 2）上述五种表现形式在一定条件下可相互转变。 二. 流行过程的基本条件： 1.传染源(source of infection)：是指病原体已在体内生长、繁殖并能将其排出体外的人和动物。 （1）患者（2）隐性感染者（3）病原携带者（4）受感染的动物 2.传播途径(route of transmission)：病原体离开传染源到达另一个易感者的途径。 （1）呼吸道传播（2) 消化道传播（3）接触传播（4）虫媒传播（5）血液、体液传播 3.人群易感性：对某种传染病缺乏特异性免疫力的人称为易感者(susceptible person)，他们对病原体都具有易感性(susceptibility)。当易感者在某一特定人群中的比例达到一定水平，若又有传染源和合适的传播途径时，则很容易发生该传染病流行。 传染病的周期性(periodicity)：某些病后免疫力很巩固的传染病，经过一次流行之后，需待几年当易感者比例再次上升到一定水平时，才会发生另一次流行的现象。 三．传染病的治疗 (一).治疗原则：坚持综合治疗的原则即治疗、护理、隔离与消毒并重，一般治疗、对症治疗与病原治疗并重的原则 (二). 治疗方法：1.一般治疗及支持治疗2.病原治疗3.对症治疗4.康复治疗5.中医中药治疗 四. 我国法定传染病包括几类几种？按甲类传染病预防，管理的包括哪几种？ 法定传染病分为3类38种（甲类2种、乙类25种、丙类11种）。 甲类 (1.鼠疫、2.霍乱)强制管理的传染病，城镇要求发现后2h内，农村不超过6h上报。 乙类 (3.传染性非典型肺炎、4.艾滋病、5.病毒性肝炎、6.脊髓灰质炎、7.人感染高致病性禽流感、8.麻疹、9.流行性出血热、10.狂犬病、11.流行性乙型脑炎、12.登革热、13.炭疽、14.细菌性和阿米巴性痢疾、15.肺结核、16.伤寒和副伤寒、17.流行性脑脊髓膜炎、18.百日咳、19.白喉、20.新生儿破伤风、21.猩红热、22.布鲁氏菌病、23.淋病、24.梅毒、25.钩端螺旋体病、26.血吸虫病、27.疟疾 ) 为严格管理的传染病，城镇要求发现后6h内，农村不超过12h上报，其中，对乙类传染病中传染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感，采取甲类传染病的预防、控制措施。 丙类(28.流行性感冒、29.流行性腮腺炎、30.风疹、31.急性出血性结膜炎、32.麻风病、33.流行性和地方性斑疹伤寒、34.黑热病、35.包虫病、36.丝虫病，37.除霍乱、细菌性和阿米巴性痢疾、伤寒和副伤寒以外的感染性腹泻病 38.手足口病）为监测管理传染病。
流行病学 1.发病指标：①发病率（incidence rate）指一定时期内，特定人群中某病新病例出现的频 率，常用来描述疾病的分布，探讨发病因素，提出病因假设和评价防制措施效果；②罹患率（attack rate）与发病率同样是测量新发病例的频率指标，一般用于衡量小范围、短时间的发病频率，观察时间以月、周、日或一个流行期为时间单位，多用于描述食物中毒、职业中毒及传染病的暴发流行；③患病率（prevalence rate）亦称现患率或流行率，指在特定时间内，一定人群中某病新旧病例数所占的比例。患病率=发病率*病程； ④感染率（infection rate）指在受检查的人群中某病现有感染人数所占比率，通常用百 分率表示；⑤续发率（secondary attack rate，SAR）也称二代发病率，指在一定观察期内某种传染病在家庭易感接触者中二代病例的百分率。自原发病例出现后，在该病最短至最长潜伏期之间发生的病例称为续发病例，即二代病例。继发率=易感接触者中的续发病例数/易感接触者总数*100%。计算续发率要掌握的资料有：原发病的发病时间、接触者中易感者人数、观察期内的二代病例数。 2.患病率与发病率区别：①患病率的分子为特定时间内所调查人群中某病新旧病例的总和， 而发病率分子为异性时期内暴露人群中某病的新发病例数；②患病率是横断面调查获得的疾病频率是衡量疾病的存在或流行情况的静态指标，而发病率是由发病报告或队列研究获得的疾病频率，是衡量疾病发生情况的动态指标。 3.死亡指标：①死亡率（mortality rate）是指某人群在一定时期内死于所有原因的人数 在该人群中所占的比例。是测量人群死亡危险最常用的指标，其分子为死亡人数，分母为该人群年平均人口数。死于所有原因的死亡率是一种未经过调整的死亡率，所以通常被称为粗死亡率（crude death rate），是衡量人群因病伤死亡危险大小的指标，是一个国家或地区文化、卫生水平的综合反映。按疾病的种类、年龄、性别、职业、种族等分类计算的死亡率称为死亡专率（specific death rate），常用于探讨疾病的病因和评价防制措施。②病死率（fatality rate）表示一定期间内，患某病的全部病人中因该病而死亡的比例。通常用于病程较短的急性病。③生存率（survival rate）指患某种疾病的人（或接受某种治疗措施的病人）经n年的随访，到随访结束时仍存活的病例数占观察病例总数的比例。④潜在减寿年数（potential years of life lost，PYLL）是指某病某年龄组人群死亡者的期望寿命与实际死亡年龄之差的总和，即死亡造成的寿命损失。PYLL是测量人群疾病负担常用的指标，也是评价人群健康水平的一个重要指标。用途：（1）可以反映各种死因对人群寿命的危害程度；（2）有助于确定该地区（县）的重点疾病并为制定合适该地区（县）的防制措施提供科学依据；（3）可用于评价疾病防制措施效果；（4）对不同疾病连续多年计算潜在减寿年数，可以了解疾病发展趋势。⑤伤残调整寿命年（disability adjusted life year，DALY）是指从发病到死亡所损失的全部健康寿命年，包括因早死所致的寿命损失年（years of life lost，YLL）和疾病所致伤残引起的健康寿命损失年（years lived with disability，YLD）。用途：（1）有助于宏观上认识疾病和控制疾病；（2）有助于确定危害人群健康的主要疾病，以及相应疾病的高危人群和高发地区，为正确制定防治对策与措施提供重要信息和依据；（3）用于进行成本效益分析。 4.疾病流行强度：指某病在一定时期内，某地区某人群中发病率的变化及其病例期间的联 系程度。描述常用术语有：①散发（sporadic）是指某病在某地区人群中呈历年的一般发病率水平，病例在人群散在发生或零星出现，病例之间无明显联系。②流行（epidemic）指某地区、某病在某时间的发病率显著超过历年该病的散发发病率水平。③暴发（outbreak）在一个局部地区或集体单位的人群中，短时间内突然发生许多临床症状相似的病人。④大流行：即疾病蔓延迅速，涉及地域广，往往在比较短的期间内越过省界、
1例新型隐球菌引起的脑膜炎 杨继承，预防医学与医学检验系06级检本一班 关键词：新型隐球菌，免疫低下，隐球菌性脑膜炎。 伴随国际国内医药技术的飞速发展，临床上相关药物的滥用现象也日益增多。广谱抗菌药、激素、免疫抑制剂及抗肿瘤药物的应用，一方面，保护人类免受多种微生物、自身免疫性疾病、恶性肿瘤的侵袭，另一方面，也对机体自身免疫系统有害。隐球菌归入半知菌亚门，半知菌纲，隐球菌目，隐球菌属，有A、B、C、D 4个血清型[1]。作为一种常见的条件致病菌，往往能造成免疫能力低下患者机体深部感染，如中枢神经系统亚急性、慢性感染等。我院检验科于2010年1月15日培养鉴定出1例新型隐球菌，现将培养鉴定结果报告如下： 1月11日接收脑脊液标本一份。患者入院时血常规显示：白细胞14.10×１０９/L，其中单核０.９×１０９/L，中性粒11.8×１０９/L，占83.8%，淋巴1.2×１０９/L，占8.77%，但免疫功能检查显示：补体Ｃ3 0.09g/L,IgA 0.65g/L ,IgG 4.68g/L。将标本接种于血琼脂平板、 小BB培养基后，取标本离心涂片，墨汁负染，镜检结果发现有带有宽厚荚膜的较圆的菌体存在，初步判断为新型隐球菌（如图1）。 图1 1月13日血平板上长出较小，白色，较干燥的菌落，涂片后镜检为菌体较圆的革兰阳性孢子（图2）；小BB微浑，涂片墨汁染色镜检发现亦为有宽厚荚膜且较圆的菌体（图3）。 图2 图3 1月13日下午，上生化鉴定（ID32C）及药敏（ATB TM FUNGUS3）板。14日，生化
鉴定结果如下：能同化肌醇、葡萄糖、半乳糖、蔗糖，脲酶试验阳性；糖类发酵试验及乳糖同化试验结果为阴性。药物敏感性实验结果为5-FC 敏感（S），两性霉素B 耐药（R），氟康唑中介（I）。 综合上述检查及培养鉴定结果，确认病原菌为新型隐球菌。 讨论： 新型隐球菌多造成免疫力低下患者机体的深部感染，如中枢神经系统的感染，往往会造成亚急性、慢性隐球菌性脑膜炎。新生隐球菌为条件致病菌，近20年，隐球菌造成的感染越来越普遍。在国外，已成为AIDS的常见并发症之一，是AIDS患者死亡的首要原因；国内已将隐球菌病和病毒性肝炎等疾病同列入乙类传染性疾病[2]。其主要致病物质为荚膜。新型隐球菌的检测主要分以下几类：①对脑脊液标本的直接检测，将标本直接离心，取沉渣涂片，墨汁负染法；检测荚膜特异性多糖抗原的ELISA、胶乳凝集实验及利用抗原抗体反应原理的单克隆抗体法；有条件地区还可利用PCR技术对真菌DNA进行检测，其特异性及敏感性更高。②实验室培养鉴定法，经接种真菌（或其他）培养基后，根据长出的菌落特征及染色特性，选择响应生化、药敏鉴定板，并综合上述结果对标本中的病原菌做出准确判断，药敏结果还能指导临床正确用药。脑脊液墨汁染色是诊断隐脑最直接、经济而快速的诊断方法[2]。但乳胶凝集试验检测荚膜多糖抗原在早期快速诊断中明显优于涂片墨汁染色[2]，且乳胶凝集试验兼有诊断和估计预后的价值[3]，但应与肿瘤、SLE、结节病等鉴别,因为血清RF阳性时可造成假阳性结果。 实验室诊断过程中，标本的处理方法直接影响着检出率的高低。对脑脊液标本直接检测时，若使用墨汁染色，必须先对标本进行离心处理（2000r/min,15min），以提高检出率，PCR实验则须防止标本污染而出现假阳性。培养鉴定时，由于新型隐球菌生长较为缓慢，BA 可于48h后见到明显的真菌菌落（中大，白，圆，稍干）；小BB中可能无法见到明显浑浊，但仔细观察，还是可以看到有轻微浑浊的现象，镜检前最好也先离心处理。 疾病的治疗方面，可参考药敏试验的结果合理选择药物。如5-FC、氟康唑、两性霉素B等。但由于血脑屏障的存在，可能出现药物在血液中已达到一定浓度，但在脑脊液中却未达到最小抑菌浓度（MIC）的现象。往往是一部分患者久治不愈的原因所在。 其实很多疾病都是可以预防的。新型隐球菌主要存在于土壤及鸽粪中,主要通过呼吸道侵入人体,也可经皮肤、黏膜或肠道侵入,鸽子是最重要的传染源。免疫功能低下常为新型隐球菌病的重要诱因,如艾滋病、淋巴瘤、白血病、肾衰竭及其他慢性消耗性疾病,而长期使用抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制药或细胞毒性药物者亦较易发生本病。所以避免接触鸟类粪便、积极锻炼身体是很有必要的，临床上广谱抗生素、激素、免疫抑制剂及抗肿瘤的药物必须正确及合理应用。同时日常生活中也应积极预防“病从口入”，饭前便后洗手、不生吃瓜果蔬菜等看似不起眼的好习惯却是我们远离多种病痛最直接有效的办法。 参考文献： [1] 倪语星，尚红.临床微生物学与检验（第4版）[M].北京：人民卫生出版社，2007（4）：374 - 376。 [2] 崇雨田. 隐脑的诊治体会[J].新医学, 2003,34 (6) : 343 – 345。 [3] 李京红，张国俊新. 型隐球菌脑膜炎脑脊液的检测方法探讨[J].中国实用神经疾病，2009，12（5）:85-86。
（绪论） 1、流行病学的定义：是研究人群中疾病与健康状况的分布及其影响因素，并研究如何防治疾病及促进健康的策略和措施的科学。 2、流行病学按研究设计类型分类，可分为：描述性研究；分析性研究；试验性研究；理论性研究。 3、流行病学认识疾病的途径是：从群体水平认识疾病。 （病因与疾病的分布） 1、病因：与疾病发生和流行有关因素的总和。一般认为，那些能使人群的发病概率升高的一切因素都是病因。 2、疾病发生的三要素（病因三要素）：致病因子、宿主、环境。 3、共变法的理论基础是：因果效应的剂量反应关系。例如：甲肝的发病率与生食毛蚶的量有相同的变化趋势。 4、流行病学探索病因的一般程序是：从统计学关联（相关）到因果关联。（相关不等于因果，因果也不一定相关）。 5、衡量疾病危险度的指标是：发病率。 发病率＝某时期内某人群中某病新发病例/ 同期暴露人口× K 一般为1年内某人群中发生某病新病例的频率. 6、较短时间内疾病流行强度的指标是：罹患率。 罹患率＝观察期内某人群中某病新发病例数/ 同期暴露人口× K 7、适用于病程较长的慢性病的流行病学研究的指标是：患病率（又称现患率）。患病率＝某时间内某人群中某病现（新＋旧）患病例数/ 同期平均人口× K 8、续发率又称“二代发病率”。 续发率＝接触者中二代病例数/ 接触原发病例的易感者人数× K 9、满足患病率＝发病率×病程的条件是：在相当长的时间内，发病率和病程都相当稳定。 10、疾病的三间分布包括：人群、地区、时间分布。 人群分布（年龄、性别、职业、种族、家庭）、地区分布（国家间、国内、城乡、局部地区）、时间分布（流行、爆发、季节性、周期性、长期变异） 11、横断面分析（属描述性研究）是指：对同一时期不同年龄者的发病率或死亡率的分析。 12、易感人口增加，导致麻疹流行：宿主因素发生变化，宿主比重增加。 13、流感病毒发生变异引起流感流行：环境因素不变，病因比重增加。 14、夏季气温高、雨量多、蚊媒密度增加，引起乙脑流行：环境因素发生变化，导致病因比重加重。 15、战争年代因饥荒、贫穷、流离失所、生活条件恶劣，引起传染病流行：环境因素发生变化，导致宿主比重加重。 16、自然疫源性疾病：一些疾病的病原体不依靠人，而是依靠自然界的野生动物绵延繁殖，人只在偶然的情况下才感染该疾病。如：钩端螺旋体病、流行性出血热、森林脑炎、狂犬病、鼠疫、莱姆病等。 （描述流行病学研究方法） 1、对病因不明疾病，描述性研究的主要任务是：寻找病因线索。主要用途是：提出病因假说。 2、进行爆发调查时的首要工作是：核实诊断。 3、某病的流行曲线只有一个高峰，所有病例都集中在该病的常见潜伏期内，据
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流行病学（Epiolemiology）是研究疾病和健康状态在人群中的分布及其影响因素，以及制定和评价预防、控制和消灭疾病及促进健康的策略和措施的科学。 简述流行病学的研究范围及其任务与用途 研究范围：研究疾病和健康状态在人群中的分布及其影响因素 任务分为三个阶段：揭示现象、找出原因和提供措施。 用途：研究人群健康、疾病消长以及疾病特征变化的规律。对社区和人群健康做出诊断。用于卫生决策和评价。疾病预防。疾病诊断、治疗与预防方法或措施的效果评价 流行病学研究的重要观点：群体特征、社会医学的特征、以分布为起点的特征、对比的特征、多病因论、概率论和数理统计学的特征。流行病学认识疾病的途径是：从群体水平认识疾病。。 流行病学研究方法：描述性研究（病案报告、横断面调查、生态学研究）、分析性研究（队列研究、病例对照研究）、试验性研究（现场试验、临床试验、社区试验）、理论性研究。 生态学研究：比较不同人群中某疾病或健康状态，他们的发病率或死亡率的差别，以了解某疾病或健康状态在不同人群中分布有无异同点，从而探索该现象产生的原因，找出值得进一步深入分析的线索。 预调查：为评价开展大规模研究设计的可行性，预先在一小范围内用所设计的方法和步骤进行试验的一种调查研究。 率、比、构成比的区别和联系是什么？ 率（rate）比(ratio) 构成比(proportion) 测量一个时间范围内某事件发生的频率或强度比较两个独立事件大小 的指标（A/B） 说明某特定事件在总事件数中 所占的比重（A/A+B） 有时间单位无时间单位无时间单位 需要进行一段时间的观察，不能从单次观察中获得横断面观察结果，一次观 察既可获得 横断面观察结果，一次观察既可 获得 不同地区或人群的构成比能相互比较吗？ 构成比不能说明某件事件的频率，不同地区、不同条件下的构成比不能当率使用，构成比不能相互比较。 给出数据，计算发病率，罹患率，患病率，死亡率，病死率 1）发病率是指一定时期内（年、季、月），特定人群中发生某病新病例的频率或强度。发病率=一定期间内某人群中某病新病例数/同时期暴露人口数*K。 2）罹患率与发病率同样是测量新发病例的频率指标。罹患率=观察期间某病新病例数/同期暴露人口数*K。罹患率用于衡量小范围、短时间新发病例的频率。其优点是可以根据暴露程度精确地测量发病几率。 3）患病率也称现患率、流行率，指在特定时间内一定人群中某病新旧病例所占的比例。患病率=特定时期某人群中某病新旧病例数/同期暴露观察人口数*K。 4）死亡率：指某人群在一定期间内死于所有原因的人数在该人群中所占的比例。是测量人 群死亡危险最常用的指标。死亡率=某人群某年总死亡人数/该人群同年平均人口数*K 5）病死率：表示一定时期内患某病的全部病人中因该病而死亡的比例。病死率与死亡率不同，病死率并非真正的率，只是一个比值。病死率=一定时间内因某病死亡人数/同期确诊 的某病病例数*100%。 累积发病率(cumulative incidence, CI)：指某一固定人群在一时期内某病新发生例数 与观察开始时总人数之比。观察时间越长，则病例发生越多，所以CI表示发病率的累积影响。适用于样本量大，人口稳定，比较整齐的资料。N年某病累积发病率=n年内的新发病例数/观察开始时的人口数*k。 发病密度的概念和什么情况下使用。 发病密度(incidence density，ID)：当观察的人口不稳定时，观察对象进入研究的时间先后不一，以及各种原因造成失访，每个观察对象随访的时间不同，用总人数为单位计算率是不合理的。此时用人时为单位计算发病率，称为发病密度。人时，是以观察人数乘以观察时间，时间单位可以用年、月、日等，最常用的是年。发病密度=某人群观察期内的发病例数/观察期内的观察对象人时数*K. 某病的患病率增高：病程延长、寿命延长、新病例增加、病例迁入、健康者迁出、易感者迁入、诊断 水平提高、报告率提高。患病率减低：病程缩短、病死率增高、新病例减少、健康者迁入、病例迁出、治愈率提高。 患病率的意义和用途是什么？ 患病率对于病程短的疾病价值不大，而对于病程长的一些慢性病的流行状况能提供有价值的信息，可反映某地区人群对某疾病的疾病负担程度。可依据患病率来合理的的规划卫生设施、人力物力及卫生资源，研究疾病流行因素及监测慢性病的控制效果等。 发病率与患病率的主要区别及联系 ，特定人群中发生某病新病例的频率或强度。发 病率=一定期间内某人群中某病新病例数/同时期暴露人口数*K。患病率也称现患率、流行率，指在特定时间内一定人群中某病新旧病例所占的比例。患病率=特定时期某人群中某病新旧病例数/同期暴露观察人口数*K。 2）发病率与患病率的主要区别：患病率的分子为特定时间所调查人群中某病新旧病例数， 而不管这些病例的发病时间；发病率的分子为一定时期暴露人群中新发生的病例数。患病率是由横断面调查获得的疾病频率，衡量疾病的存在或流行情况，是一种静态指标；发病率是由发病报告或队列研究获得的疾病频率，衡量疾病的出现，为动态指标。患病率反映人群对疾病的负担程度，一次调查既可获得，不能反映出影响疾病因素的波动，多用于慢性病。发病率需要至少两次调查才能获得，描述影响疾病因素的波动 3）发病率与患病率的联系：当某地某病的发病率和病程在相当长的期间内保持稳定时，则患病率、发病率和病程三者之间存在下述关系：患病率=发病率*病程。 感染率、续发率。
概述： 传染病(Communicable diseases )是指由病原微生物和寄生虫感染人体后产生的有传染性、在一定条件下可以造成流行的疾病。 感染性疾病(infectious diseases )是指由病原体感染所致的疾病，包 括传染病和非传染性感染性疾病。 传染病学是一门研究各种传染病在人体中发生、发展、传播、诊断、治疗 和预防规律的学科。 感染与免疫 一.感染(infection )是病原体与人体之间相互作用的过程。 机会性感染(opportunistic infection )当某些因素导致宿主的免疫功 能受损或机械损伤使寄生物离开固有的寄生位置而到达不习惯的寄生部位，平衡不复存在而引起宿主的损害则产生机会性感染。 首发感染(primary infection )人体初次被某种病原体感染。 重复感染(reinfection )人体在被某种病原体感染的基础上再次被同一种病原体感染。 混合感染(coinfection )人体同时被两种或两种以上的病原体感染。 重叠感染(superinfection )人体于某种病原体感染的基础上再被别的病原体感染。 继发性感染(sec on daryi nfection )在重叠感染中，发生于原发感染后的 其他病原体感染。 二.感染过程的表现： 1. 病原体被清除：非特异性免疫和特异性免疫 2. 隐性感染(covert infection ):又称亚临床感染。是指病原体侵入人体后，仅诱导机体产生特异性免疫应答，而不引起或只引起轻微的组织损伤， 因而在临床上不显出任何症状、体征，甚至生化改变，只能通过免疫学检查才能发现。大多数病原体感染都以隐性感染为主。结局：大多数获特异性免疫，病原体被清除；少数人转变为无症状携带者，病原体持续存在于体内。 3. 显性感染(overt infection ):又称临床感染。是指病原体侵入人体后，不但诱导机体
我国新生隐球菌的基因分型和分子流行病学分析 中文摘要 本研究通过分子生物学技术，如PCR指纹法、PCR特异扩增、PCR-RFLP、MLST、系统发育研究来分析我国新生隐球菌临床分离株的分子特征，旨在阐明我国新生隐球菌基因型和交配型在临床中的分布及其分子流行病学特征。主要工作包括以下三个部分： 一、PCR-RFLP和PCR指纹法在新生隐球菌基因分型中的应用与比较 目的探讨针对结构基因g6341的PCR－RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值, 并与PCR指纹分型法进行比较。方法以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR－RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％～97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％～100％之间。分子发育树中，VNI
－VNIV基因型、VGI－VGIV基因型分别聚在一类。结论针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。 二、国内110株新生隐球菌临床株变种、基因型和交配型分析 目的对国内部分地区的新生隐球菌临床株进行分子流行病学调查，分析其变种、基因型和交配型的构成和分布。方法1、PCR指纹分型法：以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物对模板进行PCR扩增，将所有受试菌株鉴定到8种主要基因型水平。2、利用变种和交配型特异性引物扩增分型法，区分格鲁比、新生和格特变种，同时鉴定α和a交配型。结果 110株临床株中，98株（89.1％）为格鲁比变种，均为VNI基因型和α交配型；9株（8.2％）格特变种，包括VGI基因型、α交配型8株（7.3％）和VGII 基因型、α交配型1株（0.9％）；2株（1.8％）为AD杂合体，VNIII 基因型，-/α和α/-交配型各1株；1株（0.9％）为新生变种，VNIV 基因型和a交配型。结论我国新生隐球菌临床株包含3个变种和AD 杂合体。与国外情况比较，相似的是国内临床株中绝大部分为α交配型菌株，且格鲁比变种中的VNI基因型占了其中的大部分；但未发现VN II、VG III和VGIV基因型菌株。 三、我国致病格特隐球菌的基因亚型分析 目的分析我国致病格特隐球菌的基因型和基因亚型，探讨其与世界范围内格特隐球菌的亲缘关系和分子流行病学联系。方法扩增国内9株格特隐球菌临床株的3个非连锁位点即IGS1（基因内间隔
《流行病学》期末考试总复习 第一章绪论 1、流行病学：研究疾病与健康状态在人群中得分布及影响因素，借以制订与评价预防、控制与消灭疾病及促进健康得策略与措施得科学。 2、流行病定义得内涵： ①、研究对象：人群 ②、研究内容：疾病（包括伤害）与健康状态 ③、重点：研究疾病与健康状态得分布及其影响因素 ④、目得：为控制与消灭疾病及促进健康提供科学得决策依据。 3、根据就是否由研究者控制研究得条件，或者说就是否有人为得干预，流行病学研究方法可以分为两大类，即：观察性研究或观察流行病学与实验性研究或实验流行病学。 4、流行病学研究得重要观点：
①群体得观点；②比较得观点；③概率论得观点；④社会医学得观点；⑤多病因论得观点。 第二章 疾病得分布 率与比得概念：率表示发生得频率或强度，可以取任何值，反应动态过程得一个参数。 比就是一个值。 构成比就是指事物各部分所占比重，一般使用圆饼图，取值在0~1之间。 如果把构成比当做率使用，将会得出错误得结论。 k ?= 数 可能发生该现象的总例某现象实际发生的例数 率 %100?= 量（个体数之和） 同一事物内部的整体数数量（个体数） 某事物内部某一部分的构成比 发病指标 发病率：在一定期间内、特定人群中某病新病例出现得频率。 k ?= 同期暴露人口数 生某病的新病例数 一定时期内某人群中发发病率 罹患率：指在某一局限范围，短时间内得发病率。观察时间月、周、日或一个流行期为时间单位。 k ?= 同期暴露人口数 观察期间某病新病例数 罹患率 患病率：指在特定时间内，一定人群中某病新旧病例数所占得比例。 k ?= 同期观察人口数 病新旧病例数 特定时间内某人群中某患病率 影响患病率升高与降低得因素： ?? ?期间患病率 时点患病率按观察时间
临床流行病学复习重点汇总 临床流行病学复习重点考题汇总 名词解释 1. 临床流行病学 (clinical epidemiology)应用现代流行病学和生物统计学的原理和方法， : 从患病群体探讨疾病的病因、诊断、治疗、预后和临床决策的规律，通过严格的设计、定量的测量及客观的评价，为疾病防治提供科学依据。 2. 暴露因素:指接触过某种因素或具有某种特征或处于某种状态。这些因素、特征或状态称为暴露因素或研究变量。暴露因素可以是生物的、物理的、化学和机体的，是与疾病或某些医学现象发生有关的因素。 3. 真实性:也称效度或准确度，指测量值与实际值的符合程度，即测量值与真值的接近程度在试验的评价中，真实性是指待评价试验的测量结果与“金标准”测量结果的吻合程度。 4. 交互作用: 当两个或两个以上因子共同作用于某一事件时，其效应明显不等于该两个或两个以上因子单独作用时的和和/或积，称这些因子间存在交互作用。有时也称效应修饰。 5. RCT: 随机对照试验(randomized controlled trials)临床随机对照试验是在病人中进行的，通过比较治疗组与对照组的结果而确定某项治疗或预防措施的效果与价值的一种前瞻性研究。临床随机对照试验是选定患有某种疾病的病人，将他们随机分为两组，试验组和对照组，对实验组病人施加某种预防或治疗的干预措施后，随访并观察一段时间，比较两组病人的发病结局，从而判断干预措施的预防或治疗效果。 6. Bias:即偏倚，是指在研究推理过程的任何阶段，由于各种因素的影响，使得所获得的结果系统地偏离真实值。
7. 保护因素:影响人群发病率降低的内外环境因素称为保护因素。 8. 盲法: 为了避免试验的执行者与受试者甚至资料分析者一方或多方主观偏性的影响，使其不知道研究对象的分组情况，接受的是试验措施还是对照措施，这种试验方法称为盲法(blinding)。 9. 普查:是为了了解某病的患病率或健康状况，在特定时间内，对特定范围的人群中每一成员进行的调查或检查。特定时间应该很短，甚至是某一时点。一般为 1, 2 天、1, 2 周或 1, 2 个月，最长不宜超过 2, 3 个月。特定范围是指某一地区或具有某一特征的人群。 10. RR (relative risk) :即相对危险度，是表示暴露与疾病等生物学事件关联强度大小最重要的指标，又称作率比或危险比，是暴露组与非暴露组人群发病率或死亡率的比值，表明暴露组发病或死亡的危险性是对照组的若干倍。 11. 预后(prognosis) :是对疾病结局的概率预测，也就是指发病后疾病未来过程的一种预先估计。 12. Over matching:即匹配过头，把不必要的项目列入匹配，企图使病例与对照尽量一致，就可能徒然丢失信息，增加工作难度，结果反而降低了研究效率。 13. Double blind:即双盲，执行医疗措施的医护人员和受试者均不知道受试者的分组情况，接受的是试验措施还是对照措施。主要避免来自两方面的观察偏倚。 14. Nest case-control study: 巢式病例对照研究，又称套式病例对照研究，是病例对照研究与队列研究相结合的一种研究方法。研究开始时，首先选择一研究队列，收集暴露和疾病的有关资料，随访观察研究疾病的病例出现，并达到所设计的样本，将这些病例作为病例组，并在此队列用随机的方法选择非该病病人作为对照组，进行病例对照研究，探讨暴露与疾病的关系，这种病例对照研究称为巢式病例对照研究。
隐球菌病治疗指南 摘要 由8人组成的全国变态反应性和感染性疾病协会（NIAID）真菌病研究组评估了现有的有关隐球菌病治疗的资料。基于个人的经验及文献资料总结了隐球菌病最佳治疗的方法。每种推荐方法的相对推荐强度是根据相应的临床证据的类型和级别作出分级的，与美国感染疾病学会（IDSA）此前公布的指南相一致。专门小组通过2次电话会议和撰写原稿评论加以确定。 新生隐球菌病的治疗方法的选择依赖于侵犯部位及感染宿主的免疫状态。对于免疫正常宿主的局限性肺隐球菌病必须保证严密的观察。在有症状的病例，建议使用氟康唑，200～400mg/d，共3～6个月。对于那些血清隐球菌抗原滴度>1:8而无CNS侵犯的隐球菌血症，或泌尿道、皮肤感染的病例，推荐使用唑类（氟康唑）3～6个月。在所有病例中，均需严密观测以排除潜在的CNS感染可能。对于不能耐受氟康唑的病人，伊曲康唑（200～400mg/d，共6～12个月）是一种可接受的选择方案。对于严重的感染病例，需采用两性霉素B（0.5～1mg/kg/d）治疗6～10周。对于健康宿主的CNS感染病例，标准的治疗方案是采用两性毒素B（0.7～1mg/kg/d），与氟胞嘧啶（100mg/kg/d）联合使用2周，然后使用氟康唑（400mg/d）至少10周。根据病人的临床状况，氟康唑“巩固”治疗需持续6～12个月。对HIV阴性的免疫抑制病例，不管其感染部位，均需按CNS感染来治疗。 HIV感染的隐球菌病病例均需治疗。对于局限性肺部或泌尿道感染的HIV阳性病例，建议采用氟康唑，200～400mg/d。尽管与高活性抗病毒治疗（HAART）的冲突还不清楚，但推荐所有HIV感染的病例需终生维持抗真菌治疗。对于不能耐受氟康唑的病人，伊曲康唑（200～400mg/d）是一种可接受的选择方案。对于严重的感染病例，需联合使用氟康唑（400mg/d）和氟胞嘧啶（100～150 mg/kg/d）10周，然后采用氟康唑维持治疗。对于隐球菌性脑膜炎的HIV感染病例，需选用两性霉素B（0.7～1mg/kg/d）联合氟胞嘧啶（100mg/kg/d）诱导治疗2周，接着采用氟康唑（400mg/d）治疗至少10周。在这10周治疗完成后，根据病人的临床状况，氟康唑用量可减少到200mg/d，终生维持治疗。对于AIDS相关的隐球菌性脑膜炎的另一可选择的治疗方案是联合使用两性霉素B（0.7～1mg/kg/d）和5-氟胞嘧啶（100mg/kg/d）6～10周，然后采用氟康唑维持治疗。一般不采用唑类药物来进行
[键入文字] [键入文字] [键入文字]课程类别：必修[√]选修[ ] 使用班级： 考试方式：开卷[]闭卷[√]2006–2007学年第二学期 课程名称：姓名：流行病学参考答案 班级： 考试时间：2007 年 5 月30 日 学号： 一、单选题(每题1分，共30分) 1、疾病的三间分布是指：（C） A、时间分布、年龄分布和职业分布 B、人群分布、地区分布和季节分布 C、时间分布、人群分布、地区分布 D、短期波动、长期趋势和周期性 E、职业分布、年龄分布和性别分布 2．为了调查广州市初中生近视情况，将全市中学按照学校等级（省重点、市重点和普通学校）分成好、中、差三层，每层抽出若干学校。将抽到的学校按年级分成三层，每个年级抽取若干班，对抽到班级的全体学生进行调查和检查。这种抽样方法称为：（E） A、系统抽样 B、整群抽样 C、分层抽样 D、单纯随机抽样 E、多级抽样 3．队列研究最常见的偏倚是(C) A、混杂偏倚 B、信息偏倚 C、失访偏倚 D、选择偏倚 E、入院率偏倚4．反映疾病流行强度的指标有：(A) A、散发、流行和爆发 B、季节性、散发和周期性 C、长期趋势、短期波动和周期性 D、长期趋势、流行和爆发 E、散发、爆发和长期趋势 5．1940年4月，某地80人出席了在教堂举行的晚餐，第二天有46人出现了恶心、呕吐、腹泻和腹痛，体温正常，被诊断为胃肠炎。这个事件可以称为：(E) A、epidemic B、sporadic C、rapid fluctuation D、secular trend E、outbreak 5．传染病流行过程的三个环节是指：(C) A、病因、宿主、环境 B、传染源、宿主、环境 C、传染源、传播途径、易感人群 D、传染源、传播途径、传播机制 E、生物环境、物理环境、社会环境 7．某个（些）因素的存在掩盖或夸大了研究因素与疾病之间的真实联系，称为：(C) A、信息偏倚 B、失访偏倚 C、混杂偏倚
隐球菌病治疗实用指南 为了帮助医师在治疗隐球菌病时正确选用抗真菌药，制定合理的给药方案。美国国立变态反应和感染病研究院真菌病研究组(NIAID MSG)组织有关专家根据循证医学的原则制订了隐球菌病的处理指南。该指南提出的建议适用于绝大多数隐球菌病患者。虽然该指南系2000年制订，且所依据的临床证据均为国外资料，但由于该指南是在大量临床证据基础上制订对我们当前的临床实践仍具有重要的指导意义。现将其主要内容编译供临床参考。该指南的全文见Clinical InfectiousDisease 2000，30：710—718，并将于2008年更新。本指南推荐强度和证据力度分级系统同其他美国感染病学会(IDSA)指南(附件)。 在过去的20余年，随着各类抗真菌药物的不断问世，新型隐球菌病的治疗发生了很大变化。新型隐球菌病治疗方案的选择，主要取决于罹患部位和患者的免疫功能状况。 一、非HIV感染者隐球菌病的治疗指南 (一)肺部及非中枢神经系统隐球菌病治疗目的为治愈感染并预防感染播散至中枢神经系统。所有免疫缺陷者均应接受治疗，因易发生播散性感染。有症状的患者均需治疗。虽然所有培养阳性的无症状患者应接受治疗，但许多免疫功能正常的痰培养阳性患者即使不治疗亦预后良好。肺外及中枢神经系统以外的感染(如骨骼或皮肤)需要特殊的抗真菌治疗。持续性或难治性肺部或骨骼感染需要手术治疗。所有患者需作腰穿以除外中枢神经系统感染。肺部隐球菌病的治疗见表1。 早期适当治疗可降低病死率，防止中枢感染发生。对于实体器官移植患者，可以防止感染导致的移植失败。治疗主要的不良反应为药物相关的毒性反应，以及药物相互作用。 (二)中枢神经系统隐球菌病治疗目的为治愈感染并预防中枢神经系统后遗症，如脑神经瘫痪、听力丧失和失明。中枢神经系统隐球菌病的治疗见表1。治疗2周后需随访脑脊液(CSF)检查，如果培养阳性，需要延长诱导期疗程。氟康唑联合氟胞嘧啶作为初始治疗疗效不佳，即使是低危患者。免疫抑制患者，如实体器官移植患者，需要延长疗程。 有严重肾脏疾病的患者，诱导治疗时可用两性霉素B含脂制剂替代两性霉素B(C Ⅲ)，无法耐受氟康唑的患者，可选伊曲康唑(200 mg，每日2次)替代(CⅢ)。大部分病变抗真菌治疗有效，>3 cm的中枢神经系统病变需要手术。所有的患者都应密切监测颅内压。治疗决策不应常规或仅仅依据血清或CSF隐球菌抗原滴度
分子流行病学复习与思考题 1、生物标志:生物标志就是生物体内发生得与发病机制有关联得关键事件得指示物,就是机体由于接触各种环境因子所引起机体器官、细胞、亚细胞得生理、生化、免疫与遗传等任何可测定得改变。分为三类。1、暴露生物标志:⑴内剂量生物标志;⑵生物有效剂量生物标志。 2、效应生物标志:指机体内可测量得生化、生理或其她方面得改变。 3、易感性生物标志:就是指机体接触某种特定环境因子时得反应能力得一类生物标志。 2、生物芯片:生物芯片,又称蛋白芯片或基因芯片,它们起源于DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合得结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记得DNA或其她样品分子(例如蛋白,因子或小分子)进行杂交,通过检测每个探针分子得杂交信号强度进而获取样品分子得数量与序列信息。技术起源:核酸分子杂交。用途分类:生物电子芯片、生物分析芯片。 3、探针:基因探针(probe)又称“寡核苷酸探针”,简称“探针”,就就是一段与目得基因或DNA互补得特异核苷酸序列,它可以包括整个基因,也可以仅仅就是/基因得一部分;可以就是DNA本身,也可以就是由之转录而来得RNA。基因探针通过分子杂交与目得基因结合,产生杂交信号,能从浩翰得基因组中把目得基因显示出来。根据杂交原理,作为探针得核酸序列至少必须具备以下两个条件:①应就是单链,若为双链,必须先行变性处理。②应带有容易被检测得标记。它可以包括整个基因,也可以仅仅就是基基因探针因得一部分;可以就是DNA本身,也可以就是由之转录而来得RNA。 4、易感性标志:就是关于个体对外源化学物得生物易感性得指标,包括反映机体先天具有或后天获得得对接触外源性物质产生反应能力得指标。 5、基因免疫:又称DNA免疫、核酸疫苗、DNA疫苗、体细胞转基因免疫,就是一种将靶抗原编码基因置于真核表达调控元件得调控下,将该质粒DNA(裸DNA 免疫 )直接进行动物体内接种,并以与自然感染类似得方式呈递抗原,诱生特异性体液与细胞免疫应答得新理论与技术。 6、生物标志得特性: (1)分子特性化学结构与组成;物理特性;稳定性等; (2)时相特性生物标志在正常情况下可能并不存在,只有在暴露后才出现; 或虽然存在,但处于正常水平得表达,只在致病因子暴露后才发生改变; (3)个体内变异时间、部位得变异; (4)个体间变异生理、生化测定值得范围,个体得易感性; (5)群体间变异年龄、性别、民族; (6)储存 7、选择物标志得系统方法及一般原则: 系统方法:按照系统科学得观点、理论,把研究对象视为系统并以此解决认