溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源
水酶法提取花生油研究进展 摘要：近年来我国学者对水酶法制取花生油的酶解工艺条件和后续破乳方法等 方面进行了深入研究，并取得了一定的进展。本文就水酶法提取花生油研究现状 及前景作详细综述，为该技术的进一步研究及应用提供参考。 关键词：花生；水酶法；提取 引言 传统的花生油提取方法主要是机械压榨法和有机溶剂浸出法。压榨法是利用机械外力的 挤压作用将花生油从花生仁中提取出来，该方法花生油提取率低，耗能大，设备投资大，花 生粕残油率高（约10%），压榨后花生饼粕蛋白质变性程度高，主要用作饲料。同时高温会 引起多不饱和脂肪酸发生氧化酸败，使油脂产生不良风味。溶剂浸出法是基于油料中的不同 成分在溶剂中的溶解度不同而将各种成分分离。虽然提油率高（＞95%），但设备投资大， 毛油色泽较深且成分复杂，溶剂残留，需要精炼处理。溶剂浸出法常用有机溶剂为正己烷， 具有易燃、易爆和极性毒性等缺点，对工厂从业人员的安全产生威胁的同时也造成一定程度 环境污染。水酶法是一种新型提取花生油的技术，与传统的提油工艺相比，水酶法以水作为 萃取溶剂，避免有机溶剂的使用，能耗低，绿色环保，作用条件温和，水酶法提取的油中游 离脂肪酸含量和磷脂含量低，提取的油清香透明，所需精炼程度低，水酶法能同时回收蛋白质，具有极低的抗营养因。因此，就水酶法提取花生油原理及主要影响因素作简单综述，以 期为该技术研究及应用提供参考。 1、水酶法提油工艺原理及特点 水酶法提油技术是指在机械破碎的基础上，采用对植物油料细胞壁和脂蛋白、脂多糖等 复合体有降解作用的酶处理原料，通过酶对细胞壁结构、脂蛋白和脂多糖的破坏作用，使油 脂从油料中游离出来的提油技术。酶作用能够破坏包裹于油脂表面的脂蛋白膜，降低乳状液 的稳定性，达到提高出油率的目的。该技术有利于油脂提取的作用外，还具有保护油脂、蛋 白质、胶质等成分品质的作用。 2、水酶法提取花生油工艺过程及主要影响因素分析 2.1、粉碎度 油料的粉碎程度对水酶法提取油工艺的油脂的得率有重要影响。因为油料种子的细胞壁 被一定程度的破坏，缩短了酶与细胞内各种成分作用的时间。所以，在相同的提取条件下， 粒径越小得油率就会越高。在酶解前，充分破坏油料的细胞壁，使细胞内水溶性成分易于溶 出释放油脂，也扩大酶的相对作用面积和扩散速率。破碎方法有两种，一是湿法研磨，二是 干法粉碎。粉碎处理对花生水酶法提取植物油脂和蛋白质的影响，研究发现当平均粒径减小 到28μm时，总得油率和水解蛋白得率最大，分别为88.8％和77.5％。 2.2、酶解pH、温度和时间 酶的最大活性的最适pH随酶种类变化而变，水酶法反应阶段料液pH调节至与其最大酶活性相对应的值。但是，一些酶的最佳pH在蛋白等电点pH范围内，由于蛋白质在此范围内 高度不溶，会抑制油脂释放，造成蛋白资源浪费。酶解时料液pH不仅要有利于酶的活性， 也要远离蛋白质等电点。酶解温度对油脂提取率有显著影响，应该选择在酶对底物的最适作 用温度范围内，保持酶的最大活性。温度过高，不仅酶的活性逐渐丧失，而且油的颜色变暗，
中草药所含成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。为了提高中草药的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒成分。因此，中草药提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但常用的提取方法（如煎煮法。回流法、浸渍法。渗漉法等）在保留有效成分，去除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多。提取率不高等缺点。近10年来，在中药提取方面出现了许多新技术、新方法，这些新技术和方法的应用，使得中草药提取既符合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。本文就这方面作一综述。 1. 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取（简称SC FEFE）是一种以超临界流体（简称SCF）代替常规有机溶剂对中草药有效成分进行革取和分离的新型技术，其原理是利用流体（溶剂）在临界点附近某区域（超临界区）内与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，利用这种SCF作溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分。常用的SCF为CO。，因为CO。无毒，不易燃易爆，价廉，有较低的临界压力和温度，易于安全地从混合物中分离出来。超临界CO。萃取法与传统提取方法相比，最大的优点是可以在近常温的条件下提取分离，几乎保留产品中全部有效成分，无有机溶剂残留，产品纯度高，操作简单，节能。 廖周坤等用不同浓度的乙醇作夹带剂，对藏药雪灵芝进行了总皂苷粗品及多糖的苹取试验，与传统溶剂萃取工艺相比较，收率分别提高至旧．9倍和 1．62倍。何春茂、梁忠云利用超临界CO。卒取技术从黄花蒿中革取所得的萃取物中杂质（蜡状物）含量低，青蒿素提纯精制简单，收率高产品质量好。雷正杰等利用超临界CO。流体萃取技术，对厚朴的有效成分进行萃取和分离，革取物为淡黄色膏状物，经分析该萃取物由厚朴酚等11个化学成分组成，其中厚朴酚和厚朴酚的相对含量高达46．81％和45．00％。葛发欢等探讨了从黄山药中萃取薯预皂素的最佳条件，同时进行了中试放大，证明应用超临界CO。萃取薯预皂素进行工业化生产是可行的，与传统的汽油法相比较，收率提高15倍，生产周期大大缩短，避免使用汽油有易燃易爆的危险。葛发欢等研究了超临界CO。萃取柴胡挥发油和皂苷的工艺，STh－CO。法提取柴胡挥发油，与传统水蒸气蒸馏法相比较，能大大提高收率，缩短提取时间，而挥发油组成一致，只是各成分含量有差异。原永芳等通过五因素一四水平正交试 验法，用超临界流体萃取技术对川穹的挥发油萃取条件进行了优化选择，结果最佳萃取条件为压力34．smPa，温度60℃，改性剂乙醇0．3ml，静态苹取时间10min，动态萃取量10ml，以水作为吸收。与水蒸气蒸馏法相比较，该法具有耗时少，提取安全等优点。 SCFE技术对于提取分离挥发性成分、脂溶性物质、高热敏性物质以及贵重药材的有效成分显示出独特的优点，但SCFE设备属高压设备，一次性投资较大，运行成本高，因此这一技术目前在工业生产中还难以普及。 2. 超声提取技术 超声提取技术的基本原理主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散。击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、
植物酯酶提取工艺： （1）酶活测定条件的优化，如pH值，时间，底物浓度，显色剂用量及浓度等。 （2）植物酯酶或胆碱酯酶的溶剂提取条件的确定如：溶液的种类、固液比、温度、时间等。（3）纯化条件如超滤、凝胶、离子交换等条件的确定。 （4）经纯化后的纯酶的酶学性质如：热稳定性、pH稳定性、金属对酶活性的影响。 1、标准曲线的绘制 称取0.0036gα-萘酚（分子量：144.17），溶解于无水乙醇中，定容至100mL，得0.25mmol/L溶液。 分别移取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mLα-萘酚溶液，用磷酸缓冲液稀释至10mL。 在各比色管中分别加入0.5mL0.08%固兰B盐3.6%SDS显色剂，置于30℃恒温水浴5min后做光谱扫描，并在最高吸收峰测吸光度。 用测得的结果做标准曲线。 1）PH的影响 磷酸缓冲液：6、6.5、7、7.5、8 比较：以缓冲液为空白作基线，固兰B盐+缓冲液扫描，求出A0，比较大小。 不同PH条件下，各最大吸收波长偏移情况，及A值大小。 不同pH条件下，其标准曲线线性 2）固兰B盐的浓度影响 1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.08%、0.02%等，求出A0，以缓冲液为空白作基线 不同浓度下，做标准曲线 将固兰B盐放置，每天测A。，估计能放置保存天数。 3）加入SDS浓度 0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、3.6空白，A0 取一中间浓度的扫描求最大吸收波长，及A 于冰箱及常温下放置，求A、A0 确定最佳浓度及固兰B盐能放置的时间。 取0.5mL稀释酶液，加入4.5mL缓冲液（可定容至5mL），加入0.5mLα- 乙酸萘酯溶液，30度，反应5min，缓冲液定容至10mL，加入0.5mL固兰B盐，置于30℃恒温水浴5min 1)乙酸萘酯乙醇溶液浓度影响 0.04、0.02、0.015、0.0005等测（萘酯+显色剂）A0，及A，最大吸收波长 2）加入乙酸萘酯溶液体积的影响 4）最后恒温水浴时间、温度的选择 5）初始缓冲液pH选择 6）酶液的稀释倍数 于固液比（1：7）水,于35度，150rpm ,振荡30min提取，4度， 1）固液比
2011届本科毕业生毕业论文 题目：PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响 作者姓名徐萧苟真汪磊 指导教师刘秀丽 学科专业生物技术 系别生命科学与技术学院 学号2007221121 2007221102 2007221115 提交论文日期2011年6月2日
PH、金属离子在溶菌酶提取过程中对酶活性的影响 徐萧苟真汪磊 指导老师：刘秀丽 （陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳 745000） 摘要:本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过在提取过程中施以不同的PH和加入不同的金属离子，来测定其对提取的溶菌酶活性的影响。结果表明酶活性在PH6.0-6.5最强、且在5-7范围内较稳定；金属离子中Na+、K+对其活性有轻微激活作用。Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响，Ca2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+使溶菌酶活性下降。 关键词：盐析蛋清溶菌酶；酶活性；影响因素；金属离子；提取；PH Ph, Metal Ions In Mind The Enzymes Are Extracts Of The Enzyme Activity Xuxiao gouzhen wanglei （Gansu College of Life Science and Technology, Biotechnology, 07 classes in Qingyang 745000） Abstract: Objective To study the extraction process of egg white lysozyme PH, metal ions on enzyme activity levels.Methods: egg white lysozyme in the extraction process or by changing the PH by adding various metal ions the size of the different factors to determine the results of the activity of egg white lysozyme was observed enzyme activities. The results of activity of the strongest in the PH6.0-6.5 and was stable in the range 5.0-7.0; metal ions in the Na +, K + activation of its activity slightly. Mn2 +, Mg2 + had no effect on the activity of lysozyme, Co2 +, Ca2 +, Cu2 +, Fe2 +; Zn2 + is the activity of lysozyme decreased. Conclusion Preliminary results showed that acid extraction of lysozyme as part of the environment and enhance the metal ions for their activity and reduce the effect Keywords ：out truffles are an enzyme ;enzyme activity ; factors influencing Metal ion; extraction;pH; 0引言 溶菌酶(Lysozyme),正式名为N-乙酰基糖胺酶（N-lhexosaminodase）,属胞壁质酶
凝血酶的提取 凝血酶是机体凝血系统中的天然成分，它由两条肽链组成，多肽链之间由二硫键连接。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在一定条件下凝血酶被激活并转化为有活性的一种蛋白质水解酶。分子量335800，白色无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。 目前国内主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶，在经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物，顾深受广大用户的欢迎，将广泛应用于临床。由于临床使用该药日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，因此生产前景看好，只要原料有保证，技术过关，就可获得产品。 （一）原料及试剂： 1、动物血液：须选用新鲜的动物血液，防止混入其它杂志。盛血液的器具一定要干净。 2、柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）：又名枸橼酸钠。无色晶体或粒状粉末。相对密度1.875。150℃时失去结晶水，温度再高则分解。溶于水，难溶于乙醇。本工艺中主要作抗凝血剂用，防止血液凝固。选用化学纯试剂。 3、醋酸：学名乙酸。无色澄清液体，有刺激气味。相对密度1.049，沸点118℃。溶于水、乙醇和乙醚。用于调节pH值。选用化学纯试剂。 4、氯化钠：白色立方晶体或细小结晶粉末。相对密度2.165，熔点801℃。味咸，中性。有杂质时易潮解。溶于水和甘油，难溶于乙醇。选用一级工业品。 5、氯化钙：白色立方晶体，易潮解，相对密度2.15，熔点782℃，沸点大于1600℃，溶于水、乙醇。本工艺中用作激活剂，选用分析纯试剂。 6、丙酮：无色易挥发、易燃液体。有微香气味。相对密度0.7893，沸点56.5℃。于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶。能溶解油、脂肪、树脂和橡胶。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物，化学性质活泼。本工艺中用作沉淀剂，选用化学纯试剂。 7、乙醇：又称酒精，无色透明易挥发、易燃的液体。有酒味和刺激辛辣滋味。相对密度0.789。沸点78.4℃。溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸湿性，能与水形成共沸混合物。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物。本工艺中用来洗涤凝血酶，选用工业乙醇。 8、乙醚：又称二乙醚。是易流动的无色透明液体。有令人爽快的特殊气味，其蒸汽能使人失去知觉，甚至死亡。相对密度0.7135，沸点34.5℃。难溶于水，易溶于乙醇和氯仿等溶剂，极易挥发和着火。本工艺主要用于洗涤凝血酶，选用化学纯试剂。使用时，操作人员应注意防护，避免吸入，周围应杜绝明火并保持空气流通。 9、草酸钾：又名乙二酸钾。这里用于测定凝血酶活性，选用分析纯试剂。 10、标准纤维蛋白原：这里用于测定凝血酶效价，选购药检部门提供的标准品。 （二）凝血酶的提取工艺： 1、工艺流程：
方法对比讲稿用 2.1 结晶法 溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。 2.2 离子交换法 离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。 （联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。） 2.3 色谱法 以亲和力为基础，将不溶性的载体与可逆结合的配体相偶联，制备成具有特异亲和性的分离介质，选择性地吸附生物活性物质，依据待分离物质的特性再利用相应组成的溶液洗脱而达到分离提取需要物质的目的，这就是 20 世纪 80 年代末发展起来的亲和色谱技术。亲和色谱技术是诸多色谱法的一种，选择性高、快速、高效，适合蛋清溶菌酶高效分离与纯化的需要。随着生产对技术要求的提高，研发人员以传统的膜处理为基础，利用固定离子亲和色谱和膜分离相结合，制备固定金属亲和膜，因其具有良好的分离性能，可用于蛋白质的分离纯化。多方研究结果表明固定金属亲和膜对溶菌酶的选择吸附性能良好。如若将间歇式吸附与连续式脱附耦合亲和层析法相结合，用于溶菌酶分离纯化，蛋白质回收率和吸附剂利 用率都会有明显提高。 2.4 亲和分离法 亲和力为基础，借助物质间的特异性结合力，使目的物质或者杂质与相应的配基结合而达到分离纯化目的物的目的，即亲和分离法，包括亲和沉淀法、亲和膜分离法、亲和过滤法、亲和层析法等。尤以亲和层析法和亲和沉淀法的应用广泛。亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具
天然植物有效成分的提取新技术——生物酶解技术 酶是生物体活细胞产生的，以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。某些酶可以在常温、常压和温和的酸碱条件下，将植物细胞壁分解，较大幅度提高天然植物中有效成分的提取率，改善生产过程中的滤过速度和纯化效果，提高产品纯度和制剂的质量。 生物酶解技术包括酶法提取(又称酶反应提取)和酶法分离精制两方面。该技术是在传统的天然植物成分提取基础上进行的，应用常规提取设备即可完成，操作简便，成本低廉。 1原理 酶法提取是根据植物细胞壁的构成，利用酶反应所具有高度专一性的特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分(纤维素、半纤维素和果胶质)水解或降解，破坏细胞壁结构，使细胞内的成分溶解、混悬或胶溶于溶剂中，从而达到提取目的，且有利于提高成分的提取率。许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。 天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。由于酶反应具有高度的专一性，决定了酶解方法除杂的高效性。 2酶的种类 2．1 用于天然植物细胞破壁的酶 2．1．1 纤维素酶 纤维素是由链状结构的β-D-葡萄糖以β- l，4-葡萄糖苷键结合而成的聚合物，纤维素分子束聚集成为较大的单位——微纤丝，构成了植物细胞壁的框架，在微纤丝之间的空隙中尚有其他物质(角质、木质素、二氧化硅)，形成植物细胞壁的基本结构。在干燥植物中纤维素约占总重的l／3～l／2。 纤维素酶具有分解、软化纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量的作用，它是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡萄糖苷酶3个组分。最适pH值4～5，最佳作用温度40~60℃。 2．1．2半纤维素酶 半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿托伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡聚糖等多种组分，约占植物干重的35％。含量仅次于纤维素。 半纤维素酶由β-甘露聚糖酶、β-木聚糖酶等内切型酶，β-葡萄糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 2．1．3果胶酶 果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种子中。 果胶酶是分解果胶质的聚糖水解酶、果胶质酰基水解酶的一类复合酶的总称。固体的呈浅黄色，易溶于水；液体的呈棕褐色。最适作用温度45-50 ℃，作用pH值3～6。
鸡蛋溶菌酶提取 溶菌酶（又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶） 是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 性质： 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适 pH值6.5。稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃， pH值为3条件下，15min后活力保持87%。抑制剂有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm 处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌 作用： 溶菌酶的用途极为广泛，在医药上，可与血液中的病毒结合，阻止流感、腺病毒等的繁殖；能分解粘多糖，有利于脓汁、痰液的排出；能清除坏死组织、增进抗生素的药效以及促进肠道有益细菌如乳酸菌的繁殖等作用；另外，它与抗生素联合应用还可治疗支气管炎、肺炎、白喉、小儿急性肾炎等多种疾病。在食品上，卵清溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解，而对其他物质无反应，人们利用它来代替有害健康的化学防腐剂（如苯甲酸及其钠盐），以达到保存食物的目的，是一种天然防腐剂；溶菌酶添加于牛乳，可使牛乳人乳化，提高了牛乳的营养价值。 提取工艺： （一）鸡蛋清中提取溶菌酶 方法一——食盐盐析 一．材料： 原料：鸡蛋、NaOH、NaCl、丙酮、（市售溶菌酶粉剂） 仪器与设备：搅拌器（200-300r/min）,离心机（4000r/min），抽滤机 二．工艺流程： 原料→ 清洗→ 去蛋壳→ 分离蛋清→ 搅拌→ 过滤→ 加盐→ 调节pH 值→ 结晶→ 干燥→ 成品→ 包装
实验一酶的提取及活力测定 实验目的 掌握酶提取的一般方法 了解不同因素对酶活力的影响 掌握测定酶活力的方法 实验原理 多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。 PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。 本实验将采用苹果为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、有机溶剂沉淀等步骤获得PPO的粗酶液，并对酶活力进行测定。 实验步骤 1.苹果洗净后，在4℃保温，去皮取果肉200g，立即加入冷冻丙酮500ml，用高速组织捣 碎机匀浆2min，用布氏漏斗抽滤，滤饼用200ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。 2.称取丙酮粉0.5g，溶于250ml 0.05M、pH6.8的预冷（4℃）磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌 器搅拌20min，5000rpm离心10min，上清液过滤，即得PPO粗酶液。 3.酶活性测定： 取酶液1ml，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1MpH6.5磷酸缓冲液、0.6ml 1%邻苯二酚溶液、0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恒温水浴10min，立即加入6M尿素3ml终止反应，4000rpm 10min 取上清液。在460nm处于1-2min内测吸光值，空白对照中用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚。 4.计算以每克样品每分钟内A460吸光值增加0.1为1U 酶活力=A460*酶提取液总量（ml）/（0.1*反应时间*样品重量*测定用酶液量ml）(按齐莹组的数据进行计算) 思考题： 除了用有机溶剂沉淀酶外，还可以用什么样的方法沉淀酶？ 实验二酶提取液中蛋白质含量测定 实验目的 学习紫外分光光度计的使用方法 掌握紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理和方法 实验原理 由于蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度与其浓度成正比关系，可作定量测定。 实验操作 1.标准曲线的绘制，取四支试管，按表编号并加入试剂
用酶法从虎杖中提取白藜芦醇的工艺流程图 45—50℃, PH4.8±0.2,沿壁缓慢 加入HCl调节PH值,轻轻搅拌 加复合酶增加收率原因：一是植物细胞壁被破坏，使内容物溶出率增加；二是白藜芦醇苷在复合酶的作用下被转化成白藜芦醇。 可用复合酶SPE—002、SPE—007醇提前和醇提后的酶解结果与单独进行乙醇提取得率进行比较。
从茶叶中提取茶多酚 过滤 提取物 酶提法优点： ○1可以软化植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出，提高收率；对茶叶进行复合酶法提取, 茶多酚提取率可达98 %以上; 酶解法提取的茶多酚中儿茶素相对含量较沸水提取的高出9 %～10 %。○2酶法提取茶多酚及多糖具有提取率高, 且茶多酚的主要活性成分———儿茶素氧化损失少, 原料茶叶不需粉碎○3节省时间，降低成本；
酶法提取红景天有效成分的工艺流程图 1、酶提法 红景天 SPE —001或007 提取物〈 2、醇提法（略） 3、水提法（略） 酶提法优点： ○1可以使植物细胞壁破裂，使有效成分最大限度溶出，提高收率； ○ 2可替代水提醇沉工艺，节省时间，降低成本； ○ 3可降解红景天中的氨基酸、多肽、多糖、易于滤过。 每次分别为3、2、1小时 粉碎
1、酶提法 菊花 SPE — 007 提取物 2、醇提法（略） 3、水提法（略） 酶提法、醇提法与水提法进行比较 SPE-007：主要用于破除植物细胞壁，使有效成分最大限度溶出。SPE-006：主要用于提取液的沉清，加快滤过速度，降低成本。 加7倍量水 60℃水浸泡30min 40℃温水，PH ：4.8 活化5—10min 1∶10倍量水溶解酶 用水煎煮3h 温度降至45-52℃，PH ：3.5—4.5,时间1.5h 提取液 用SPE-006（干物 质重量）的40ppm
(10)授权公告号 (45)授权公告日 2014.11.12 C N 103114082 B (21)申请号 201310069093.9 (22)申请日 2013.03.04 C12N 9/36(2006.01) (73)专利权人浙江工业大学 地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18号 (72)发明人张健 金志敏 夏春年 姚小武 张岩 (74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人黄美娟 王兵 CN 1108381 C,2003.05.14, 陈若飞.从蛋壳中提取溶菌酶的研究..《沈 阳化工学院院报》.2008, 卢庆祥.用聚丙烯酸凝聚提取溶菌酶..《化 学教学》.1995, M. Sternberg 和D. Hershberger.Separation of proteins with polyacrylic acids..《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure 》.1974,(54)发明名称 一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的方法 (57)摘要 本发明公开了一种从鸡蛋清中分离溶菌酶的 方法：用水将鸡蛋清溶解，调节pH 至4.0～5.0 并加热至80℃左右，使杂蛋白沉淀、过滤除去，获 得滤液；再在弱酸性条件下，用木质素磺酸钠与 滤液中的溶菌酶进行聚合、沉淀；然后，将沉淀物 在碱性条件下溶解，用聚丙烯酰胺水溶液使其解 离，过滤得滤液；最后，向滤液中加入无水乙醇使 其结晶，过滤、干燥即得溶菌酶；本发明使用的原 材料价格低、工艺简单、条件温和、便于操作控制、 生产周期短，比以往的沉淀法更经济，更适合于工 业化生产。(51)Int.Cl.(56)对比文件 审查员 孙彦珂 权利要求书1页 说明书5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利权利要求书1页 说明书5页(10)授权公告号CN 103114082 B
第一节溶菌酶的提取 一、简介 1.Lz的结构及组成 溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特 别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。 鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四 图5-1 溶菌酶的分子结构 对二硫键，分子量为14300。结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。 2.Lz的基本性质 Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。 （1）Lz的热稳定性 Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。一般认为Lz在酸性条件
下稳定，在碱性条件下不稳定。 糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。 （2）加工过程中的化学变化 蛋白质和过氧化的脂类作用对食品的储藏有着重要的影响，自由基使不饱和脂肪酸过氧化产生H2O2,导致产品的破坏，这类反应的一个特征是产品的溶解性下降。溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子质量，这是由于在Lz中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明Lz中游离基浓度随水分活度的上升而下降。 在150℃~300℃焙烤对溶菌酶和酪蛋白的作用中，溶菌酶被作为一个纯蛋白质样品在250℃几乎所有溶菌酶的氨基酸被分解，色氨酸，含硫氨基酸、碱性氨基酸和β-OH氨基酸，较酸性氨基酸、脯氨酸、芳香族氨基酸(除色氨酸外）、有烷侧链的氨基酸容易分解这在氨基酸和还原糖间形成风味和有色物质的美拉德反应中是很重要的。 （3）络合作用 溶菌酶和许多物质形成络合物导致其失活。人们发现等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活力；脱水全蛋中仅保留部分溶菌酶的活力；蛋黄污染的蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的三个峰；对全蛋的色谱分离无溶菌酶。据此，研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。 3.Lz的用途 溶菌酶作为一种活性物质可应用在各个领域，我国的食品工业、酶工程、发酵工业、医学和科学研究对溶菌酶有较大的需求。 由于溶菌酶对多种微生物有抑制作用，因此可以用于食品保鲜。目前主要应用于海产品、水产品、乳制品和干酪的保鲜，低度酒、糕点及饮料的防腐，以及水产熟制品及肉类熟制品的防腐保鲜的方面。 此外在发酵工业领域，酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。另外溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶。由此可见溶菌酶的用途极其广泛。 4.Lz的来源及分布 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在，根据来源不同，将溶菌酶分为以下三类： （1）动物源溶菌酶 动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应
植物蛋白酶提取纯化工艺 生物工程09-2班陈福泉学号：3090343214 一、实验目的 1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作； 2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤； 3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法 二、实验原理 植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等 以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次，料液比1∶1；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h，透析袋（14000）低温透析12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为 6.0，30℃保温30min，酶活稳定。 三、实验材料 材料与试剂 新鲜生姜、酪蛋白（化学纯）、考马斯亮蓝G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。 0.01%（w/v）考马斯亮蓝G-250溶液：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%vol乙醇中，加入85%正磷酸100mL，蒸馏水定容至1000mL。 0.5%酪蛋白溶液：称取0.5g酪蛋白，先用少量0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量 0.02 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至100mL。 四、实验步骤 方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为60% , 4000 rpm 离心15 min。收集上层不溶物, 用少量pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在4 e 下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容, 即为生姜蛋白酶提取液。 方法二：生姜蛋白酶的提取取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含1 mmol/L EDTA和5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比1：2打浆，所得浆液低速搅拌20m i n，搅拌过程中缓慢加入20％（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁4℃下静置2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉
作为一种糖苷水解酶的溶菌酶，又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶广泛存在于鸟类的蛋清及哺乳动物的尿液、泪液、血液、体液(如淋巴液)、组织(如肝)、肾细胞内等[1]。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸(NAM)和N-乙酰氨基葡糖(NAG)之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解为可溶性糖肽，导致细胞壁破裂而使细菌溶解。溶菌酶对人体无毒副作用，是一种安全的天然防腐剂，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤之功效。可用作为药物制剂、防腐剂、基因与细胞工程中细胞融合剂等[2]。 作为碱性酶的溶菌酶，其来源不同，水解细胞壁的性能也表现为较大差异[3]。溶菌酶水解微生物细胞壁的作用机理是破坏细胞壁结构中的肽聚糖，作用位点是NAM与NAG碳原子间的β-1.4糖苷键[4]。肽聚糖作为微生物细胞壁的主要成份(骨架)，是NAG 与NAM 通过 β-1，4 糖苷键交替排列形成的多层网状结构的共聚物[5]。肽聚糖结构中的任何化学键断裂，都能促使细胞壁中的肽聚糖分解，导致细菌细胞壁被破坏，从而体现溶菌酶的溶菌特性[6]。 近年来，根据不同原料及溶菌酶的特性，提取分离溶菌酶的方法有结晶法、反胶团萃取法、离子交换法、色谱法、亲和层析法等。结晶法这一传统的方法，是由 Mayer Abraham 等提出并获得结晶状溶菌酶[7]。本文利用湖光岩地区的鹌鹑蛋为提取原料，采用结晶法提取分离溶菌酶，进而利用重结晶的方法反复精制，可提取到所需纯度的溶菌酶晶体[8]。 1 实验 1.1 主要仪器、试剂与材料 1.1.1 主要仪器 UV-29200 紫外可见分光光度计；JJ-a 数控恒温磁力搅拌器；M304781 离心机；DSX-280B蒸气压力灭菌锅；KYC-111 摇床；SW-CJ-2F 超净工作台；FD-1B-50 冷冻干燥机；2X-15D 旋片式真空泵；R201 旋转蒸发仪；Sorvalls Upert-21 高速离心机；YP-5002 电子天平。 1.1.2 主要试剂 R-250、G-250考马斯亮蓝；NaH2PO4；Na2HPO4；1mol/L NaOH；20000 u/mg溶菌酶标准液；3g/L牛肉膏；营养肉汤；10g/L胰蛋白陈；微球菌； 5.1%的 NaCl溶液；HCl；CH3COOH；琼脂。 1.1.3 主要材料 新鲜湖光岩鹌鹑蛋，购置于湖光岩农贸市场。 1.2 实验方法 溶菌酶结晶法提取及其酶活力的探讨 黄赞良，谈海玉，邓彩思，张兆霞*，李 泳* （广东海洋大学，广东 湛江 524088） 摘 要：以湖光岩鹌鹑蛋为原料，采用结晶法从蛋清中分离提取溶菌酶。探讨不同条件对溶菌酶收率及活性的影响，确定溶菌酶最佳的分离提取条件：盐析NaCl质量分数为5.1%，pH=10.7，盐 析时间为120h，收率达到 0.378%，酶活力达到 13700 U/mg。 关键词：盐析法；溶菌酶；酶活力 中图分类号：S188 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2017）05-083-04 _________________________ 收稿日期：2017-04-25 基金项目：广东海洋大学团队项目（项目编号：C13435）, 大学生创新创业项目（项目编号：CXXL2016152）。 作者简介：黄赞良，广东海洋大学，制药工程专业，大学生。 *通讯作者：张兆霞，李泳，广东海洋大学教师，从事生物酶相关方面的科研工作。
摘要:介绍了提取新技术酶法的原理,以及酶处理技术在中草药各部分提取工艺的研究应用现状,并展望了酶处理技术的应用前景。 关键词:酶法，提取 Abstract: The extraction of the principle of the new enzyme technology and processi ng technology of Chinese herbs in all parts of extraction process of application status and prospects of processing applications. Key words: enzymatic extraction [中图分类号] [文献标识码] A [文章编号] 现代中药提取中越来越多的应用到纤维素酶，纤维素酶可以快速、温和的分解细胞壁，使中药有效成分析出。恰当地利用纤维素酶处理中药材，可改变细胞壁的通透性，提高药效成分的提取率。本文就酶法提取的原理以及酶法对于中草药不同部位的提取情况作一综述。 1.酶法提取的原理 中药中植物药占90%，植物细胞由细胞壁及原生质体组成。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质，木质素等物质构成的致密结构，一般分为3层，即胞间层、初生壁和次生壁。胞间层的主要成分为果胶质。初生壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成。初生壁的结构甚为复杂，由纤维素分子组成的微纤丝构成了其基本骨架，在微纤丝之间的空隙中，填着果胶质和半纤维素的胶体状物质。和初生壁一样，次生壁的骨架也是由纤维素分子组成的微纤丝构成[1]。在中药提取过程中，细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细胞壁及细胞间质的双重阻力。通过选用一些恰当的酶类，如纤维素酶、半纤维索酶、果胶酶等作用于药用植物细胞，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶等物质降解，破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率提高[2]。中药酶法提取是在传统的溶剂提取方法的基础上，根据植物药材细胞壁的构成，利用酶反应所具有