亮氨酸氨基肽酶测定试剂盒（L－亮氨酸-p-硝基苯胺底物法）适用范围：用于体外定量测定人血清中的亮氨酸氨肽酶的活性。
1.1规格
1.2组成
2.1 外观
2.1.1试剂1：无色液体，无浑浊，无不溶物。
2.1.2试剂2：无色至淡黄色液体。
2.1.3包装外观应整洁，标签字迹清晰，不易脱落。
2.2 净含量
液体试剂的净含量不低于标示体积。
2.3 试剂空白
2.3.1试剂空白吸光度
试剂空白吸光度≤0.3 。
2.3.2试剂空白吸光度变化率
试剂空白吸光度变化率（ΔA/分）≤0.002。
2.4 分析灵敏度
样本浓度为50 U/L时，ΔA/分≥0.010。
2.5 线性区间
在[14，300]U/L范围内，线性相关系数r≥0.990，测试浓度在[14，50]U/L 时，绝对偏差不超过±5U/L，测试浓度在（50，300]U/L时，相对偏差不超过±10%。
2.6 精密度
2.6.1 批內精密度
用高、中、低3个浓度的样本测试试剂盒，各重复测试10次，其变异系数（CV）应不大于6%。
2.6.2批间差
用样本分别测试3个不同批次的试剂盒，每个批次测试3次，其相对极差（R）应不大于10%。
2.7 准确度
回收率在85%-115%范围内。
2.8 稳定性
原包装试剂盒在2℃～8℃避光保存下有效期为12个月，有效期满后3个月内测试，应满足2.3、2.4、2.5、2.6.1和2.7的要求。
唾液酸酶法与常规镜检法的临床应用比较 摘要：目的通过唾液酸酶检测法和白带常规镜检法的结果进行对比分析，探讨唾液酸酶法在细菌性阴道病（BV）中的诊断价值，为临床快速诊断BV提供可靠的方法。方法将480例患者按年龄分为四组（50岁），同时应用唾液酸酶法和常规镜检法检测，对比分析结果。结果唾液酸酶法的阳性率为17.91%，白带常规镜检法的阳性率8.75%，两种方法检测细菌性阴道病的阳性率的比较，差异有统计学意义（P50岁组的阳性率为最高（25.68%）。结论唾液酸酶法操作简便、快速，提高了阳性检出率和准确度，适合临床推广。 关键词：细菌性阴道病；阴道分泌物；白带常规镜检法；唾液酸酶法 Abstract：Objective To investigate the significance of sialidase test in diagnosis of bacterial vaginosis by comparing sialidase test with conventional microscopy，and provide rapid and reliable methods for diagnosis BV in clinic. Methods Sialidase test and conventional microscopy were used to determine 480 samples （50 years old group） and the results were analyzed comparatively. Results The positive rate of sialidase test for diagnosis BV was
土壤亮氨酸氨基肽酶（S-LAP）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4025 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入3mL丙酮溶解。 产品说明： S-LAP是一类能水解肽链N-末端为亮氨酸的酶，由土壤微生物分泌。S-LAP活性变化与机体某些病理状态密切相关。 S-LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算S-LAP活性。 自备实验用品及仪器： 天平、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、甲苯、丙酮、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 土样自然风干，过30-50目筛。 二、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。 2、加样表： 测定管对照管 土样（g）0.030.03 甲苯（μL）1515 震荡混匀，室温静置15min。 试剂一（μL）255255 试剂二（μL）30-
30℃水浴反应1h后立刻煮沸5min。流水冷却至室温。 试剂二（μL）-30 14000g常温离心10min，取200μL上清于405nm处测定吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照顾管。 三、酶活计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol对硝基苯胺为一个酶活力单位。 S-LAP活性（U/g）=△A÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.507×△A÷W。 ε：对硝基苯胺摩尔消光系数：9.87×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，300μL=3×10-4L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟氧化1nmol对硝基苯胺为一个酶活力单位。 S-LAP活性（U/g）=△A÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.844×△A÷W。 ε：对硝基苯胺摩尔消光系数：9.87×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应总体积，300μL=3×10-4L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
唾液酸（SA）测定试剂盒（神经氨酸苷酶法）适用范围：该产品用于体外定量测定人血清或血浆中唾液酸的浓度。 1.1 产品规格
1.2 组成成分 1.2.1 试剂组成 试剂1： Tris缓冲液 0.1 mol/L PH=7.0 神经氨酸苷酶 >0.2U/mL 乳酸脱氢酶 >2U/mL 试剂2： Tris缓冲液 0.1 mol/L PH=9.0 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH） >0.13mmol/L N-乙酰神经氨酸醛缩酶 >2U/mL。 1.2.2 校准品的组成 单水平的液体校准品，在水基质中添加唾液酸（60mg/dL），稳定剂<0.1%； 定值范围：(50-70)mg/dL。 1.2.3质控品的组成 两个水平的液体质控品，在牛血清（30g/L）中添加唾液酸（60mg/dL和150mg/dL），稳定剂<0.1%； 定值范围：（50-70）mg/dL、（120-180）mg/dL。 2.1 外观 液体双试剂：试剂1:无色至淡黄色液体，试剂2：无色至淡黄色液体。 校准品：无色至淡黄色澄清液体。
质控品：无色至淡黄色澄清液体。 2.2 净含量 液体试剂的净含量不得低于标示体积。 2.3 空白吸光度 在规定参数下，试剂空白吸光度≥0.8。 2.4 分析灵敏度 浓度为60mg/dL时，吸光度变化应≥0.005.。 2.5 线性 在(0，200]mg/dL线性范围内，线性相关系数r ≥0.996。在(0，50]mg/dL范围内绝对偏差不超过5mg/dL，在（50，200]mg/dL范围内的相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 变异系数CV应≤8% 2.7 批间差 不同批号之间测定结果的相对极差应≤10%。 2.8准确度 回收试验：回收率应在90%-110%范围内。 2.9 质控品赋值有效性 测定值在质控靶值范围内。 2.10校准品溯源性要求 根据GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品控制物质赋值的计量学溯源性》及有关规定提供唾液酸校准品的来源、赋值过程以及测量不确定度等内容。校准品溯源至唾液酸纯品（Sigma）。
白带常规与BV唾液酸酶法联合检测的临床价值 发表时间：2013-12-10T12:57:52.687Z 来源：《医药前沿》2013年11月第31期供稿作者：朱建新 [导读] 在育龄期妇女的阴道感染性疾病中，细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎和滴虫性阴道感染是最为常见的妇科病。 朱建新（江苏省常熟市辛庄中心卫生院检验科江苏常熟 215500） 【摘要】目的对白带常规、BV唾液酸酶法在妇产科常规检查中的临床价值。同时观察BV合并霉菌滴虫感染情况。方法对本院妇产科门诊2012年11月至2013年10月321例阴道分泌物常规检查。通过盐水涂片法查找滴虫，进行革兰染色判断清洁度及检查念珠菌、线索细胞，通过唾液酸酶检测细菌性阴道病(BV)。结果清洁度Ⅱ度占31.46%；Ⅲ度占62.62%；Ⅳ度占5.92%；霉菌感染占20.87%；滴虫感染占3.43%；BV唾液酸酶法检测阳性占27.10%；念珠菌、滴虫和BV阳性混合感染占4.05%。结论白带常规与BV唾液酸酶法联合检测在妇科常规检查中两者都有其独立的临床价值，能更好的正确诊断、合理用药，规范治疗，提高治疗效果。 【关键词】白带常规 BV唾液酸酶法联合检测 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）31-0262-01 在育龄期妇女的阴道感染性疾病中，细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎和滴虫性阴道感染是最为常见的妇科病。特别是对于孕前女性阴道分泌物常规筛查，女性患有阴道炎症会引起产道感染和宫内感染，还会造成早产、胎膜早破、低体重儿、先天发育畸形等严重后果。现对本院321例阴道分泌物检测结果分析报道如下。 1 资料与方法 1.1 临床资料对我院妇产科门诊2012年11月至2013年10月321例阴道分泌物进行白带常规与BV唾液酸酶法联合检测。 1.2 试剂（1）0.9％的氯化钠溶液。（2）细菌性阴道病检测试剂盒（唾液酸酶法）。 1.3 仪器江元医疗AT-1600全自动细菌性阴道病检测仪。 1.4 检测方法通过显微镜检和形态学检测阴道毛滴虫、霉菌、线索细胞和清洁度。 （1） 0.9％氯化钠湿片法：阴道毛滴虫采用0.9％氯化钠湿片法高倍镜观察20个视野，找到波状运动的阴道毛滴虫可以判断为阳性。（2）革兰染色法：霉菌性阴道炎采用革兰染色法，油镜观察。霉菌可以找到革兰氏阳性孢子或假菌丝与出芽细胞相连接，成链状及分枝状。（3）细菌性阴道病检测（唾液酸酶法）：根据仪器操作规程与细菌性阴道病检测（唾液酸酶法）试剂盒操作规程操作。 1.5 白带常规清洁度判定标准：参照《全国临床检验操作规程》第三版。 2 结果 2.1 妇产科门诊321例白带常规与BV唾液酸酶法联合检测结果。见表（1）。 表（1） 321例白带常规与BV唾液酸酶法联合检测结果 3 讨论 通过阴道分泌物检查除了可以判断阴道有无炎症，还能进一步诊断炎症发生的原因。当清洁度达到Ⅲ、Ⅳ度时，多数情况下可诊断为阴道炎症（如滴虫性阴道炎、真菌性阴道炎和细菌性阴道炎）为炎症的治疗提供依据。单纯清洁度增高多见于非特异性阴道炎。在检查中发现有阴道滴虫可诊断为滴虫性阴道炎或滴虫感染。有阴道霉菌时可作为霉菌性阴道炎的诊断依据。此外，清洁度、阴道霉菌、阴道滴虫，它们与BV无直接关联。但患有滴虫性阴道炎和霉菌性阴道炎的患者由于其阴道内正常菌群数量减少，更易感染BV，也就是会出现合并感染。 镜检有线索细胞，但BV检测不一定是阳性。因为镜检时有人为带来的错误，而且现在主张线索细胞占20%以上才能判断线索细胞阳性。所以，如果把镜检有线索细胞就认为BV检测一定阳性这错误的观点用在诊断和治疗中，就会产生不良的后果。BV则是由于阴道内原有的菌群比例发生了改变，加特纳菌、厌氧菌占绝对优势而引起的阴道病症，和长期滥用抗生素有关，该病阴道黏膜无充血的炎症表现。在临床上，清洁度II度时，BV检测阳性率也占了一定的百分比。因此，白带常规与BV唾液酸酶法联合检测，在临床妇科病的诊断和治疗中有积极意义。 参考文献 [1] 《全国临床检验操作规程》第三版 324. [2] 辛华，占伏良等《白带常规找线索细胞检测细菌性阴道炎与Amsel、BV Blue结果比较》检验医学 2006,21(3) 307-308.
附录唾液酸测定法 (间苯二酚显色法) 本法系用酸水解方法将结合状态的唾液酸变成游离状态，游离状态的唾液酸与间苯二酚反应生成有色化合物，再用有机酸萃取后，测定唾液酸含量。 唾液酸对照品溶液（200μg/ml）的制备精密称取唾液酸对照品10.52mg（1μg唾液酸相当于3.24nmol），置10ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，混匀，即为唾液酸贮备液（1mg/ml），按一次使用量分装，-70℃贮存，有效期1年。仅可冻融1次。4℃保存使用期为2周。精密量取唾液酸贮备液1ml，置5ml量瓶中，加水至刻度，即为每1ml含200 μg的唾液酸对照品溶液，用前配制。 测定法取供试品适量，加水稀释至蛋白质浓度约为每1ml含0.2～0.4mg，作为供试品溶液。按下表取唾液酸对照品溶液、水及供试品溶液于10ml玻璃试管中，混匀，每管再加入间苯二酚-盐酸溶液（分别量取2% 间苯二酚溶液2.5ml、0.1mol/L硫酸铜溶液62.5μl、25% 盐酸溶液20ml，加水稀释至25ml，混匀。试验前4小时内配制）1ml，加盖，沸水煮沸30分钟(水浴面高于液面约2cm)，取出置冰浴中3分钟(同时振摇)后，每管加乙酸丁酯-丁醇液（取乙酸丁酯4份与丁醇1份混匀,室温下保存,12小时内使用）2ml，充分混匀， 用唾液酸对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归（相关系数应不低于0.99），由直线回归方程求出5μg唾液酸的吸光度，再按下式计算 供试品唾液酸含量 (mol/mol 蛋白质) ＝A2×5×3.24×W×D A1×P×100 式中A1为5μg唾液酸的吸光度； A2为供试品的吸光度； D为供试品稀释倍数； P为供试品蛋白质含量，μg/μl； W为1nmol促红素的量，相当于 1
唾液酸测定试剂盒（神经氨酸苷酶法）适用范围：本品用于体外定量测定人血清中唾液酸的含量。 1.1规格 规格1： (试剂1：15mL；试剂2：5mL)； 规格2： (试剂1：30mL；试剂2：10mL)； 规格3： (试剂1：60mL；试剂2：20mL)； 校准品：（选配）: 规格1（0.3mL×1；1水平)；规格2（0.5mL×1；1水平)；规格3（1.0mL×1；1水平)； 质控品：（选配） 规格1（0.5mL×2；2水平)；规格2（1.0mL×2；2水平)。 1.2组成 试剂盒组成见表1 表1 唾液酸测定试剂盒组成
注：校准品及质控品赋值具有批特异性，每批次浓度详见标签。 2.1试剂 2.1.1外观 试剂盒外观应整洁，文字符号标识清晰；组分齐全，液体无漏液；试剂1、试剂2为透明液体，不得有沉淀和絮状物。 2.1.2装量 每瓶不少于标示值。 2.1.3试剂空白吸光度 用指定的空白样品测试试剂（盒），在光径1cm下，在340 nmm处测定试剂空白吸光度≥0.8A，空白吸光度变化率≤0.01A。 2.1.4分析灵敏度 试剂测定75mg/dL被测物，吸光度变化≥0.01A。 2.1.5线性范围 2.1.5.1在[2，200] mg/dL内,相关系数R≥0.990。
2.1.5.2在[2，40] mg/dL内，线性绝对偏差不超过±4mg/dL；(40，200] mg/dL 内，线性相对偏差不超过±10%。 2.1.6 重复性 重复测试（75±15）mg/dL和（150±30）mg/dL样本，所得结果的变异系数（CV%）应不大于5%。 2.1.7批间差 测定（75±15）mg/dL和（150±30）mg/dL样本，所得结果的批间相对极差（R）应不大于10%。 2.1.8准确度 ）中加入一定体积高于200 mg/dL的唾液酸纯在正常浓度范围的临床样本（C 品（Cs）或由纯品配制的标准溶液，回收率应在90%-110%范围内。 2.2校准品 2.2.1外观 校准品为淡黄色液体。 2.2.2装量 每瓶不少于标示值。 2.2.3准确度 与配套试剂组成测试系统，指标要求同2.1.8。 2.2.4 校准品溯源性 根据GB/T21415-2008的要求，校准品溯源至工作校准品，工作校准品采用上海聚创医药科技有限公司SA试剂盒进行方法学比对赋值。 2.3质控品
亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4140 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入5mL丙酮溶解。 产品说明： LAP是一种膜结合酶，广泛存在于肝、胆、胰等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标，特别是肝癌鉴别诊断的指标。 LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵。 操作步骤： 一、样本处理： 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定操作：
1、分光光度计预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。 2、加样表：在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂 试剂名称（μL）测定管空白管 试剂一50 样品上清50 试剂一850850 试剂二100100在1mL玻璃比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于405nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴3min，拿出迅速擦干测定210s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、酶活计算公式 1、液体LAP活力的计算： 单位的定义：每mL液体每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=675.4×ΔA 2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算: （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=675.4×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=675.4×ΔA÷W （3）按细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细胞每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.35×ΔA V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×103L/mol/cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需单独测定；W：样本质量，g；
唾液酸测定试剂盒(比色法) 适用范围：用于体外定量测定人血清中唾液酸的浓度。 1.1 规格 试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体双试剂,校准品为液体剂型，质控品为冻干粉。规格及装量见表1。 表1 规格及装 量 1.2主要组成成分
试剂1主要组分： 试剂2主要组分： 校准品主要组分： 质控品主要组分： 2.1 净含量 应不低于试剂瓶标示装量。 2.2 外观 试剂1：无色或淡黄色透明溶液；试剂2：无色或黄色透明溶液，校准品：为无色透明液体，质控品：为浅黄色至黄色冻干粉，复溶后为浅黄色至黄色液体。外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。 2.3 试剂空白 2.3.1 试剂空白吸光度 在340nm处测定试剂空白吸光度，应≥0.05； 2.3.2 试剂空白吸光度变化率
试剂空白吸光度变化率△A/min≤0.8。 2.4 分析灵敏度 测试50 mg/dL的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应不低于0.0005。 2.5 准确度 参照EP9-A2的方法，用比对试剂盒同时测试40例线性区间内的不同浓度的血清样本，其相关系数r≥0.975。[10,60）mg/dL区间内绝对偏差不超过±6mg/dL；[60，180]mg/dL区间内相对偏差不超过±10%。 2.6 重复性 批内变异系数（CV）应不超过10％。 2.7 线性 2.7.1在[10,180]mg/dL区间内，线性相关系数r应不低于0.990； 2.7.2[10,60）mg/dL区间内绝对偏差不超过±6mg/dL；[60，180]mg/dL区间内相对偏差不超过±10%。 2.8 批间差 对同一份样品进行重复测定，相对极差不大于10％。 2.9质控品批内瓶间差 变异系数（CV）应≤5%。 2.10溯源性 根据GB/T 21415-2008的规定，本试剂盒内校准品溯源至企业工作校准品，与已上市公司试剂盒进行比对赋值。 2.11质控品赋值有效性 质控品测值应在靶值范围内。
细胞唾液酸化相关酶的荧光成像检测新方法研究糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它们在各种基础生命活动的过程中起重要作用,并且对机体的恶性转化特别敏感。绝大部分聚糖的生物合成发生在细胞的内质网和高尔基体中,然而即使在糖蛋白生物合成之后,聚糖结构的修饰依然在酶催化作用下不断的进行着,这一过程称为聚糖重构。 聚糖重构主要受两类酶的催化作用,糖基转移酶和糖苷水解酶,它们的作用分别为生成和降解糖苷键。由于细胞的糖基化程度通常与疾病,尤其是肿瘤,密切相关,因此糖基转移酶和糖苷水解酶作为潜在的药物靶点和肿瘤诊断标志物引起了研究人员的极大兴趣。 唾液酸化是糖基化中一个备受关注的分支,可以在附着于蛋白质或脂的聚糖链末端位置引入唾液酸(N-乙酰神经氨酸),肿瘤细胞中唾液酸的表达普遍是异常的。糖缀合物上唾液酸的表达主要受唾液酸转移酶和唾液酸酶的活性的影响。 然而在大多数情况下,肿瘤细胞中唾液酸化异常改变的机理,唾液酸化相关酶的活性与唾液酸化聚糖的表达之间的相互关系仍然未知。为了阐明唾液酸化相关酶的生物学和病理学功能以及使其作为疾病诊断和治疗的工具,发展检测唾液酸转移酶和唾液酸酶活性的新方法已成为迫切需求。 因此,本工作将化学生物学,细胞学和分子生物学等进行交叉结合,并利用荧光显微技术,纳米材料等,设计发展了新型分析检测方法和纳米探针,对肿瘤细胞中唾液酸转移酶,唾液酸酶的活性分别进行了原位无创检测,为研究聚糖生物合成机理、肿瘤临床诊断和药物开发提供了有力工具。具体包括以下两个部分工作:1、基于化学选择性识别的活细胞内唾液酸转移酶活性检测唾液酸化的聚糖结构是由唾液酸转移酶(Sialyltransferase,ST)催化合成的,为了阐明唾液酸转移
唾液酸测定试剂盒（NANA-醛缩酶法） 适用范围：适用于体外测定人血清中唾液酸的含量。 1.1 产品规格 1.2主要组成成分 注：校准品、质控品具有批间、赋值特异性，具体值详见靶值单。 2.1外观 2.1.1试剂盒标签标识清晰，外包装完整无破损； 2.1.2试剂1：无色或淡黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物； 2.1.3试剂2：无色或淡黄色液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；
2.1.4校准品：无色或浅黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物；2.1.5质控品：无色或浅黄色澄清液体，目测不得有任何沉淀及絮状悬浮物。2.2净含量 净含量不低于标示值。 2.3试剂空白 2.3.1空白吸光度 在主波长340nm、副波长405nm、37℃条件下, A≥0.5。 2.3.2空白吸光度变化率 在主波长340nm、副波长405nm、37℃条件下，△A/min≤0.01。 2.4线性范围 （2，200）mg/dL范围内，相关系数r≥0.990； （2，40]mg/dL范围内，绝对偏差不超过±4mg/dL； (40，200)mg/dL范围内，相对偏差不超过±10.0%。 2.5分析灵敏度 在产品说明书规定参数设定条件下，测定60.0mg/dl的样本, 吸光度变化率△A/min≥0.010。 2.6 精密度 2.6.1批内重复性 CV≤10.0%。 2.6.2 批间差 相对极差R≤10.0%。 2.7 准确度 与已上市产品比对：（2，200）mg/dL范围内，相关系数r≥0.990；（2，40]mg/dL范围内，绝对偏差不超过±4mg/dL；(40，200)mg/dL范围内，相对偏差不超过±10.0%。 2.8 校准品 2.8.1 均一性CV≤5.0%。 2.8.2 开瓶稳定性：开瓶后3天，相对偏差不超过±10.0%。 2.9 质控品
1. 以锌为例，说明金属离子在金属酶中所起的两种以上作用。 锌离子作为催化中心 以人的碳酸酐酶B为例。人碳酸酐酶B负责催化CO2的可逆水合，含有一个Zn2+，由His93、His95、His117侧链咪唑环的N配位结合。Zn2+的第四个配位位点催化位点，通常由水分子或含羧基离子结合，在发挥催化功能时，配位的水发生电离，带负电的氧进攻CO2的C，进而发生后续的反应。需要说明的是利用X射线分析脱锌碳酸酐酶，发现其结构与正常碳酸酐酶相同，但完全丧失了催化活性，说明锌离子只有催化中心的功能。 锌离子对蛋白结构的稳定作用 以非洲爪蟾的TFⅢA蛋白为例。该蛋白是一个转录因子，调控非洲爪蟾的5S RNA转录。该蛋白靠近N端处有9个连续的具有一定保守性的序列，每个序列都能通过其中的两个Cys 和两个His结合Zn2+。天然的TFⅢA蛋白能够特异地识别并结合一段45bp的DNA序列，并保护其不受核酸酶降解，如果使用螯合剂去除其中的Zn2+，则这种特异地结合将会消失，外加Zn2+可以恢复特异性。CD谱也证明没有Zn2+存在时蛋白缺乏完整性，加入Zn2+后CD谱的变化说明蛋白结构得以重建。 锌离子对酶活性的调节作用 以亮氨酸氨基肽酶为例。亮氨酸氨基肽酶从N端开始水解肽链，当N端为亮氨酸时具有最大的活性。在亮氨酸氨基肽酶中有两个锌离子，向正常的酶中加入过量Mg2+和Mn2+，可以提高酶活，而向脱锌氨基肽酶中加入Mg2+和Mn2+则不能恢复酶活。这说明两个锌离子有不同功能：对活性有无其决定作用的锌离子不易被交换；而对活性起调节作用的锌离子容易与其他离子交换，改变酶活。有研究证明两个锌离子在底物结合及催化过程中有不同功能。 2. 顺铂的吸收过称和抗癌机理 以二氯二氨合铂为例。顺铂通过静脉注射进入人体，在血浆中以两种形式存在：一类是其本身和水解产物；另一类是与蛋白质结合的形式。在水溶液中，顺铂中的氯离子可以和水分子进行交换，这一过程由溶液的pH和氯离子浓度决定。包括血浆在内的细胞外液中氯离子浓度高，大部分顺铂为原始形态。不带电的顺铂原形和部分水解物具有合适的油水分配系数，能够容易的穿透细胞膜，或者通过与蛋白结合进入细胞。进入细胞的顺铂在低氯离子浓度下水解，产物主要为[PtCl(OH)(NH3)2]、[Pt(OH)2(NH3)2] 、[Pt (OH)(H2O)(NH3)2]+。 顺铂的主要靶分子是DNA。液相的顺铂与DNA反应会形成很多加合物，最主要的形式是和鸟苷及腺苷的加合。鸟苷是顺铂的首选结合分子，X射线晶体分析证明配位原子是鸟苷的N7，进入细胞的顺铂的一个配体首先被鸟苷的N7取代。腺苷由于结构与鸟苷类似，配位原子也是N7。而利用寡聚核苷酸与顺铂作用发现，顺铂倾向于与同一条核苷酸单链上相邻的两个鸟苷结合，配位原子都是N7，顺铂两个氨配体上的氢则和鸟苷的O6及单链5’端的磷脂基团形成氢键，这种链内加合会导致DNA的扭曲。另有研究发现，在pH中性溶液中，鸟苷的N1由于受配位顺铂的影响可能脱去质子然后与另一顺铂配位，形成链内的N1、N7交联，阻碍GC间的氢键。 3. 以血红蛋白、Cyto C和过氧化氢酶为例说明辅基在不同蛋白中的功能。 血红蛋白 血红蛋白中的血红素的作用是可逆地结合氧分子。由于游离的血红素容易被水和氧氧化为高铁血红素，失去载氧能力，因此血红素被放置在血红蛋白的一个疏水区以防止铁的氧化。血红蛋白中的铁离子在未结合氧分子时处于高自旋态，在结合氧分子后变成低自旋态拥有较小的半径，能更深地嵌入卟啉环平面，拉动与之相连的His，引发蛋白质亚基的变构，最后促进其他卟啉环与氧分子的结合。
附件6 唾液酸检测试剂盒（酶法） 注册技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对唾液酸检测试剂盒（酶法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对唾液酸检测试剂盒（酶法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 唾液酸检测试剂盒（酶法）是指基于分光光度法原理，利用全自动生化分析仪、半自动生化分析仪或分光光度计，对人血清、血浆或其他体液中的唾液酸含量进行体外定量分析的试剂。 依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监
督管理总局令第5号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管…2013?242号），唾液酸检测试剂盒（酶法）管理类别为Ⅱ类，分类代号为6840。 目前唾液酸(SA)含量的测定方法主要有比色法和酶法两种方法。比色法是一种直接测定方法，如间苯二酚法、Ehrlich 法、色氨酸、过氧化氢法、氢氯酸和硫乙酸法等；酶法是一种间接测定方法，国内常规检测为酶偶联速率法，一种是利用丙酮酸氧化酶的比色法，另一种是利用乳酸脱氢酶的紫外分光光度法。 详情如下： 1.丙酮酸氧化酶法 原理：血清中的SA受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NANA-醛缩酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺；其中丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成H2O2，借助于Trinder反应，在POD 作用下生成有色醌，引起540nm波长下吸光度的上升。通过测定其540nm波长下的吸光度变化，与经过同样处理的校准品比较，即可计算出样品中SA的含量。 2.乳酸脱氢酶比色法 原理：血清中的SA受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神经氨酸，进而在N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NANA-醛缩酶）的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺；其中丙酮酸与NADH在乳酸脱氢酶（LDH）作用下生成乳酸和NAD+，引起340nm波长下吸光度的下降。通过测定340nm波长下的吸光度变化，与经过同样处理的校准品比较，即可计算出样
唾液酸测定试剂盒（酶法）说明书 【产品名称】 通用名称：唾液酸测定试剂盒（酶法） 英文名称：SA Determination Kit 【包装规格】试剂1/试剂2： 99ml×6/99ml×2、 99ml×4/66ml×2、 99ml×3/99ml×1、 99ml×2/66ml×1、 99ml×1/33ml×1、 84ml×6/84ml×2、 84ml×4/56ml×2、 84ml×3/84ml×1、 84ml×2/56ml×1、 84ml×1/28ml×1、 60ml×6/20ml×6、 60ml×5/20ml×5、 60ml×4/20ml×4、 60ml×3/20ml×3、 60ml×2/20ml×2、 60ml×1/20ml×1、 48ml×6/16ml×6、 48ml×5/16ml×5、 48ml×4/16ml×4、 48ml×3/16ml×3、 48ml×2/16ml×2、 48ml×1/16ml×1、 45ml×8/20ml×6、 45ml×6/18ml×5、 45ml×4/20ml×3、 45ml×2/15ml×2、 45ml×1/15ml×1、 21ml×5/7ml×5、 21ml×4/ 7ml×4、 21ml×3/7ml×3、 21ml×2/7ml×2、 21ml×1/7ml×1 【预期用途】 本试剂用于体外定量测定人血清中唾液酸的含量，临床上可作为一种非特异性炎症指标之一。 【检验原理】 神经氨酸苷酶 唾液酸（结合型） N-乙酰神经氨酸 NANA-醛缩酶 N-乙酰神经氨酸 N-乙酰甘露糖胺 + 丙酮酸 LDH 丙酮酸+ NADH + H + 乳酸 + NAD + 样本中的唾液酸（SA ）受神经氨酸苷酶的作用，形成N-乙酰神 经氨酸，进而在NANA-醛缩酶的作用生成丙酮酸和N-乙酰甘露 糖胺，丙酮酸在NADH 存在下有LDH 作用下生成乳酸和NAD +， 测定NADH 吸光度下降的速度可求得样本中的唾液酸的浓度。 【主要组成成分】 试剂1 Tris-HCl 100mmol/L pH 7.0、 神经氨酸苷酶 0.2KU/L 、 乳酸脱氢酶（LDH ） 2KU/L 试剂2 烟酰腺嘌呤二核苷酸（NADH ） 0.13mmol/L 、 N-乙酰神经氨酸醛缩酶（NANA-醛缩酶）2KU/L 【储存条件及有效期】 1.试剂在2~8℃密封避光保存，有效期12个月。 2.已开瓶试剂注意避免污染，2~8℃可稳定15天。 【适用仪器】 本产品适用于所有开放式的半自动或全自动生化分析仪。 【样本要求】 新鲜血清样本：用真空采血管静脉采血，采集后尽快（2h 内） 分离，避免溶血，送检应及时并注意密封；22℃保存不超过8h ， 如不能完成应转入2~8℃冰箱保存，在48h 内不能完成或者需贮 存48h 以上，应于-20℃保存；保持密封，避免反复冻融。 【检验方法】 酶法。 【操作步骤】 【计算】 样本浓度= 样本△A/min × 校准品浓度 校准△A/min 【参考区间】 45.6mg/dl ～75.4 mg/dl 各实验室应根据地区及人群情况建立自己的正常参考范围。 【检验结果的解释】 人体SA 主要来源为葡萄糖代谢的中间产物。在一些炎症，发热等情况SA 也会升高。专业人员负责检验结果的审核，检验结果的分析，受年龄、性别、饮食、地域影响，通常在参考范围内认为正常，如超出范围，应重新测定进行确认，检验结果如出现与临床不符甚至相悖的情况，应分析查找原因。 【检验方法的局限性】 若样本中：胆红素≤50mg/dl 、血红蛋白≤500 mg/dl 、抗坏血酸≤100 mg/dl ，对测定结果无明显影响。 【产品性能指标】 1.外观：试剂1为无色澄清液体，试剂2为无色澄清液体。 2.试剂空白 a)试剂空白吸光度：在340nm 波长下测得的试剂空白吸光度 （A ）≥1.0000（1cm ；340nm ；37℃）； b)空白吸光度变化率：在波长340nm ，1cm 光径下，空白吸光度变化率（△A/min ）≤0.2000。 3.分析灵敏度：当样本浓度为60mg/dl 时，试剂与样本反应产生 的每分钟吸光度变化率≥0.0020。 4.线性范围：在0mg/dl ～200 mg/dl 范围内，线性相关系数r ≥0.990；在42mg/dl ～200 mg/dl 范围内的相对偏差≤15%；测定浓度小于42 mg/dl 时，绝对偏差≤3mg/dl 。 5.测量精密度 a)重复性：批内变异系数（CV ）≤10%； b)批间差：不同批号之间测定结果的相对极差（R ）≤10%。 6.准确度：使用质控品测试相对偏差应不超过±10%。 【注意事项】 1.试剂与样本量可按生化分析仪器要求恒比例增减。 2.仪器内无所需波长滤光片，选择波长接近的滤光片数值输入。 3.避免试剂接触皮肤、眼睛及粘膜，一旦接触，应立即用水冲洗 污染部位，必要时在医生的指导下做进一步处理。 4.试剂反应后所产生的废液及使用后难降解的包装材料应集中 收集后交当地废物处理站处理。 5.试剂中含叠氮钠（NaN 3），废瓶、废液应按有关规定销毁处理。 6.在检测的过程中，请不要混合或者交换使用批号不同的试剂，换用不同批号的试剂时，必须重新定标。 【参考文献】 1.Sugahara,K.,et al,Enzymatic assay of serum sialic acid.Clin. Chim. Acta, 108, 493-498 (1980). 2.Kolisis,F.N.An immobilized bienzyme system for assay of sialic acid.Biotechnol.Appl.Biochem,8,148-152 (1986). 3.WS/T225-2002，临床化学检验血液标本的收集与处理[S].中华 人民共和国卫生部，2002-07-01. 4.陶月仙.临床标本的正确采集[A].第三届全国临床检验实验室 管理学术会议[C].2005. 【基本信息】 生产企业名称/售后服务单位名称： 永和阳光（湖南）生物科技有限公司 住 所：长沙国家生物产业基地康天路 邮 编：410329 生产地址：长沙国家生物产业基地康天路 电 话：86-731-83285463 传 真：86-731-83285465 技术服务：400 077 3639 生产许可证编号：湘食药监械生产许（2012）第A128号（更） 【医疗器械注册证编号】 【产品技术要求编号】 【说明书核准日期及修改日期】 样本量 sample volume μl 7 试剂1（R1） Reagent 1 μl 210 混匀，在37℃孵育300秒。 试剂2（R2） Reagent 2 μl 70 混匀，37℃下孵育90秒，连续监测90秒吸光度变化速率。 主波长 main wavelength nm 340 副波长 sub wavelength nm 405 反应类型 reaction type 速率法 反应方向 reaction direction 降反应 (-) 定标模式 Calibration mode 线性
神经氨酸酶检测试剂盒 产品编号产品名称包装 P0306 神经氨酸酶检测试剂盒 100次 产品简介： ?神经氨酸酶检测试剂盒(Neuraminidase Assay Kit)是一个用荧光法快速高灵敏度检测神经氨酸酶酶活性的试剂盒。?本试剂盒可以检测来源于不同生物的神经氨酸酶的酶活力，包括禽流感病毒的神经氨酸酶的酶活力。 ?试剂盒中提供了纯化的神经氨酸酶作为阳性对照，便于检测体系的建立。 ?试剂盒中提供了可以被神经氨酸酶催化产生荧光的底物，该底物被神经氨酸酶催化后可以产生较强的荧光，从而实现了对神经氨酸酶的快速高灵敏检测。 ?一个包装的本试剂盒可以检测100个样品或标准品。 包装清单： 产品编号产品名称包装 P0306-1 神经氨酸酶检测缓冲液 10ml P0306-2 神经氨酸酶50μl P0306-3 神经氨酸酶荧光底物1ml P0306-4 Milli-Q水 1.2ml — 说明书1份 保存条件： -20℃保存，半年有效。 注意事项： ?相同体积的情况下，样品中神经氨酸酶的酶活力不宜高过试剂盒中所提供的标准品的酶活力。单位体积内酶活力过高会导致荧光底物相对不足，使测定出来的酶活力低于实际的酶活力。如果样品中酶活力过高，可以适当稀释后再进行测定。 ?神经氨酸酶和神经氨酸酶荧光底物尽量避免反复冻融。 ?试剂盒中所用溶液溶解后4℃保存，两天有效。如果两天内不能全部用完，建议尽早把留作以后使用的神经氨酸酶和神经氨酸酶荧光底物适当分装后-70℃保存，-20℃冻存也可，但有效期会较短。其余试剂直接-20℃或-70℃保存即可。 ?需使用荧光酶标仪，并需自备专门用于荧光酶标仪荧光检测的96孔荧光酶标板。或使用可以检测小体积样品的荧光分光光度计。使用荧光分光光度计时参考荧光酶标板的操作方法。 ?由于荧光检测非常灵敏，测定出来的荧光强度有时容易产生波动。一方面要避免灰尘等掉入检测孔中产生荧光干扰，另一方面所有检测最好在同一块检测板上做双份平行检测甚至三份平行检测。 ?为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1.阳性和阴性对照检测的准备(参考表1)： a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70微升神经氨酸酶检测缓冲液。 b.每孔再分别加入10或0微升神经氨酸酶。 c.每孔再加入10微升溶解神经氨酸酶的溶液。例如神经氨酸酶在RIPA溶液中，则加10微升RIPA溶液。 d.每孔再加入0或10微升Milli-Q水使每孔总体积为90微升。 2.样品检测的准备(参考表1)： a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70微升神经氨酸酶检测缓冲液。 b.每孔再加入10微升神经氨酸酶样品。 c.每孔再加入10微升Milli-Q水使每孔总体积为90微升。 3. 检测(参考表1)： a.振动混匀约1分钟。 b.每孔加入10微升神经氨酸酶荧光底物。 c.再振动混匀约1分钟。
超高效液相色谱-串联质谱法测定燕窝中 唾液酸的含量 侯向昶1，朱丽萍1，刘春生1，王斌1，王莉1，韩婉清1，赖富饶2，柯振华1 (1.广州市质量监督检测研究院，广东广州 510110)(2.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640) 摘要：本研究建立了燕窝中唾液酸含量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法。经磷酸水解后，燕窝中的唾液 酸从与唾液酸糖蛋白的结合状态中游离出来，吸取上清液过Oasis HLB柱，用水淋洗固相萃取柱并弃去全部流出液，用真空泵在40～ 60 kPa负压下抽干Oasis HLB固相萃取柱，再用甲醇洗脱被测物，洗脱液40 ℃水浴中氮气吹干，用流动相溶液定容，采用负离子模 式和多反应监测模式超高效液相色谱-串联质谱法检测。方法的线性范围在0.1~50 mg/L之间，相关系数0.999，检出限为0.02 mg/kg，定量限为0.1 mg/kg，样品平均加标回收率为93.5%，相对标准偏差1.52%。该方法前处理简单、重复性好、灵敏度高，可应用于燕窝 中唾液酸含量的测定。 关键词：燕窝；唾液酸(N-乙酰神经氨酸)；超高效液相色谱-串联质谱；测定 文章篇号：1673-9078(2013)7-1706-1709 Determination of Sialic Acid in Edible Bird’s Nest Using UPLC-MS/MS HOU Xiang-Chang1, ZHU Li-Ping1, LIU Chun-Sheng1, W ANG Bin1, W ANG Li1, HAN Wan-Qing1, LAI Fu-Rao2, KE Zhen-Hua1 (1.Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou Guangdong 510110, China) (2.College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract:A simple and sensitive UPLC-MS/MS method was developed and validated for the quantification of sialic acid (N-Acetyl neuraminic acid) in edible bird’s nest. After acid hydrolysis, sialic acid in edible bird’s nest was released from the combination state of glycoprotein sialic acid. The supernate was further cleaned up using Oasis HLB SPE, followed by washed with water. The Oasis HLB SPE was drained by vacuum pump at 40~60 kPa prior to be eluted by methanol. The eluate was concentrated by nitrogen at 40 ℃ water bath, and then settled to permit by mobile phase. UPLC-MS/MS in negative-ion and multiple reaction monitor mode was used to detect the sialic acid. V alidation results indicated that the limit of detection was 0.02 mg/kg and the limit of quantificat ion was 0.1 mg/kg. The assay showed a linear range of 0.1-50 mg/L and gave a correlation coefficient (r) of 0.999. The average recovery was 93.5% with relative standard deviations (RSD) of 1.52% (n=6). The method showed good reproducibility and high sensitivity, suitable for analysis of sialic acid in edible bird’s nest. Key words: e dible bird’s nest; sialic acid (N-Acetyl neuraminic acid); UPLC-MS/MS; determination 燕窝是雨燕科动物金丝燕及同属多种金丝燕用唾液和少量羽毛混合黏结所筑成的巢窝，含有丰富的蛋白质、糖类和矿物质，其特征成份是唾液酸糖蛋白[1]。燕窝价格昂贵，一些不法商人利用掺假燕窝及其制品牟取暴利。目前燕窝品质的鉴别研究多采用经验鉴别、显微鉴别及理化鉴别方法。随着市场上燕窝商品来源的日趋复杂以及燕窝深加工产品的出现，仅凭物理特征已难以达到鉴别目的，为了保护消费者利益，维护市场秩序，需要开发更为科学有效的方法鉴别燕窝品收稿日期：2013-06-27 基金项目：广州市科研条件建设项目（[2011]233-34）；广州市科技计划项目（11C13190775）；广州市质量技术监督局科技计划项目（2012kj05） 作者简介：侯向昶（1971-），男，高级工程师，从事产品质量检验工作质。 唾液酸（sialic acid，SA，见图1）是一族神经氨酸（neuraminic acid）的衍生物，是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分，广泛存在于脊椎动物、哺乳动物及多种植物组织中。由于在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸，所以通常将N-乙酰神经氨酸称为唾液酸[2]。研究表明，唾液酸是一种天然的大脑营养素，它能增强婴儿的记忆力和促进智力的发育[3]。现有研究结果综合表明[2,4]，不同来源的燕窝中唾液酸含量范围基本一致，可将唾液酸含量7.0~11.0%作为燕窝初级产品质量初步鉴别的指标。猪皮、银耳、动物骨胶、琼脂、淀粉、海洋藻类植物成分及鱼鳔等物质常用于燕窝掺假，或在劣质燕窝表面 1706