全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的 技术路线 该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下： 1、样品准备： a) 提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品； 2、样品制备（见图1-1）： a) 类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp 的特异性片段，用来标记该基因，称为TAG； b) 在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物； 3、上机测序： a) 通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列； 4、基本信息分析： a) 对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列； b) 通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量； c) 对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系； d) 基因在正义链和反义链上表达量间的关系； e) 其它统计分析； 5、高级信息分析： a) 基因在样品间差异表达分析； b) 库容量饱和度分析；
c) 其它分析； 测序优势 利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下： 1．数字化信号：直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。 2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。 3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。 4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。 5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300 万~600万个表达标签。
利用实时定量PCR和2－△△CT法分析基因相对表达量METHODS 25, 402–408 (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT Method Kenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen?,1 *Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ? Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534 摘要： 现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量实时PCR Taqman 反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。 用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT 公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin
1.题目：拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境 适应的初期反应 2.背景知识：对由土壤水分亏缺引起的干旱，植物会表现出一系列的抗旱机 制，进一步把这些抵抗行为分为干旱逃避和耐干旱两种。 干旱逃避是植物整个生长发育过程不与干旱相遇逃避干旱危害，即在干旱来临前完成生命周期的能力；或植物具有防御干旱的能力，以抵御干旱对植物的有害影响，使植物在干旱下仍能维持正常的生理状态（逆境排外）。 耐干旱是在植物组织低水势下抵抗水分亏缺的能力，植物可以通过代谢反应阻止、降低或修复由逆境造成的损伤，使其在逆境下仍保持正常的生理活动。3.用来检验植物的耐受性和抗性反应的干旱处理方法有很多种： 累积干旱（pDr）即水分被抑制一段时间直到可以观察到萎焉症.这种干旱处理方法通常用来确定存活率或检测基因表达的变化。 然而，累积干旱（pDr）处理的一个缺点是，由于土壤水分湿度不能控制，它不能用来比较不同生长特性下不同基因型的行为功能。为了模拟田间条件和量化干旱反应，可以利用以下方法： 可控制的干旱处理，就是使植物处于土壤水分亏缺的恒定水平，对植物非致死干旱反应的基因型和生态型进行评估。 4.材料与方法 1.生长条件和干旱处理 将拟南芥生态型（哥伦比亚）种子播于湿润的泥炭团中，分层的在4℃放置2天，然后转移至22℃10小时光照(100 μmole m-2 s-1)的培养室里。 实验的最开始，对做干旱处理的泥炭团在播种之前进行称重以确定泥炭团里的水分含量。 可控制的中等干旱条件(mDr)是给植物田间持水量的30%，即200%或每克 干土壤含2克水。 5.为了做到这点，制作了一个半自动的系统：一个天平连接在计算机上利用软件来操作，软件使输入的重量直接进入Excel系统，Excel软件运用一系列的方程计算每个称量的泥炭团中的含水量，最终需水量，所需加水量。每天都需要对泥炭团进行称量，通过计算补充水分，使其维持在田间蓄水量的30%即mDr水平。 本实验分为三组：第一组播种后（DAS）25天进行上述处理，第二组播种30天后处理，第三组播种35天后处理。同时三组植物分别表现为：8片叶子10 片叶子、12片叶子。 6.对累积水分亏缺（pDr）处理，植物也是在上述培养室中培养，播种后35天 不给于水分，泥炭团保持干燥，通过称量泥炭团的重量使其达到所需要的累积水分亏缺水平（pDr）。在这项研究中进行两个水平上的测定：萎焉水平和萎焉前一天（萎焉前水平）. 7. 2.植物生长期生长率的测定
基因表达谱测序 背景介绍 基因表达谱分析利用HiSeq 2000高通量测序平台对mRNA进行测序，获得10M读长为49nt的原始reads，每一个reads可以对应到相应的转录本，从而研究基因的表达差异情况。与转录组测序相比，基因表达谱分析要求的读长更短，测序通量更小，仅可用于基因表达差异的研究。该方法具有定量准、可重复性高、检测阈值宽、成本低等特点，能很好的替代以往的数字化表达谱分析。 技术路线
生物信息学分析 送样要求 样品要求 1. 所需Total RNA 的量均不少于 20μg/文库，Total RNA 可以保存在DEPC 处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。 2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g ； 3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g ； 4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞； 5. 如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml 的样品。 我们强烈建议在送样的同时客户做好备份，以备后续实验之用。 样品纯度要求 1. OD 260/OD 280在1.8- 2.0之间，RNA 无降解、28S 和18S 核糖体RNA 条带非常亮且清晰（其
大小决定于用于抽提RNA的物种类型），28S的密度大约是18S的2倍；Agilent 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8。 2. 无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理。 请提供至少一种样品的凝胶电泳或者Agilent 2100检测仪检测图片，并注明其浓度、体积、OD260/OD280、溶剂名称、制备时间、物种来源以及特别备注。最终以我方定量、质检为准。 样品采集 为了保证提取RNA的完整性，确保后续实验的顺利进行，请务必确保样品的新鲜，对于如何确保样品的新鲜针对不同的样品获取材料的方法如下： 1. 动物组织：从活体上迅速的取下组织（切成黄豆粒大小的块状），每切成一个黄豆粒大小的块状立即放入液氮中，重复上述操作，直至足够提取总RNA的量；准备一个50ml的离心管，做相应的标记（样品名称、编号、客户姓名、时间），最好既在管盖上做好标记，也在管壁上做好相应的标记，先放入液氮中预冷2-3min，拿出离心管（离心管的下部分还是保持在液氮中），打开离心管的盖子，将液氮中黄豆粒大小的块状收集进离心管中。 2. 植物组织： （1）如所采集的是果实、麦穗等体积偏大的样品，收集样品请参照1.动物组织取样方法；（2）如采集的是叶片等体积偏小的样品，请尽量采集嫩叶、幼芽等，每采集一片叶片立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量，后续操作请参照动物组织的采集。 （3）如是植物的花，在采集花骨朵的时候请尽量不要采集到花萼、叶片等，每采集一个花骨朵请立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量；后续操作请参照动物组织的采集。3. 如提供实验材料为菌丝体，请取500μl的菌液于1.5ml离心管中，离心去上清，剩余菌丝体放入液氮或干冰中，请提供不少于5管的菌丝体。 样品运输 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。请填写完整订单，放入自封袋中与样品一起邮寄。为防止RNA的降解，请确保干冰的量足够运送到目的地。我们强烈建议在寄送RNA样品时将RNA保存在75%的乙醇或异丙醇中。 如是特殊样品，关于送样量和保存问题请与我们联系沟通，以便双方共同协商解决。 提供结果 根据客户需求，提供不同深度的信息分析结果。
第24章 基因表达谱分析的生物信息学方法 思考与练习参考答案 1．据教材表24–3提供的数据信息可以构建一棵决策树，请利用最大信息增益方法写出如何选出根结点中用于分割的特征。 教材表24-3 天气情况与是否去打球的关系数据集 注：该信息表示根据天气情况决定是否出去打球，数据集共包含14个样本，两个类别信息（Yes 、No ），每个样本包含3 个特征信息（Outlook 、Temp 、Windy ）。 解：计算用每一个特征进行分割时所获取的信息增益，取信息增益最大的那个特征作为分割特征，以Outlook 特征为例计算（参照练习图24-1） 练习图24-1 同Outlook 特征进行分割所获得的信息增益 )14 9 log 149145 log 145()(220+-=S H
)5 2 log 5253 log 53()(2211+-=S H 0)4 4 log 44()(212=-=S H )52 log 5253 log 53()(2213+-=S H )(14 5 )(144)(145)(1312111S H S H S H S H ++= infor-gain （Outlook ）=)()(10S H S H - 同理，计算其他两个特征的信息增益，最后从三个值中选取最大的一个对应的特征作为根结点的分割特征。 2．请从https://www.doczj.com/doc/541608742.html,/上下载一原始未经标准化的表达谱数据，并对该数据进行如下分析： （1）对数据进行标准化处理。 （2）对数据进行分类分析。 （3）分别对基因和样本进行聚类分析。 （4）选择特征基因。 （答案略）
基因表达谱芯片的数据分析(2012-03-13 15:25:58)转载▼ 标签：杂谈分类：生物信息 摘要 基因芯片数据分析的目的就是从看似杂乱无序的数据中找出它固有的规律, 本文根据数据分析的目的, 从差异基因表达分析、聚类分析、判别分析以及其它分析等角度对芯片数据分析进行综述, 并对每一种方法的优缺点进行评述, 为正确选用基因芯片数据分析方法提供参考. 关键词: 基因芯片; 数据分析; 差异基因表达; 聚类分析; 判别分析 吴斌, 沈自尹. 基因表达谱芯片的数据分析. 世界华人消化杂志2006;14(1):68-74 https://www.doczj.com/doc/541608742.html,/1009-3079/14/68.asp 0 引言 基因芯片数据分析就是对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取的杂交点荧光强度信号进行的定量分析, 通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类, 最终整合杂交点的生物学信息, 发现基因的表达谱与功能可能存在的联系. 然而每次实验都产生海量数据, 如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息, 将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来, 阐释生命特征和规律以及基因的功能, 是生物信息学研究的重要课题[1]. 基因芯片的数据分析方法从机器学习的角度可分为监督分析和非监督分析, 假如分类还没有形成, 非监督分析和聚类方法是恰当的分析方法; 假如分类已经存在, 则监督分析和判别方法就比非监督分析和聚类方法更有效率。根据研究目的的不同[2,3], 我们对基因芯片数据分析方法分类如下: (1)差异基因表达分析: 基因芯片可用于监测基因在不同组织样品中的表达差异, 例如在正常细胞和肿瘤细胞中; (2)聚类分析: 分析基因或样本之间的相互关系, 使用的统计方法主要是聚类分析; (3)判别分析: 以某些在不同样品中表达差异显著的基因作为模版, 通过判别分析就可建立有效的疾病诊断方法. 1 差异基因表达分析(difference expression, DE) 对于使用参照实验设计进行的重复实验, 可以对2样本的基因表达数据进行差异基因表达分
自噬现象的观测 高玲1,2*，张卫娜2,4*，陈文利2,3 1.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109； 2.华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室，广州510631； 3.华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631； 4.广东省农业科学院，广州510640 收稿日期：2011-03-23；接受日期：2011-04-29 基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0829)，广东省科技攻关项目(2007A020300008-6)， 华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室开放课题基金项目 通讯作者：陈文利，电话：(020)85211436-8512，E-mail ：chenwl@https://www.doczj.com/doc/541608742.html, *并列第一作者 摘要：镉离子(Cd 2+)具有强植物毒性，可抑制植物生长，甚至导致植物死亡。为了研究重金属镉 对拟南芥的毒害作用，采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定量RT-PCR 技术，检测光合参数的变化、活性氧(reactive oxygen species ，ROS)的累积、自噬的发生，以及 病原相关蛋白（pathogenesis-related protein ，PR ）基因表达的变化。实验结果显示，随着 50μmol/L CdCl 2处理时间的延长，ROS 和Cd 2+在细胞中大量积累。而在镉胁迫的初期，会观察 到自噬的发生及PR 基因表达的变化。说明植物受到外界Cd 2+作用的初期，会通过自噬及增强 PR 基因表达来抵抗外界胁迫。但随着处理时间的延长，植物细胞内累积了大量的ROS 和Cd 2+， 当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时，就会导致生长受阻，最终对光合系统造成损伤。 关键词：镉；活性氧；自噬；叶绿素荧光；流式细胞技术 中图分类号：Q945，Q947 DOI ：10.3724/SP.J.1260.2011.00676 引言 近年来，工业、矿业生产中产生的大量重金属被释放到环境中，镉(Cd )即是其中之 一。大量研究表明，镉是环境中的主要重金属污染源，是对植物毒性最强的元素之一。镉 毒害同其它逆境一样，主要伤害机制之一是影响植物体内活性氧(reactive oxygen species ， ROS )和自由基的代谢平衡，引起ROS 和自由基的积累，产生膜脂过氧化作用，导致植物 的中毒甚至死亡[1]。植物体内的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD )和过氧化氧 酶(catalase ，CAT )等保护酶对ROS 及自由基的清除能力，是决定其逆境抗性的重要因素 之一[2]。镉胁迫成为各种生物面临的一种新挑战。植物和藻类细胞虽然可以耐受一定量的镉 胁迫[3]，但过量的镉会直接或间接地抑制植物体的生理过程，如呼吸作用、光合作用和氮代 生物物理学报2011年8月第27卷第8期:ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27No.8Aug.2011:676-686 676-686 676
论文第50卷第17期 2005年9月 拟南芥QRAP2基因的克隆、表达、DNA结合能力 及体外转录活性分析 魏刚雷娟巩威朱玉贤* (北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室, 北京 100871. *联系人, E-mail: zhuyx@https://www.doczj.com/doc/541608742.html,) 摘要通过对拟南芥ATH1基因芯片数据的分析, 从拟南芥中鉴定到一个受干旱胁迫高水平诱导的cDNA片段, 并用RACE方法获得了其全长cDNA. PCR及定量实时PCR分析表明, 该基因在经干旱、紫外线照射、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理后短时间内表达量迅速提高, 3 h后即提高到对照样品的430多倍. 通过多序列比对和系统进化分析, 我们将该基因归于DREB亚家族. 由于该基因编码蛋白含有典型的AP2/EREBP DNA结合结构域, 并在N端有一段富含谷氨酰氨残基的区域, 所以将它命名为QRAP2 (Glutamine-rich AP2). 凝胶阻滞实验结果显示, QRAP2蛋白能够特异结合DRE顺式元件序列但不能与mDRE和GCC等非相关元件结合. 酵母单杂交实验表明, QRAP2蛋白全长序列或其N端112个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域形成的融合蛋白表现出转录激活功能, 而其C端135个氨基酸与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白则没有表现出转录激活活性. 现有资料的分析表明, QRAP2是AP2/EREBP转录因子家族的新成员, 可能在干旱胁迫条件下参与激活相关下游基因的表达. 关键词QRAP2胁迫 DREB酵母单杂交 转录因子 干旱是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子. 为了适应或抵抗干旱, 植物会做出一系列适应性的反应来减轻缺水带给细胞的伤害. 近年来的研究表明, 许多基因的表达受到干旱胁迫的诱导. 这些基因的编码蛋白既包括水通道蛋白[1]、LEA蛋白[2]、蔗糖合成酶[3]等功能蛋白, 也包括蛋白激酶[4]、磷脂酰肌醇[5]、转录因子[6]等调控因子. 这些基因组成了复杂的调控网络, 并通过一系列信号转导过程, 将干旱胁迫这种非生物因子转变成对于某些或某类特定基因的诱导表达或抑制, 从而调节植物体内相关的生理生化反应, 增强植物对胁迫的耐受性[7]. 研究表明, 许多干旱或低温应答基因如kin1, cor6.6, rd17, rd29A等基因的诱导表达与其启动子区域含有的DRE元件有直接关联. DRE元件或含有DRE核心序列(CCGAC)的元件可以在植物中传递对干旱、低温已及高盐等胁迫条件的应答, 而这种应答是不依赖于植物体在受到胁迫后自身产生的ABA的作用[8~12]. rd29A(cor78/lti78)基因编码与LEA蛋白非常相似的亲水蛋白, 可以保护细胞免受水分胁迫的伤害. 该基因的启动子区域同时存在依赖ABA的ABRE元件(ABA responsive element)和不依赖ABA 的DRE元件, 实验证实该基因在干旱开始后几小时内的快速诱导表达不依赖于ABA, 而随后阶段的慢性诱导表达却是依赖于ABA的[8,9,13]. DREB是属于AP2/EREBP家族的一类转录因子, 具有保守的AP2/EREBP结构域, 能够与DRE元件特异性结合, 调控其下游基因表达[14~16]. 目前已在拟南芥中克隆了多个编码DREB类转录因子基因, 如DREB2a, DREB2b和CBF4等, 它们在干旱、低温、高盐等胁迫条件下均有很显著的诱导表达特性[17~20]. DREB2a与DREB2b在原生质体瞬时表达系统中可以特异诱导启动子区含有DRE元件基因的表达[19], 而CBF4转基因过表达拟南芥能够在正常条件下表达含有DRE元件的胁迫应答基因, 并在干旱、低温、高盐等条件下显示了更强的耐受能力[20]. 本文克隆了拟南芥中一个富含谷氨酰胺的DREB类转录因子QRAP2基因. 研究发现该基因受干旱强烈诱导表达, 它所编码的蛋白能在体外与DRE序列特异性结合并在酵母中显示了转录激活功能, 我们推测该基因在拟南芥干旱应答途径中具有重要作用. 1材料与方法 (ⅰ) 植物材料. 哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia ecotype)于全自动培养箱(Conviron公司)中培养. 培养条件为22℃, 光照
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现 1.表达谱芯片及其应用 表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。 cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计?算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。 基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。 ③不同个体的相同基因表达上的差异。利用基因芯片可以分析多个样本，同时筛选不同样本（如肿瘤组织、癌前病变和正常组织）之间差异表达的基因，这样可以避免了芯片间的变异造成的误差⑷。张辛燕⑸ 等将512个人癌基因和抑癌基因的cDNA用点样仪点在特制玻片上制成表达谱芯片，对正常人卵巢组织及卵巢癌组织基因表达的差异性进行比较研究，结果发现在卵巢癌组织中下调的基因有23个，上调的基因有15个，初步筛选出了卵巢癌相关基因。Lowe⑹等利用胰腺癌、问充质细胞癌等组织的cDNA制备基因芯片，筛选到胰腺癌细胞中高表达的基因，为医疗诊断、病理研究及新药设计 奠定基础。 2.表达谱芯片的数据处理技术
培养基上点种子： 1.种子处理 种子消毒处理 在培养基中点样前，必须对种子进行消毒，防止感菌，具体方法为：先将种子倒在干净的纸上，挑去大的杂质，再将种子倒入EP管中，加入1mL70%酒精，振荡10mi n,将种子放在超净台中吹干。 点样 将消毒处理后的种子，可以利用牙签点到培养基上，每次仅点一粒种子，根据培养皿的大小，确定一个里面能够点多少个种子，每个90mm 培养皿上大约种30 粒种子，防止植株长大后影响根与子叶的发育。 春化 种子点样完毕后，将培养基密封，置于4C冰箱里放置72h后，放回温室 1. 种种子前，要将营养土用自来水混匀后，121T灭菌30min，待土冷却后，装入种植拟南芥的方盒中，再将方盒放入红色托盘中。 2. 将要点的种子平铺在称量纸上，用牙签蘸取一粒种子点在营养土上,每点一个小盒时都用牙签做标记，以免遗种某个盒子。（每个小盒子种 5 粒种子，每个大方盒子种9 粒种子） 3. 将点了拟南芥种子的托盘置于22 C温室，并用一个干净的托盘盖在上面，大约 两天后就可以打开上面的托盘，待植物长出4片叶子时，可以根据自己的实验需 求对植物的幼苗进行取舍。 4. 植株生长条件的控制 幼苗移植后将花盆置于温室内，保证温室温度恒定在22C，空气湿度70—80%， 光照强度100—150卩mol/m2/s,每天浇两次纯净水，上午9点左右一次，下午5 点左右一次；一周浇一次营养液（1平匙溶于1L水中），营养液要灌在盆底。
浇水注意事项： 1）水不可以浇的过多或过少，用手捏起一些土能挤出水来说明就有点太湿； 2）水要浇均匀，托盘四个角的方向如果喷壶喷不到，可以用挤瓶均匀地喷一些水；3）用喷壶浇水时，喷壶的水柱不可以太大，以免把植物连根拔起； 4）当植株出现花芽时，一定要保证水分的供应，促进果实的发育。当植株结有豆荚时，可以适当的减少供水量，每两三天浇一次水便可，以利于种子的成熟。开花后的植物不能再用喷壶浇水，要从盆底灌水，但不可以一次性灌太多水； 5）在盆底灌水后，待植物吸收完水后，可以将盆底多余的水分倒出来； 6）拟南芥受到胁迫判断标准：叶柄发紫，叶片发黄，开花期提前等； 7）如果做生理实验，植物一旦受到胁迫，需要把植物丢弃，重新种植，以免实验数据不准确。 注：温室202 光照时间：9:00—19:00 为短日照，有利于营养生长 温室203 光照时间：6:00—22:00 为长日照，有利于生殖生长 5. 种子的收集和保存 6.拟南芥种子处在长角果中，当逐渐成熟时，长角果由绿变黄，最后成褐色。当长角果变黄时，可以开始单个采集长角果，但此时种子中含有较多的生长抑制剂。因而，当长角果变褐时及时采集，可得到成熟又易发芽的种子。收获的种子应立即脱粒、清洁、干燥。 种子的收集：在桌面上铺几张干净的纸，戴上手套，将要收种的植物的花序用手将种子搓揉到纸上，再将纸上的大的杂质挑去后，将种子装到信封中，密封后将装有种子的信封置于干燥环境下，在室温条件下放置2-3 周便可进行储藏。种子的贮存可根据贮存的目的不同，分为短期、中期、长期贮藏。一般短、中期贮藏是将种子贮存在4C,而长期贮藏是保持在-20C温度下。当取用长期贮藏的种子前，先将贮存种子的容器预热到室温，或者将其置于37 C水浴10min，以尽量使冰害降至最低。
基因表达谱聚类分析 [ 文章来源：| 文章作者：| 发布时间：2006-12-21| 字体：[大中小] 学习过程可以采用从全局到局部的策略。采取这种策略时，学习初期可设定较大的交互作用半径R ，随着学习过程的不断推进，逐步减小R ，直至不考虑对邻近单元的影响。邻域的形状可以是正方形或者圆形。 KFM 的聚类结果与K 均值相似，它的优点是自动提取样本数据中的信息，同时也是一种全局的决策方法，能避免陷入局部最小，缺点在于必须实现人为设定类的数目与学习参数，而且学习时间较长。KFM 方法克服了K- 均值聚类的一些缺点：它应用类间的全局关系，能提供大数据集内相似性关系的综合看法，便于研究数据变量值的分布及发现类结构。而且，它具有更稳健更准确的特点，对噪声稳定，一般不依赖于数据分布的形状。 8.4.2.5 其它聚类方法 聚类方法是数据挖掘中的基本方法，数据挖掘的方法很多，在基因表达谱的分析中，除了以上常用方法外，还有一些其它的方法。由于对聚类结果尚没有一种有效的方法进行评价，尤其是对聚类结果的进一步生物学知识发现尚没有新的分析思路和成功应用，因此，科学家们在不断地研究一些新方法。这些方法有不同的原理，能够提取不同数据特征，有可能对具体的数据得到更有意义的结果，发现更多的生物学知识。这里，简单介绍这些方法的原理，更详细的介绍请参看相关文献。 (1)模糊聚类分析方法:这是一种模拟人类的思维方法，通过隶属度函数来反映某一对象属于某一类的程度。基本思路是计算两两基因表达谱之间的相似性程度，构建模糊相似矩阵，利用模糊数学中的传递闭包计算方法得到模糊等价矩阵，选择不同的置信水平从模糊等价矩阵中构建动态聚类图。对于特定的置信水平，可以实现对基因表达谱的分类。该方法的优点是利用了模糊数学中的隶属度概念，能够更好的反映基因表达谱之间的相互关系，而且它是一种全局的优化方法，与向量的顺序无关。 (2)模糊C均值算法:该方法同样将模糊数学中的隶属度概念引入到常用的K 均值聚类方法中。对于K 均值算法，一个基因表达谱所属的类只有一个，因此，它与各类别的关系要么是 1 ，要么是0 ，即属于或不属于某一类。而对于模糊 C 均值法，一个基因表达谱是否属于某一类，是以隶属度来确定第i 个样本属于第j 类的可能性。最终的聚类结果取决于分析的目的，可以根据最大隶属度来确定基因表达谱的分类，即一个基因表达谱只属于一类；但往往是确定隶属度的阈值，只要大于该阈值，就可以将基因表达谱划分为该类，这样的划分结果是一个基因表达谱可以属于多个类，这也是可以被生物学家接受的。模糊 C 均值法与K 均值法的实现过程基本相同，所不同的是对于
基因表达分析 1、EST（Expressed Sequence Tag）表达序列标签（EST）分析 1、EST基本介绍 1、定义： EST是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，进行5’端或3’端进行一轮单向自动测序，获得短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到7000bp不等，平均长度为400bp。 EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此，EST也能说明该组织中各基因的表达水平。 2、技术路线： 首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo（dT）作为引物进行RT-PCR 合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST序列的产生过程。
3、EST数据的优点和缺点： （1）相对于大规模基因组测序而言，EST测序更加快速和廉价。 （2）EST数据单向测序，质量比较低，经常出现相位的偏差。 （3）EST只是基因的一部分，而且序列里有载体序列。 （4）EST数据具有冗余性。 （5）EST数据具有组织和不同时期特异性。 4、EST数据的应用 EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比，更可能穿越家系与种的限制。因此，EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用的。同样，对于一个DNA序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。具体说，EST的作用表现在：
拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应
1.题目：拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境 适应的初期反应 2.背景知识：对由土壤水分亏缺引起的干旱，植物会表现出一系列的抗旱机 制，进一步把这些抵抗行为分为干旱逃避和耐干旱两种。 干旱逃避是植物整个生长发育过程不与干旱相遇逃避干旱危害，即在干旱来临前完成生命周期的能力；或植物具有防御干旱的能力，以抵御干旱对植物的有害影响，使植物在干旱下仍能维持正常的生理状态（逆境排外）。 耐干旱是在植物组织低水势下抵抗水分亏缺的能力，植物可以通过代谢反应阻止、降低或修复由逆境造成的损伤，使其在逆境下仍保持正常的生理活动。 3.用来检验植物的耐受性和抗性反应的干旱处理方法有很多种： 累积干旱（pDr）即水分被抑制一段时间直到可以观察到萎焉症.这种干旱处理方法通常用来确定存活率或检测基因表达的变化。 然而，累积干旱（pDr）处理的一个缺点是，由于土壤水分湿度不能控制，它不能用来比较不同生长特性下不同基因型的行为功能。为了模拟田间条件和量化干旱反应，可以利用以下方法： 可控制的干旱处理，就是使植物处于土壤水分亏缺的恒定水平，对植物非致死干旱反应的基因型和生态型进行评估。 4.材料与方法 1.生长条件和干旱处理 将拟南芥生态型（哥伦比亚）种子播于湿润的泥炭团中，分层的在4℃放置2天，然后转移至22℃10小时光照(100 μmole m-2 s-1)的培养室里。 实验的最开始，对做干旱处理的泥炭团在播种之前进行称重以确定泥炭团里的水分含量。 可控制的中等干旱条件(mDr)是给植物田间持水量的30%，即200%或每克 干土壤含2克水。 5.为了做到这点，制作了一个半自动的系统：一个天平连接在计算机上利用软件来操作，软件使输入的重量直接进入Excel系统，Excel软件运用一系列的方程计算每个称量的泥炭团中的含水量，最终需水量，所需加水量。每天都需要对泥炭团进行称量，通过计算补充水分，使其维持在田间蓄水量的30%即mDr水平。 本实验分为三组：第一组播种后（DAS）25天进行上述处理，第二组播种30天后处理，第三组播种35天后处理。同时三组植物分别表现为：8片叶子10 片叶子、12片叶子。 6.对累积水分亏缺（pDr）处理，植物也是在上述培养室中培养，播种后35天不给于水分，泥炭团保持干燥，通过称量泥炭团的重量使其达到所需要的累积水分亏缺水平（pDr）。在这项研究中进行两个水平上的测定：萎焉水平和萎焉前一天（萎焉前水平）. 7.2.植物生长期生长率的测定
对于基因表达谱数据的分析是生物信息学的研究热点和难点。转化为数学问题，分析任务是从数据矩阵 M 中找出显著性结构，结构类型包括全局模型 (model) 和局部模式 (pattern) 。对基因表达谱数据的分析是数据挖掘问题，所采用的方法包括通过可视化进行探索性数据分析（ Exploratory Data Analysis ）、描述建模 (descriptive modeling) 、分类、聚类、回归和机器学习等。 基因表达谱分析所采用的常用方法是聚类，其目的就是将基因分组。从数学的角度，聚类得到的基因分组，一般是组内各成员在数学特征上彼此相似，但与其它组中的成员不同。从生物学的角度，聚类分析方法所隐含的生物学意义或基本假设是，组内基因的表达谱相似，它们可能有相似的功能。然而，产物有相同功能的编码基因（例如对其它蛋白质有磷酸化作用），不一定共享相似的转录模式。相反，有不同功能的基因可能因为巧合或随机扰动而有相似的表达谱。尽管有许多意外的情况存在，大量功能相关的基因的确在相关的一组条件下有非常相似的表达谱，特别是被共同的转录因子共调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体，或者参与相同的调控路径。因此，在具体的应用中，可以根据对相似表达谱的基因进行聚类，从而指派未知基因的功能。 聚类分析是模式识别和数据挖掘中普遍使用的一种方法，是基于数据的知识发现的有效方法，特别适用于模式分类数不知道的情况。聚类分析是一种无监督学习方法，不需要任何先验领域知识，它根据数学特征提取分类标准，对数据进行分类，这种数学特征的例子有统计平均值、相关系数、协方差矩阵的本征值及本征向量等。聚类分析在基因表达数据分析中应用得很多，主要有层次聚类、 K 均值、自组织特征映射网络等。本节将介绍基因表达数据分析中常用的聚类方法及与此相关的内容。 8.4.1 相似性度量函数 对基因表达谱进行聚类分析之前，必须首先确定反映不同基因表达谱相似程度的度量函数，根据该函数可以将相似程度高的基因分为一类。在实际计算中，还可以用距离代替相似的概念，相似性度量被转化为两个基因表达谱之间的距离。距离越小，表达模式越相近；反之，则表达模式差异大。 常见的相似性度量有距离、点积、相关系数（ correlation coefficient ）、互信息（ mutual information ）等。假设两个基因表达谱分别为X = （x 1 ,x 2 ,…,x m ）和Y = （y 1 ,y 2 ,…, y m ） , 距离函数 d( X ，Y ) 必须满足如下条件： d( X ，Y ) ≧ 0 d( X ，Y ) = d( Y ，X ) d( X ，Y ) = 0 if X = Y
叶绿体信号通过诱导抗氧化酶和花青素参与拟南芥环境胁迫 响应 唐 荷，袁 澍，朱 峰，付发琼，康 星，张 萍，王硕勋，林宏辉 【摘 要】本文研究了渗透胁迫和冷胁迫对于叶绿体信号缺失突变体gun1、gun5和abi4的影响.实验结果表明，叶绿体信号缺失突变体对胁迫的抵抗力下降，表现在植株含水量降低，电导率和丙二醛含量升高.并且发现叶绿体信号缺失突变体中抗氧化酶如POD、SOD、APX活性明显下降，活性氧（超氧离子）积累明显加重，此外叶绿体信号缺失突变体不能诱导植物体内花青素的合成.本文初步探讨了叶绿体信号与植物体内活性氧和花青素合成途径的关系，表明叶绿体信号可以通过诱导抗氧化酶和花青素从而抵抗环境胁迫. 【期刊名称】四川大学学报（自然科学版） 【年(卷),期】2014(051)006 【总页数】6 【关键词】叶绿体信号；抗氧化酶；花青素；环境胁迫 1 引 言 由于编码质体蛋白的基因分别位于细胞核和质体中，因此质体的生长发育需要对核基因和质体基因的表达进行精确的调控.叶绿体信号是由叶绿体产生的指导细胞核中有关叶绿体功能或代谢状态相关基因进行转录调控的信号.按照叶绿体信号起源来分，目前已知有五种叶绿体信号存在：包括叶绿体四吡咯合成途径中间产物调控［1，2］，叶绿体蛋白合成调控［3］，叶绿体光合电子传递链的氧化还原状态改变调控［4］、叶绿体内活性氧调控［5-7］和高浓度糖所引发的叶绿体信号［3］. 在叶绿体信号研究中，gun（genome uncoupled，细胞核基因组与叶绿体基因组间解偶联）系列突变体被广泛使用，它们都与叶绿体蛋白编码有关.跟野生型拟南芥相比，在gun系列突变体中，捕光叶绿素a/b结合蛋白（LHCB）和核酮糖二磷酸羧化酶亚小单位（RBCS）能够表达.gun1编码叶绿体三角状五肽重复蛋白（PPR）［3］，可结合叶绿体DNA.gun5编码镁离子螯合酶的H亚基［2］，与叶绿素合成有关.除草剂norflurazon（NF）可抑制类胡萝卜素合成途径中八氢番茄红素脱氢酶活性，它能够诱导叶绿体发出调节细胞核中基因表达的信号. 叶绿体能感知外界环境变化并将其反馈给细胞核，叶绿体信号所调控的基因大多是植物抗胁迫基因［1］，因此叶绿体信号在植物抵抗外界环境胁迫中应起着重要作用.之前有报道叶绿体信号缺失突变体其基本的抗高温胁迫能力下降［8］.本文通过探究当拟南芥受到外界胁迫时，在不同叶绿体信号诱导下，野生型拟南芥和叶绿体信号缺失突变体所表现出来的适应性差别，发现胁迫条件下叶绿体信号会显著诱导抗氧化酶活性和花青素的累积，从而为叶绿体信号在植物抵抗外界胁迫的原因起
第18卷第6期微阵列技术[1-3]的到来对生物学和医学来说是一场 革命，通过它可以同时观测成千上万个基因的表达水平，从而能够在基因组水平上以系统的、 全局的观念去研究生命现象及其本质。还可以根据基因在不同条件下表达的差异性来进行复杂疾病诊断、药物筛选、个性化治疗、基因功能发现、农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督及司法鉴定等，因此对基因表达谱的研究具有重要的理论价值和应用意义。微阵列基因表达数据具有维数高、样本小、非线性的特点，这对一些传统的机器学习方法提出了新的挑战，对其数据的分析已成为生物信息学研究的焦点。 1基因表达数据采集 基因表达数据采集可分为三个步骤：微阵列设计、 图像分析和数据获取、过滤、标准化。基因芯片（gene chip ），简称为微阵列,就是指固着在载体上的高密度 DNA 微点阵，具体地说就是将靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度排列在玻璃、硅等载体上。mRNA （信使核糖核酸）的表达水平的获得是通过选取来自不同状态的样本（如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织，或用药之前与用药之后组织等，一种称为实验样本，另外一种称为参考样本），在逆转录过程中,实验样本和参考样本RNA （核糖核酸）分别用不同的红、绿荧光染料去标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经适当的洗脱步骤与激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）表示该基因在实验样本中的表达水平。在通常情况下，考虑Cy5和Cy3的数值时，还应考虑相应的背景数值，如果微阵列上某个基因的Cy5或Cy3数值比相应的背景数值低，则该基因的表达水平无法确定。为了方便数据处理，常 孟令梅等：一种基于DCT 变换的图像认证算法文章编号：1005－1228（2010）06－0017－03 基因表达谱数据分析技术 刘 玲 （江苏财经职业技术学院，江苏淮安 223001） 摘 要：人类基因组计划的研究已进入后基因组时代，后基因组时代研究的焦点已经从测序转向功能研究，主要采用无监 督和有监督技术来分析基因表达谱和识别基因功能，通过基因转录调控网络分析细胞内基因之间的相互作用关系的整体表示，说明生命功能在基因表达层面的展现，对目前基因表达谱数据分析技术及它们的发展，进行了综述性的研究，分析了它们的优缺点,提出了解决问题的思路和方法，为基因表达谱的进一步研究提供了新的途径。关键词：基因表达谱；分类；无监督；有监督；基因调控网络中图分类号：Q81；TP181 文献标识码：A Gene Expression Data Analysis LIU Ling （Jiangsu Vocational College of Finance &Econimics ，huai ’an 223001,China ） Abstract ：As the work of sequencing the genome of the human has been fully finished,the post-genomic era has begun.Scientists are turning their focus toward identifying gene function from sequencing.Clustering technology,as one of the important tools of analyzing gene expression data and identifying gene function,has been used widely.Transcriptive regulatory networks are the global representation of multiple interactions between genes and their products ,which can help us understand the cell ’s function at the level of gene expression In this paper we discuss main clustering technology about gene expression data at present,analyze their advantages and disadvantages ,present the methods to solve the problems and given approaches to study gene expression data. Key words:gene expression profile ； classification ；gene regulatory network Vol．18No．6Dec 2010 第18卷第6期2010年12月 电脑与信息技术Computer and Information Technology 收稿日期： 2010-06-09项目资助： 江苏省淮安市科技发展计划项目(HAG08015）作者简介： 刘玲（1964-），山东胶州人，副教授，硕士，主要研究方向:生物信息。