乳酸菌细菌素抗菌潜力挖掘研究进展
易华西,张兰威,杜明,韩雪
(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院中法乳联合实验室,哈尔滨150001)
摘要:乳酸菌产生的主要抗菌防腐物质是有机酸,但在乳酸菌代谢产物中发现了细菌素等其它抗菌物质,其中有的细菌素甚至具有强烈的抗真菌能力。世界范围内启动的乳酸菌基因组计划创造了巨大的生物信息流。乳酸菌基因组蕴含的生物信息将对研究乳酸菌细菌素的合成代谢途径,功能基因挖掘以及新型抗菌剂的开发搭建信息平台。结合乳酸菌细菌素的最新研究进展,讨论利用乳酸菌基因组探索乳酸菌的抗菌潜力及其作为生物防腐剂在食品保藏中的应用前景。
关键词:生物防腐剂;乳酸菌;抗菌物质;细菌素
中图分类号:TS20113文献标识码:A文章编号:1006-2513(2010)01-0073-04
Recent advance on the potential anti m icrobial activity
of bacteri oci ns produced by LAB
Y I Hua-x,i ZHANG Lan-w e,i DU M i n g,HAN X ue
(S i n o-France Dairy Jo int Laboratory ofH arbin I nstitute o fTechno logy,H ar b i n150001)
Ab stract:T he m a j o r an ti m icrob i a l and biopreservative s ubstance produced by LA B i s organic ac i d;how ev er,som e LA B produce add i tiona l anti m icrobia l compounds.Among these,the bac terioc i ns have de m onstrated great potenti a l as food preservati ves.A tre m endous fl ow o f i nforma ti on has been created through various genome sequenc i ng pro jects wor l dw i de.T he i n f o r m ati on obta i ned fro m genom ics w ill prov ide anew platf o r m for i dentifi ca tion of pat hw ays for the bac-ter i oc i ns producti on,g eno m e m i n i ng and deve l op m ent of ne w anti m icrob i a l agents.Explorati on o f anti m icrob i a l po ten-tial i n LAB by geno m ics was also d i scussed i n t h is rev i ew.
K ey w ords:LAB genom e;LA B;an ti m icrob i a l compounds;bacter i oc i ns
食品防腐剂是食品添加剂的重要成员之一。随着人们对食品安全意识的提高,生物防腐剂比化学防腐剂有更广阔的发展前景。发酵食品是全球食品中不可缺少的重要组成部分。食品发酵生产的成功在很大程度上与发酵剂产生的抗菌代谢产物有关,对发酵剂的抗菌能力也有很大的贡献[1]。细菌素(B acteriocins)是这类代谢产物中的典型代表。细菌素是核糖体合成的抗菌肽,包括乳酸菌(LAB,lactic acid bacteria)在内的很多食品工业生产菌株都具有分泌细菌素的能力。与此同时,也发现并鉴定了一些不同于细菌素的抗菌物质,其中有的物质具有强烈的抗真菌能力[2]。乳酸菌是目前世界公认安全的食品级微生物,它们产生的抗菌物质也是安全的,可作为天然的食品防腐剂直接应用于食品工业,因此乳酸菌抗菌能力的挖掘和开发受到了国内外食品保鲜
收稿日期:2009-05-15
基金项目:科技部/8630资助项目(2007AA10Z354)。
作者简介:易华西(1976-):男,讲师;研究方向:乳品微生物。
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学家的极大关注[3]。以法国科学家为首启动的乳酸菌基因组计划创造了巨大的生物信息流。乳酸菌基因组为研究抗菌物质的合成代谢途径和相关功能基因奠定了基础,为全面深入研究乳酸菌的抗菌特性、抗菌机理以及抗菌潜力的挖掘搭建了信息平台。
1乳酸菌产生的细菌素
细菌素这个术语最初用于描述大肠杆菌素的抗菌蛋白类物质,现在已广泛用于定义大量核糖体合成的抗菌物质。乳酸菌产生的细菌素对病原菌和食品腐败菌具有很强的抑制能力。它们在乳酸菌代谢产物中广泛存在,具有相对固定的抗菌谱(包括L isteria,C lostridium和革兰氏阳性细菌等)。在这类物质中,分子量小、热稳定好的细菌素被公认在食品保藏最具有开发和应用前景。基于是否含有修饰性氨基酸,细菌素分为两大类:第?类包括lantibiotics,通过形成脱水氨基酸、羊毛硫氨酸和B-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸完成一系列翻译后酶学修饰;第ò类包括Ped i o c i n等小分子热稳定性好的非修饰抗菌肽[4]。
对第一类和第二类细菌素的构效关系进行了大量研究。N isin是最引人注目的lanti b iotics类细菌素,由34个氨基酸组成,其立体结构为一个羊毛硫氨酸环和四个B-甲基羊毛硫氨酸环组成的五环结构。近年来对nisin的抗菌机理进行了深入研究,并在n isin和受体L i p i dò之间的反应机理研究取得了突破性进展[5]。多位点突变分析揭示位于靠近N端的环状结构与L i p idò之间的粘附能力密切相关,而柔性较强的中部区域则影响N isi n在靶细胞的细胞膜形成孔洞[6]。关于第二类细菌素,大量工作集中于pediocin族细菌素的研究,构成了第二类细菌素的最大亚组。Pedioci n 的三维结构研究发现,其N端中部形成独特的YGNGVXCXXXXCXV氨基酸序列,C端A螺旋则与其抗菌活性密切相关[7]。有趣的是leucocin A (一种类似Pedioci n的细菌素)的抗菌活力依赖于反应的立体专一性,暗示了Pediocin类细菌素和N isi n一样也是和靶细胞的特殊受体分子反应,有研究报道验证了这个猜测[8]。
对细菌素的构效关系研究,立足于期望通过推理模拟,设计出广谱、高效的新型细菌素。尽管相关理论和技术手段不断发展更新,但很多预期目标研究进展缓慢。目前在工业应用上仍然寄希望于发现具有预期抗菌特性和靶细胞专一性的新型细菌素。
2乳酸菌细菌素的基因挖掘
根据生物多样性和进化论观点,每种乳酸菌至少产生一种细菌素,目前报道的仅仅是少数,很难全部发现和鉴定它们,但是它们的确存在[9]。现在探测新型细菌素仍然依赖功能性测定,假设筛选的微生物能够产生抑制指示菌的细菌素。这种方法的主要缺陷是菌株产生细菌素具有遗传不稳定性。对于这种不稳定性,我们一直认为是转化过程中的质粒丢失或基因失活等原因所致。但是研究发现事实并不如此简单,可能还涉及到另外一种复杂的调控机制。Lactobacill u s sakei生产sakacin A的调控机理为这个推测提供了佐证。sakac i n A的转录调控受群感效应(Quo-rum-sensi n g)所控制,而群感效应又受控于一个特殊的三组分单转换系统。这个复杂的调控系统受自身温度和其它环境因素的影响[10]。因此,如何控制最佳的细菌素生产条件是目前使用的细菌素筛选模型面临的主要障碍之一。
目前获得抗菌肽的技术手段包括人工合成肽;克隆基因体内转录、翻译,体外表达;优化生长条件来诱导生产抗菌肽等。基因组序列可能在新型高效的细菌素鉴定中扮演重要角色。随着乳酸菌基因组的解读,部分细菌素遗传位点的DNA序列已经确定,并且已经从多方面揭示了编码第一类细菌素和第二类细菌素基因的结构和性质。虽然研究发现不同细菌素的遗传位点常常具有不同的结构,但仍然具有某些普遍性的保守性结构特征[11]。联合这些保守结构和基因序列提供的生物信息,能够使细菌素基因挖掘更具有针对性。细菌素结构基因通常编码抗菌肽的前体,加工和分泌一般依赖于一个特定的转运系统。这个特定的转运系统的作用对象是一类结构相对简单的特异性前导肽,其中有一种前导肽与n isi n和其它lanti b i o tics类细菌素的合成代谢有关[12]。这种类型的前导肽能够被专一的丝氨酸蛋白酶裂解,
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与编码细菌素的其它基因联合完成转录过程。最常见的前导肽序列是双氨基乙酸,一般与少数lan ti b i o tics类细菌素以及多数第二类细菌素遗传位点相连锁。这类前导肽具有特异的作为加工位点的G l y-1-G l y-2结构特征[13]。含有双氨基乙酸前导肽的细菌素前体经过专一的转运系统完成加工和分泌,这个系统包含2个同转录基因,这2个基因编码一个ABC转运子和一种附属蛋白。ABC转运子含有特异的N-端蛋白水解域,伴随着转运子裂解前导肽[13]。第2类细菌素基因族的另外一个特征是编码细菌素的基因常常和一个同源免疫基因协同转录。该免疫基因编码的免疫蛋白由100-150个氨基酸组成,与细菌素与膜之间的粘附反应相关[7]。在基因组中,结合这些性质可能是发现新型、预期的细菌素基因的有效手段。
目前,病原乳酸菌(S trep tococcus pneum oni-ae)的基因组序列已经在Gene Bank公布。在Strep tococcus pneum oniae的基因组中,Lange等发现并鉴定了7个预期的细菌素基因(I,J,K, M,N,O,U)[14,15]。利用基因芯片转录分析发现细菌素的分泌由一个经典的三组分信号转导系统控制。依据上述特征,来源于S1pneum oni a基因组序列的细菌素已被分离鉴定[15]。以此相似,在口腔链球菌变体Strep tococcus m utans UA159的基因组中发现了7个预期细菌素基因,在Lacto-bacillus aci d ophilus ATCC700396的基因组中发现了2个细菌素基因[16]。当预期的细菌素编码基因被确定,可着手研究基因的表达和抗菌肽抗菌活力,为获得期望的理想抗菌肽奠定基础。
3乳酸菌抗菌活力研究的新观点
除了细菌素外,在乳酸菌的代谢产物中也发现并鉴定了不同于细菌素的抗菌物质,这些物质的抗菌谱具有有广谱性,其中有的甚至具有强烈的抗真菌能力[2,18]。乳酸菌还能产生具有抗菌活性的小分子物质,比如由Lactobacill u s reu teri分泌的reuterin和reutericyc lin。Reuterin是不同形式的B-羟基丙醛(B-hydroxypropionaldehyde)组成的混合物,不是象细菌素那样由氨基酸组成的多肽,不会被蛋白酶所破坏,而reutericyc li n则是一种类似抗生素的新型脂鲤酸[17]。植物乳杆菌分泌的环状二肽(L-Phe-Lpro,L-Phe-trans-4-OH-L-Pro)显示有很强的抗真菌活性[18]。M ag-nusson等近期从大约1200种乳酸菌的代谢产物中分离能够抑制导致食品腐败的酵母菌(Rhodo torula mucilagino s a,K luyvero my ces marxianus)和真菌(As-p er g illus fum i g at u s,P en icilli u m roqueforti,P enicillium co mm une)的抗菌物质,最终筛选鉴定了36种具有强烈或中等抗真菌活性的新菌株[2]。在这些菌株中,14株属于棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacill u s co r ynifor m issp1)。这些菌株的抗真菌活力不仅仅与产生的有机酸有关,更是其它抗菌物质的联合作用。有趣的是只有少数乳酸菌能产生一系列的抗真菌物质,而大部分乳酸菌没有这个特性。因此推测这些菌株可能具有其独特的代谢途径。基因组数据库和DNA芯片分析有助于揭示生物合成和代谢途径的差异(正是这两方面形成了细菌素的不同抗菌特性)。乳酸菌的这种抗真菌活力具有不稳定性,因此在适于产细菌素和不适于产细菌素的条件下,比较菌株的转录特征能够为挖掘基因组中涉及细菌素表型的基因提供重要线索。另外,乳酸菌具有相对简单的生理学特性,使得乳酸菌能形成适宜自己生存的代谢途径。因此,鉴定代谢途径对明确抗菌素分子的合成机理非常重要,为提高细菌素抗菌活力研究提供了切入点。
目前一直认为细菌素不会和抗生素那样产生抗性,但是事实似乎并非如此[11,19]。与传统抗生素一样,长期暴露于某种细菌素的微生物细胞也可能导致抗性的产生。产生抗性的机理可能是通过改变细胞膜脂质成分形成,细胞似乎天生就具有这种能力,这种能力是否是自然变异的结果还不太清楚。细菌素抗性的形成还可能与麦芽糖磷酸转移酶系统有关[19]。全球的同基因菌株(细菌素抗性或细菌素敏感)的转录特性研究可能揭开靶细胞细菌素抗性的神秘面纱。
4结论
随着基因组学的不断发展,转录组学、蛋白质组学、代谢组学中新技术的应用,全世界正在进行多种微生物基因组计划。到目前为止,128
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种细菌的基因组序列测序工作已经完成,391种细菌的基因测序工作正在进行之中[16]。食品工业相关细菌的基因组学研究已经开始。29种重要的食品工业相关细菌正在进行基因组测序,包括24株乳酸菌、3株双歧菌、1株丙酸菌和一株弧菌。两种食品级乳酸菌基因组序列已经完成公布(Lac-tococcus lactis I L1403和Lactobacillus p lantar um WCFS1),三种乳球菌基因组序列和11种乳杆菌基因组序列测序工作即将完成。此外,四株Strep to-coccus t h er m ophilus,1株Ped iococcus pentosaceus,1株P rop ionibacteriu m freudenreichii的基因组正在测序[20]。因此,很快将有一个涵盖食品保藏和发酵相关微生物的巨大生物信息资源库。虽然大部分上述提及的基因组计划刚刚完成或即将完成,但很多信息已经暗示基因组中的细菌素基因对食品贮藏保鲜具有重要意义。在这些细菌中,包括乳酸菌在内的很多微生物已经广泛应用于食品、饲料的生产和保藏[1,3,20]。乳酸菌基因组为食品工业微生物提供了一个相对宽广的筛选空间,为研究乳酸菌的功能基因和抗菌特性搭建了一个重要的生物信息平台。尽管这个平台还处于幼年时期,我们完全相信在不久的将来,乳酸菌基因组将成为研究乳酸菌抗菌活性的重要工具,将为新型生物防腐剂的挖掘、开发与应用奠定基础。
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乳酸菌的分离与发酵实验 生命科学学院2009级四班2组 傅盛晟 摘要：本文对乳酸菌的分离与发酵实验进行阐述，从市售酸乳中分离保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，并进行分离与鉴定，最后进行酸乳的发酵实验！实验主要是分离与纯化，鉴定与发酵，最后用分离的菌进行酸乳发酵在与市售酸乳混合菌种进行比较。 关键词：酸奶，乳酸菌，分离鉴定，发酵 微生物在厌氧条件下，分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能够引起乳酸发酵的微生物种类很多，其中主要能利用可发酵糖生产乳酸的细菌，即乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobaterium)和明串珠菌属(Leuconostoc)等。乳酸细菌多是耐氧菌，只在厌氧条件下才进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸茵或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。 酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发醇而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发醇制品，是具有一定保健作用的食品。酸奶发酵过程通常是由双菌或多菌的混合培养实现的。其中的杆菌先分解酪蛋白为氨基酸和小肽．由此促进了球菌的生长，而球菌产生的甲酸又刺激了杆菌产生大量乳酸和部分乙醛，此外球菌还产生了双乙酰这类风味物质，因此，达到了稳定状态的彻合发酵。酸乳发酵的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪
蛋白(在全乳中的质量分数为2．9％，在乳蛋白中的质量分数为85％)变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味(与形成乙醛、丁二酮等有关)。酸奶发酵中的主要生物化学变化是：乳酸菌将牛奶中的乳糖发酵成乳酸使其PH降至酪蛋白等电点(4.6)附近(4.0~4.6)从而使牛奶形成凝胶状；其次，乳酸菌还会促使部分酷蛋内降解、形成乳酸钙和产生一些脂肪、乙醛、双乙酰和丁二酮等风味物质。这就是酸奶具有良好的保健作用和适合广大乳糖不耐症患者饮用的主要原因。按凝固状态可将酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似，本实验主要是凝固型酸奶的制作方法。 一，材料与方法 1.材料和用具 1）菌种，嗜热乳酸链球菌，保加利亚乳酸杆菌，这两类菌种可从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。 2）培养基参照相关文献和老师的建议以及乳酸菌生长需要复杂营养物质和多种生长因子，我们选用如下培养基： 分离纯化培养基：脱脂乳平板培养基 鉴定培养基：脱脂乳试管 其他：脱脂乳粉或脱脂牛奶，蔗糖等 3）仪器及用具恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养皿，试管，三角瓶若干 2.培养条件 培养温度：40℃ 厌氧条件：由于乳酸菌的发酵与分离纯化都需要厌氧条件，而实验室没有专门的厌氧培养箱，所以我们采用在培养皿和发酵杯上套上保鲜膜制造无氧环境。 培养时间：在培养基上分离培养的时间为2天左右，酸乳发酵为12个小时左右 方法和步骤 1）乳酸菌的分离纯化 101-~105-，取其中的 (1)分离。取市售新鲜酸乳或泡菜的酸液稀释 104-、105-2个稀释度的稀释液各0.1~0.2mL，分别接入脱脂乳琼脂培养基上，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或者直接用接种环沾取原液，平板划线分离，置40℃下培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落及其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。 (2)鉴别。选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8~24h。若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞呈杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色阳性，则可将其接种到试管斜面上连续传代4~6次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 2）乳酸菌饮料—酸乳的发酵
乳酸菌抗菌机理 乳酸菌的抗菌机理涉及其产生的各种代谢产物，包括酸性物质、乳酸菌素、二氧化碳和过氧化氢等。其中酸性物质可以消耗大量细胞能量并影响细胞膜的稳定性；乳酸菌素可作用于细胞膜，造成膜内物质和能量的泄漏。 乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，在自然界和食物中广泛存在。乳酸菌是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一，早在公元前6000年，人们就懂得利用乳酸菌发酵食物。他们发现食物经过一定的处理和储存就可改善风味、延长储存期和增加食物的安全性。迄今人们已明确了许多乳酸菌在生产安全优质食品中所起重要作用的生物学机理[1～2]:乳酸菌可以发酵食物中碳水化合物，分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，来抑制一些腐败菌或致病菌的生长及改善食品的品质和风味，同时经过发酵，乳酸菌可以增加食品的可消化性并产生一些维生素、抗氧化剂。近几年，乳酸菌抑制食品中一些腐败菌和致病菌的作用引起人们的极大关注。虽然现代生物技术和安全体系(如HACCP)已被普遍的引入食品加工行业，但食品的安全问题仍然威胁着人类，每年都有许多关于食物中毒和食源性疾病散发或爆发的报道，同时，人们正力图追求不含化学防腐剂及各种添加剂的天然的安全食品。解决这问题需要发展新的食品保鲜技术来控制食品中腐败菌和致病菌的生长。国内外学者对之开展了大量的研究并建立了许多方法，其中最引人注目的就是利用乳酸菌来加强食品安全性和延长储存期。
1乳酸菌产生的酸性物质及其抑菌作用 1.1乳酸菌产生的酸性物质乳酸菌可产生对食品中微生物具有抑制作用的酸性物质，主要是乳酸菌的代谢终产物及中间产物，包括乳酸、乙酸、乙醇等。 1.2酸性物质对食品微生物的抑制作用一般细菌生长的最适pH 值为6～7，若低于该值，细菌的生长速率将大大降低或不生长甚至死亡，这在腐败性微生物上尤为可见。乳酸菌产生的酸性物质对食品中微生物的抑制作用已在许多实验中得到证实，这种抑菌作用取决于3个相互影响的因素:1.介质的pH值； 2.酸的离解程度； 3.酸的种类。 从20世纪70～80年代，国内外学者就开始建立pH值对食品中各种腐败菌和致病菌抑制作用的预测模型。但在这些模型中都是用无机酸如盐酸、磷酸来降低pH值，而乳酸菌产生的多是一些含羧基的弱有机酸。只有未离解的弱有机酸进入细菌细胞才能有效的发挥抑菌作用。这些有机酸的离解度取决于其pKa和pH值，可以用Henderson-Hasselbach公式计算:pH=pKa+log([A-] / [HA])。从中不难看出介质的pH值影响酸的离解，若在pH值固定条件下酸的pKa决定了其离解度。因此乳酸菌产生的弱酸的抗菌能力取决于介质的pH值及酸的种类(pKa)。由于胞质的pH值相对较高，当非离解的酸通过细胞膜进入胞质，就发生离解使细胞质酸化并释放酸性阴离子。这就给微生物带来两种后果:首先，若微生物要维持其胞内的pH值，就得动用ATP酶来清除质子，这将消耗大量细胞能量，加重细胞的代谢负担；其次，细胞内阴性酸离子的积聚可影响细胞膜的稳定性并抑制其传递
!""#! 实验与实习卫生职业教育$%&’(#())*+%’# 酸奶采用鲜奶和白砂糖为主要原料，经严格消毒后加入活性乳酸菌发酵制作而成。与普通牛乳比较，其中的蛋白质、脂肪经发酵后，易被人体消化吸收，同时还能提高钙、磷、铁的利用率，有利于防止婴儿佝偻病和老人骨质疏松病,"-。同时还具有治疗神经性厌食症、抗毒、抗癌及防止细胞老化，增强机体免疫力等功能,(-。乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌广泛分布在土壤，植物根、茎，湖泊及动物的体内。其从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰染色阳性、兼性厌氧菌或厌氧性细菌。 酸奶中有大量的乳酸菌，可定居在人体的鼻黏膜或消化道等处，所产生的代谢产物能降低肠道内的./值，抑制肠道中的腐败菌生长，减弱腐败菌在肠道的产毒作用，从而维持体内微环境，尤其是肠道内正常的微生态平衡,012-。 市面上出售的酸奶很多都是利用原始菌种进行逐级扩大的培养方式进行，即活化复壮，再进行扩大培养至乳酸菌的活力达到可用程度后，投入生产，进行发酵。在发酵剂的活化过程中，工序多，技术要求严格，稍有不慎就会污染到杂菌，所以培养基研制非常重要，要求培养出来的活菌数多，且培养时间要短。另外，活性乳酸菌达到一定数量才能起到增强机体免疫功能、延缓机体衰老等保健作用。因此，检测活性乳酸菌的含量成为判断产品质量好坏的重要手段。国际上规定乳酸菌数不得低于"3")456789&,#-。 本文就酸奶配制、培养基筛选及乳酸菌计数法进行讨论，对酸奶质量控制、市场研究和发展有一定的理论参考。 !酸奶配制方面的进展 杜传来,4-研制南瓜酸奶的配制方法是原料乳验收，再进行净化和脂肪标准化、混合、预热均质，:#;<)=1");()9>?杀菌，冷却到2#=，接种，罐装，发酵，冷藏。该产品富含矿物质、氨基酸，不含任何防腐剂、色素、香精等化学合成物质1不仅增加了酸奶的花色品种1而且提高了其营养保健作用。张迅捷,*-介绍大豆酸奶的配制主要是原材料（鲜牛奶@大豆@白砂糖）混合浆定容之后高压均质杀菌、冷却、加香精、接种、混匀、装杯封口 进入主发酵，冷藏后发酵，再检验、出库、包装。有研究人员研制的凝固型蜂蜜酸奶 ,:- ，具有独特的蜂蜜清香。其配制主要是脱 脂乳粉加水溶解，添加其他原料（蜂蜜、琼脂），混合过滤，再脂肪含量标准化，预热均质杀菌，尽快冷却，加入发酵剂之后装罐培养、冷却、冷藏后熟，若干小时后便成为颜色微黄的凝固型蜂蜜酸奶。孙好学等,<-配制的酸奶由于加入蜂蜜、 苹果和花生使酸奶颜色微黄，具有独特的清香。其配制方法是原料乳)过滤)脂肪含量标准化)预热)均质)杀菌)冷却)接种)加糖)添加其他原料（蜂蜜、琼脂、苹果和花生）)培养)冷藏后熟)产品。陈增伦等,")-研制蔬菜酸奶。蔬菜含有的淀粉化合物可以改善酸奶组织形态，使酸奶的营养更加平衡、合理。配制过程就是南瓜、胡萝卜去皮后蒸熟，果蔬机打浆后与牛奶、甜味剂混合，山药去皮后剪切，经过滤)均质)杀菌)加乳酸菌发酵)后熟)成品。枸杞具有清肝、润肺、滋肾、明目等功能。有研究人员利用枸杞研制了凝固型枸杞酸奶,""-。 方法是脱脂奶粉加水溶解成为脱脂乳，再加白砂糖和稳定剂等进行调配，混合预热到<);"))=后再冷却到4);*)=。经预处理后的枸杞浆，与之前已调配好的物料再进行调配，匀浆，无菌罐装，杀菌（:0=，0)9>?），冷却（2(=左右），接种，恒温培养（2";2(=），在2=冰箱中存放(2A ， 即为成品。郭红珍等,"(-研制的金针菇与香菇酸奶，瓷白色，光洁，乳白中略带浅黄色，具清新的金针菇或香菇香味。其研制方法是原料奶,金针菇或香菇浸提液 （白砂糖）：鲜奶-)煮沸)装瓶)杀菌（")#=，0;#9>?）)冷却（2(=）)接种)发酵（0*;2"=，0;#A ）)冷却（2=）)后熟)成品)评定。 以上酸奶，配制的基本方法都一样，但辅料不一样，风味各不相同。至于辅料的添加既可以在接种前加入，也可以在接种时加入。 "培养基筛选方面的进展 黄君红等 ,"0- 在对乳酸菌的培养基进行筛选的实验中，用 BCD 培养基、EFG 培养基、("2号培养基、乳酸菌分离培养基、改良马铃薯培养基、蕃茄汁培养基进行对比实验，并在乳酸菌分离培养基上添加了平菇、马蹄、大葱、胡萝卜、马铃薯、青瓜4种 99999999999999999999999999999999999999999999999999999999999999 摘 要：就酸奶配制、培养基筛选及乳酸菌计数法进行讨论。 关键词：酸奶；配制；培养基；乳酸菌；计数法中图分类号：H2(2’0" 文献标识码：F 文章编号："4*"!"(24I ())*J )#!)""#!)0 黄 雁"，邓海群( I "’韩山师范学院1广东潮州#(")2"K (’潮州*#(()部队机关卫生所1广东潮州#(")))J 酸奶配制及其乳酸菌培养基和计数法的研究进展 学质量提供了新的途径。 参考文献： ,"-柯新华，周世学，周英杰，等’严格培养作风优良的医务工作者,C -’解放军医院管理杂志，())"，:I 2J L (*#;(*4’ ,(-郑红1陈善明1师景波1等’我院如何做好临床教学工作,C -’中华医院管理杂志1"<<<1""L 4#";4#2’ ,0-方立1王莉萍’进修医生临床教学的组织与管理,C -’解放军医院管理杂志1())"，:I (J L ""#;""4’!
食品微生物课程论文 题目乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用姓名费鹏学号2013309010006 专业食品科学评分 指导教师谢笔钧职称教授 中国·武汉 二○一三年十二月
乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用 摘要：乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一，其通过发酵糖类，主要产生乳酸，被广泛应用于发酵肉制品、酱油、白酒、饮料等行业。本文对其代谢过程、发酵条件及其在食品中的应用进行了综述。 关键词：乳酸菌；代谢；发酵；食品工业 Abstract: Lactic acid bacteria is one of microorganisms which human being earliest used in food storage and processing. It can produce lactic acid by fermenting saccharides, which were applied in the field of fermented meat product, soy, wine, beverage and so on. This paper introduced the metabolism, fermentation conditions of LAB and its application in food industry. Keywords: Lactic acid bacteria; metabolism; fermentation; food industry 乳酸菌是一类能利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称[1]。乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae )。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus )、链球菌属(Strptococcus )、明串珠菌属(Leuconostoc )，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长[2]。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸和肤等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸(分同型乳酸发酵和异型乳酸发酵)，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，其结果可使培养基pH值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1. 乳酸菌的代谢 微生物的代谢是指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。其中分解代谢过程将复杂的有机物分子通过分解代谢
乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
乳酸菌细菌素抗菌潜力挖掘研究进展 易华西,张兰威,杜明,韩雪 (哈尔滨工业大学食品科学与工程学院中法乳联合实验室,哈尔滨150001) 摘要:乳酸菌产生的主要抗菌防腐物质是有机酸,但在乳酸菌代谢产物中发现了细菌素等其它抗菌物质,其中有的细菌素甚至具有强烈的抗真菌能力。世界范围内启动的乳酸菌基因组计划创造了巨大的生物信息流。乳酸菌基因组蕴含的生物信息将对研究乳酸菌细菌素的合成代谢途径,功能基因挖掘以及新型抗菌剂的开发搭建信息平台。结合乳酸菌细菌素的最新研究进展,讨论利用乳酸菌基因组探索乳酸菌的抗菌潜力及其作为生物防腐剂在食品保藏中的应用前景。 关键词:生物防腐剂;乳酸菌;抗菌物质;细菌素 中图分类号:TS20113文献标识码:A文章编号:1006-2513(2010)01-0073-04 Recent advance on the potential anti m icrobial activity of bacteri oci ns produced by LAB Y I Hua-x,i ZHANG Lan-w e,i DU M i n g,HAN X ue (S i n o-France Dairy Jo int Laboratory ofH arbin I nstitute o fTechno logy,H ar b i n150001) Ab stract:T he m a j o r an ti m icrob i a l and biopreservative s ubstance produced by LA B i s organic ac i d;how ev er,som e LA B produce add i tiona l anti m icrobia l compounds.Among these,the bac terioc i ns have de m onstrated great potenti a l as food preservati ves.A tre m endous fl ow o f i nforma ti on has been created through various genome sequenc i ng pro jects wor l dw i de.T he i n f o r m ati on obta i ned fro m genom ics w ill prov ide anew platf o r m for i dentifi ca tion of pat hw ays for the bac-ter i oc i ns producti on,g eno m e m i n i ng and deve l op m ent of ne w anti m icrob i a l agents.Explorati on o f anti m icrob i a l po ten-tial i n LAB by geno m ics was also d i scussed i n t h is rev i ew. K ey w ords:LAB genom e;LA B;an ti m icrob i a l compounds;bacter i oc i ns 食品防腐剂是食品添加剂的重要成员之一。随着人们对食品安全意识的提高,生物防腐剂比化学防腐剂有更广阔的发展前景。发酵食品是全球食品中不可缺少的重要组成部分。食品发酵生产的成功在很大程度上与发酵剂产生的抗菌代谢产物有关,对发酵剂的抗菌能力也有很大的贡献[1]。细菌素(B acteriocins)是这类代谢产物中的典型代表。细菌素是核糖体合成的抗菌肽,包括乳酸菌(LAB,lactic acid bacteria)在内的很多食品工业生产菌株都具有分泌细菌素的能力。与此同时,也发现并鉴定了一些不同于细菌素的抗菌物质,其中有的物质具有强烈的抗真菌能力[2]。乳酸菌是目前世界公认安全的食品级微生物,它们产生的抗菌物质也是安全的,可作为天然的食品防腐剂直接应用于食品工业,因此乳酸菌抗菌能力的挖掘和开发受到了国内外食品保鲜 收稿日期:2009-05-15 基金项目:科技部/8630资助项目(2007AA10Z354)。 作者简介:易华西(1976-):男,讲师;研究方向:乳品微生物。 73
细菌毒力岛的研究进展 1 毒力岛基本特征及分类 1.1基本特征 毒力岛(virulenceisland)又称致病性岛(pathogenicity island),是近年来在细菌分子学研究领域出现的新概念。1997年Hacker等对毒力岛下了较为精确的定义:即毒力岛是编码细菌毒力基因簇的一分子量相对较大的染色体DNA片段。毒力岛具有下列基本特征[1～4]:(1)编码细菌毒力基因簇的一个相对分子质量较大的(20～100k左右)染色体DNA片段。(2)一些毒力岛的两侧具有重复序列和插入元件,但是也可以没有。(3)毒力岛往往位于细菌染色体的tRNA基因位点内或附近,或者位于与噬菌体整合有关的位点,肠致病性大肠杆菌(EPEC)的LEE毒力岛就位于转运RNAselC位点[2,3]。(4)毒力岛DNA片段的G+Cmol%、密码使用和宿主细菌染色体有明显差异,有的比宿主细胞的G+Cmol%明显高,有的明显低。(5)毒力岛编码的基因产物许多是分泌性蛋白和细胞表面蛋白,如溶血素、菌毛和血红素结合因子,一些毒力岛编码细菌的分泌系统(如Ⅲ型分泌系统)、信息传导系统和调节系统。(6)一种病原菌可以有一个或几个毒力岛。(7)一部分学者认为,细菌的毒力岛应该包括位于噬菌体和质粒上的、与细菌的毒力有关的、其G+C 百分比和密码使用与宿主细胞明显不同的DNA片段。(8)毒力岛可能与新发现的病原性细菌有关。 1.2 分类 目前发现的毒力岛根据其G+C百分比与宿主菌的差异,可分成两类:即高G+C 毒力岛,如小肠结肠炎耶尔森菌的毒力岛；低G+C毒力岛,如大肠杆菌、沙门氏菌以及幽门螺杆菌中的毒力岛。根据毒力岛编码的产物性质可分为致病性岛和共生岛两大类。 2 结构与功能 2.1 结构 毒力岛是由独特的DNA片段构成,其不同来源的毒力岛的分子量、密码使用、G+C百分比各异。毒力岛主要含有与细菌毒力有关的基因,此外,RS和IR在毒力岛上也比较常见,而且,IR的类型也多种多样。大多数毒力岛在染色体上的位置
同型乳酸发酵 经EMP途径。同型乳酸发酵(homolactic fermentation)是指嗜酸乳杆菌(L．acidophilus)、德氏乳杆菌(Lnc．delbriikii)等乳酸杆菌利用葡萄糖经糖酵解途径生成乳酸的过程。因为乳酸杆菌大都没有脱羧酶，所以糖酵解途径产生的丙酮酸就不能通过脱羧作用而生成乙醛，只有在乳酸脱氢酶催化作用下(需要辅酶I)，以丙酮酸作为受氢体，发生还原反应而生成乳酸。 由此可以得出，葡萄糖经同型乳酸发酵的总反应式为： C6 H 12O6+2ADP+2Pi——+2CH3CH(OH)COOH+2ATP 1分子葡萄糖生成2分子乳酸，理论转化率为100%[1]。 异型乳酸发酵 经HMP途径。 异型乳酸发酵(heterolactic fermentation)除生成乳酸外还生成CO2和乙醇或乙酸。其 生物合成途径也有两种：6-磷酸葡萄糖酸途径和双歧(bifidus)途径，前者的代表菌株有肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)及葡聚糖明串珠菌(L．dextranicum)，后者代表菌株为双歧杆菌(Bi fidobacterium bifidum)。 异型乳酸发酵 葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖酸(6-phosphoglu-conate)后，在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (6-phosphogluconate dehydrogenase)作用转化为5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate)， 经5-磷酸核酮糖-3-差向异构酶(ribulose-5-phosphate-3-epimerase)的差向异构作用生成5-磷酸木酮糖(xylulose-5-phosphate)，5-磷酸木酮糖在磷酸酮解酶(phosphor01ysis ketonase)的催化作用下可分解为乙酰磷酸(acetyl phosphate) 和3-磷酸甘油醛。前者经磷酸转乙酰酶(phosphotransacetylase)作用转化为乙酰CoA，再经乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase)和乙醇脱氢酶(aclhoi dehydrogenase)作用最终生成乙醇；后者经EMP途 径生成丙酮酸，在乳酸脱氢酶的催化作用下转化为乳酸。通过6-磷酸葡萄糖酸异型乳酸发 酵途径，1分子葡萄糖最终可转化为1分子乳酸和1分子乙醇，从而得出乳酸对糖的理论转化率为50%[1]。 双歧杆菌发酵 经HK途径—磷酸己糖解酮酶途径。 反应在厌氧条件下进行，反应过程中不发生脱氢反应，1分子葡萄糖经双歧反应途径 最终转化为1分子乳酸和1.5分子乙酸，乳酸对糖的理论转化率为50%；途径中有两个磷 酸酮解酶参与，即6-磷酸果糖酮解酶(6-phosphofructokinase ketonase)和5-磷酸木酮糖磷酸酮解酶(xylulose-5-phosphorolysis ketonase)[1]。 乳酸菌、玉米的胚、马铃薯块茎、甜菜块根和骨骼肌等。 凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。 大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，
乳酸菌研究进展 摘要:本文对乳酸菌、乳酸菌的应用、乳酸菌菌剂真空冷冻干燥技术、冻干保护剂等多方面进行了阐述。 关键词: 乳酸菌；应用；发酵剂；真空冷冻干燥 1. 前言 早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。到目前为止，人们利用乳酸菌的乳酸发酵，制作泡菜[1]、酸菜、乳酪、酸奶等食品。另外青贮饲料经乳酸发酵后可增加贮藏时间和提高饲料的利用率。在工业上制取乳酸是用淀粉类物质先糖化后，再用乳酸菌进行乳酸发酵生产纯乳酸[2-3]。发酵乳中的乳酸菌有预防肠癌、降低血液胆固醇含量、提高系统免疫功能、减轻过敏反应和防止糖尿病等功能[1-3]。由于乳酸菌所具有的营养、健康的特殊功效，使其风靡欧、美、日、韩等市场，并被广泛应用于乳制品、饮料、肉制品、保健食品等食品及预防医学领域[4-6]。 泡菜产业是我国传统发酵食品中对国民经济具有重要贡献的产业之一。但我国泡菜企业长期沿用自然菌发酵，企业规模小，泡菜生产周期长，产品质量不稳定，食用安全性差。这些问题严重影响和制约了我国泡菜产业的发展。采用现代生物技术，开发泡菜发酵专用复合菌粉生物技术产品，对改造我国传统泡菜产业具有非常重要的现实意义。直投式泡菜发酵专用复合菌粉产品，是泡菜工业化生产的专用发酵剂，但目前市场上还没有见到该产品销售。直投式泡菜发酵专用复合冻干菌粉产品的使用，可以保证泡菜的产品质量，极大地缩短泡菜的发酵时间，提高泡菜的产量和质量。 2. 乳酸菌 2.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是指在代谢过程中能产生乳酸的细菌的总称。其中能进行乳酸发酵的大部分是细菌，有些为球菌、有些为杆菌，一般都不会运动。 常见的球形乳酸菌主要有：链球菌属将糖类经双磷酸已糖途径分解产生右旋乳酸，属正型乳酸发酵。多见于动物及动物性制品上；明串珠菌属将糖经单磷酸己糖途径分解产生左旋乳酸及乙醇等物质，属异型乳酸发酵。多见于植物体及植物制品之上；片球菌属将糖类经双磷酸己糖途径分解产生混旋的乳配。多数生活在植物及其制品上。 常见的杆形乳酸菌是乳杆菌属，约有20多种，有些种类产生右旋乳酸、也有产生左旋和混旋的乳酸，动、植物及其制品上均可找到它们。 2.2 乳酸菌特殊生活特点 乳酸菌具有强抗酸能力，大部分乳酸菌还具有很强的抗盐性，都能耐5％以
泛分布,但只有少数省份对其玉米矮花叶病作了毒源鉴定,基本明确为MDMV 2B (SC MV 2MDB ),而其他许多省份的玉米矮花叶病并未作毒源鉴定,它们究竟是属于MD 2MV 2B 株系还是属于SC MV 亚组中其他种类的病毒或为多种病毒的复合侵染还有待明确。因此,需要进一步明确病毒种类,了解玉米矮花叶病的流行规律,为抗病育种打下基础。 参考文献 [1]W illiams E ,Alexander L J 1Phytopathology ,1965,55:802～8041 [2]R osenkranz E 1Phytopathology ,1987,77:598～6071 [3]史春霖,徐绍华1植物病理学报,1979,9(1):35～401 [4]马占鸿,李怀方,裘维蕃1植物病理学报,1998,28(1):25～281 [5]马占鸿,李怀方,裘维蕃,等1玉米科学,1997,5(2):72～761 [6]M cdaniel L L ,G ordon D T 1Phytopathology ,1989,79(1):113～1201 [7]M ackenzie D R ,W ernham C C ,F ord E 1Plant Disease Reporter ,1966,50(11):814～8181 [8]Shukla D D ,Frenkel M J ,M ckern N M 1Archives of Virology ,1992(Suppl 5):363～3731 [9]石银鹿,张 琦,王富荣,等1植物病理学报,1986,16(2):99～1041 [10]吴建宇,盖均镒1南京农业大学学报,1999,22(2):117～1181 [11]G ough K H ,Shukla D D 1Intervirology ,1992,36:181～1921 [12]K ong P ,S teinbiss H H 1Archives of Virology ,1998,143:1791～17991 [13]Murry E ,E lliott G,Capitant A ,et al 1Bio/T echnology ,1993,11:1559～15641 [14]M arie 2Jeanne V ,I oos R ,Peyre J ,et al 1Phytopathology ,2000,148:141～1511 [15]范在丰,陈红运,李怀方,等1农业生物技术学报,2001,9(1):121 3联系人 T el :0571288381111261702 收稿日期:2001210209,修回日期:2001212230 乳酸菌抗菌机理研究进展 李铁军1 李爱云2 张晓峰33 (浙江国邦兽药厂 新昌 312500)1 (浙江大学医学院附属产科医院 杭州 310006)2 (浙江出入境检验检疫局 杭州 310012)3 摘要:乳酸菌的抗菌机理涉及其产生的各种代谢产物,包括酸性物质、乳酸菌素、二氧化 碳和过氧化氢等。其中酸性物质可以消耗大量细胞能量并影响细胞膜的稳定性;乳酸菌素 可作用于细胞膜,造成膜内物质和能量的泄漏。对于它们抗菌机理的认识有助于我们更好 的将乳酸菌应用到食品的安全生产中。 关键词:乳酸菌,抗菌,酸性物质,乳酸菌素 中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:025322654(2002)0520081205 乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称,在自然界和食物中广泛存在。乳酸菌是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一,早在公元前6,000年,人们就懂得利用乳酸菌发酵食物。他们发现食物经过一定的处理和储存就可改善风味、延长储存期和增加食物的安全性。迄今人们已明确了许多乳酸菌在生产安全优质食品中所起重要作用的生物学机理[1～2]:乳酸菌可以发酵食物中碳水化合物,分泌乳酸菌素,
精心整理 乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 时，SL 培养基、MS 对乳酸菌无害。一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH 。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h →挑选产生溶
钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。 2.溴甲酚绿指示剂法： 培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二.菌种的分离筛选 1.培养基： ★1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX）1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） ★★1.2吐温 ★1.3 酵母膏（分离用） 1.4 1.5 MgSO 4 1.6 ★★1.7 蛋白胨 葡萄糖、琼 脂18.0g 酸钙, 1.8BCP 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml pH6.5-7.0（分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。
乳酸菌活菌制剂对动物免疫调节作用研究进展 黑龙江省科学院微生物研究所曹亚斌 Fuller于1989年首次给益生菌下的定义是“益生菌是通过改善肠道菌群平衡而对宿主健康产生有益作用的活菌添加剂。”FAO和WHO 给出益生菌的定义为“当摄人足够数量时可对宿主起有益健康作用的活的微生物。”不少地方采用这一概念，但随着研究的进行逐渐发现了这个定义的局限性，不同的研究者也不断提出应对益生菌概念进行调整和完善。在有益菌中，主角是乳酸菌，各国科学家对活性乳酸菌的研究取得诸多成果。 活性乳酸菌对动物机体有众多的有益作用，如协调和维持胃肠道微生态平衡；和病原体竞争肠黏膜的吸附位点，致使病原菌无法在肠黏膜上定植，促进营养成分的吸收，抗肿瘤作用，刺激免疫细胞的活性，提高机体的免疫力等，其中最引人注目的是活性乳酸菌对于机体免疫力的影响。 一、活性乳酸菌发挥免疫调节作用应具备的条件 对于活性乳酸菌菌株的选择应建立在它能够促进肠内免疫反应而不会改变肠内动态平衡的基础上。要胜任这个使命，乳酸菌应具有以下特点：①应具有较高的活性，必须能耐受低pH以及胆汁酸；②如果菌株不能在肠道内定植，应能够在肠道内持续存在（可通过持续摄人而满足）；③能够附着到肠上皮以抵抗肠蠕动的冲洗作用；④应该能够和肠相关的免疫细胞相互作用或者发出信号。 1、乳酸菌的活性
一般认为活性乳酸菌要对免疫系统起作用，它们必须保证是存活状态的，可以在肠道内增殖并存活下去，包括FAO和WHO的概念中都认为益生菌应该是活的微生物。试验证实和活性的德氏乳杆菌组相比，无活性的德氏乳杆菌组激活分泌细胞子的细胞数量要少。 另有一些试验结果明确地显示，被摄取的菌株并役有成为肠道正常菌群的固定成员而只是在摄取期间存在或者是在给料后维持相当短的一段时间。另外，乳酸菌的代谢产物中的乳酸及一些可溶性因子也会发挥作用。从8种冻干乳酸菌株组成的乳酸菌混合物VSL3中提取的DNA可引起上皮细胞和免疫细胞的非炎性反应。在一个同样使用(VSL3)混合物的相似的研究中发现，这种乳酸菌的染色体DNA通过TLR9信号途径对右旋糖酐硫酸酯钠引起的小鼠大肠炎模型有抗炎作用。 试验证明，只有活性乳酸菌，在肠内存在至少48 h～72 h才能发挥作用，这是所有颗粒性抗原要诱导肠内免疫促进作用所必须的。这一结果提示了对于每一种动物来说每天定量的活性乳酸菌摄人对于其发挥免疫作用是非常重要的。这类研究有助于阐明关于活性乳酸菌对免疫调节的分子基础。 2、益生菌的黏附性 关于益生菌的黏附性也受到较多的关注，对宿主细胞或黏滚的黏附能力被认为对益生菌来说是必须的。因为只有黏附到肠道内表面才能抵抗肠道的蠕动而不被很快的排出，只有黏附之后才有和肠上皮和相关免疫细胞相互作用的可能。然而对于活性乳酸菌的黏附性，尤其
病原菌感染宿主的转录组学研究进展(一) 【关键词】感染 病原菌与宿主的相互作用，是构成感染的基本因素。现代分子生物学的发展推动病原菌与宿主相互作用研究进入到了分子水平。应用基因芯片转录组学分析技术，可以对病原菌入侵宿主以及宿主的防御抵抗进行转录组学研究。从病原菌全基因组水平以及感染宿主的基因水平阐述病原菌与宿主之间的相互关系。阐明病原菌入侵以及宿主抵抗病原菌的分子机制，本文将对病原菌在感染宿主过程中的转录组学研究进展进行简要综述。 1病原菌与宿主的相互作用 细菌性感染的发生和发展是病原菌与宿主相互作用的结果。感染的本质是病原性细菌为达到在宿主内生存和繁殖的目的，与宿主的各种抵御因素发生相互作用。在此期间，既有病原菌为逃避宿主防御机制而进行的适应，也有宿主为清除病原菌而调动防御体系的努力。从细菌的角度讲，由原寄生地侵袭到宿主时，环境中各种营养物质的含量、种类、温度、渗透压与酸碱度等因素的改变，以及宿主对细菌的抵抗，必然对细菌的生存施加巨大压力。为了生存，细菌能够快速敏感地监测环境中各种因素的变化，迅速地调节本身的结构，调节其生理、生命行为，达到适应新的环境，在宿主体内寄生，感染宿主目的。对于宿主来说，真核生物有着极其完善的信号转导系统，可以感知病原菌的侵入，启动严密的防御系统来抵抗病原菌的入侵。有些宿主还可以分泌一些杀菌素样的物质，导致病原菌不能在其体内生存，维持自身的正常生理状态。病原菌与宿主相互作用研究一直是控制感染性疾病发生的一个关键环节。2细菌的基因芯片转录组学研究 随着基因测序技术的发展与成熟，使得大量微生物基因组的序列测定完成。标志着基因组学的研究由结构基因组学进入了功能基因组学时期。转录组学研究是功能基因组学研究的一个重要手段。Velculescu和Kinzler等人于1997年首先提出转录组概念〔1〕。转录组学是从一个细胞中的基因组全部mRNA水平研究基因表达情况。转录组学研究作为一种宏观的整体论方法改变了以往选定单个基因或少数几个基因零打碎敲式的研究模式〔2〕，将基因组学研究带入了一个全新的高速发展时代。 基因芯片转录组学研究是应用全基因组芯片对不同条件下细菌的mRNA进行平行分析，可以获得细菌在不同条件下所发生的差异变化基因，从基因水平上揭示基因表达的差异。该技术的反应原理是通过对不同来源的mRNA进行逆转录，而后分别用不同颜色的荧光素标记成探针,探针混合后与芯片上的基因进行杂交,再通过扫描仪扫描，获得两份样品中RNA的相对丰度，结合已有生物信息学资源对数据进行生物学解读。 基因芯片技术的发展，为研究病原菌与宿主相互作用提供了全新的研究机会。通过基因芯片转录谱分析细菌感染宿主表达谱的差异，可以在全基因组范围获得细菌为适应在宿主体内生长而表现的基因表达差异，通过对差异表达基因的生物信息学分析可以筛选到病原体在体内存活必需表达的基因，预测与致病性密切相关的毒力基因。从而有助于进一步阐明致病菌的致病机制。芯片转录谱技术为大规模发现及鉴定病原菌致病基因提供了一个快速、有效的平台。 3病原菌与宿主相互作用体外转录组学研究进展 应用转录谱芯片进行病原菌与宿主相互作用研究经历了体外与体内两个阶段。首先是应用病原菌与感染宿主细胞在体外进行相互作用，通过体外细胞来模拟病原菌感染宿主的微环境，获得病原菌与宿主细胞之间的相互作用规律，从而间接反应病原菌入侵宿主的转录特征与分子作用机理。 目前对多种病原菌与多种体外细胞包括上皮细胞、内皮细胞接触以及侵染多形核白细胞（PMNs）单核／巨噬细胞过程中基因表达变化进行了体外转录组学研究。通过以上研究，发现了大量微生物的毒力相关基因，存活必须基因，以及在感染过程中细菌重要的酶类和转
乳酸菌生物技术的应用研究进展 乳酸菌生物技术是21世纪各国竞相开拓的一个尖端领域，乳酸菌是一类能够利用碳水化合物生成乳酸的革兰氏阳性细菌的总称。在分类学中，其可以划分为43个属（包括乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属等），210余个种及亚种。乳酸菌生物技术是一门涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的新兴学科，是现代生物学和其他学科交叉融合的产物。下面我从五个不同方面简单介绍乳酸菌的应用，当然它的应用远远不止这些。 一、乳酸菌在青贮中的应用 乳酸菌是促使青饲料发酵的主要微生物，乳酸菌依其发酵糖生产乳酸的能力分为两类，一种是同型发酵乳酸菌；另一类是异型发酵乳酸菌。同型发酵乳酸菌在生产乳酸和青贮饲料方面更有效,耗能更少，而且容易保存营养物质，属于比较经济的发酵类型。青贮能否成功在很大程度上取决于同型乳酸菌能否迅速大量繁殖，筛选并培养最适合的乳酸菌是关键，调节青贮料内微生物区系，调控青贮发酵过程，促进多糖与粗纤维的转化，从而有效地提高青贮饲料的质量。 二、乳酸菌在植物种植中的应用 乳酸菌对植物生长的促进作用，乳酸菌所分泌的有机酸( 乳酸、乙酸和柠檬酸等) 一方面直接溶解土壤中难溶性磷酸盐，另一方面则通过螯合作用释放出土壤磷素，以便于植物吸收利用；同时乳酸菌对植物病害有着调控作用，诸多研究证实乳酸菌可有效防治植物真菌性病害，日本科学家利用乳酸片球菌研制出了防治农作物病害的“乳酸菌农药”。将其制成液态药物，将菠菜种子在药液里浸泡24 h。处理过的种子播种到含菠菜枯萎病病原菌的土壤内，在长出来的菠菜中染病菠菜只占约12%。 三、乳酸菌在动物生产中的应用 在鸡、猪等基础日粮中添加乳酸菌制剂，可以提高肉鸡、猪日增重和肉品质，提高饲料转化率，增强机体免疫机能等；在幼龄反刍动物的饲养过程中使用乳酸菌制剂，有助于幼龄反刍动物瘤胃发育，提高日增重，调节瘤胃ｐＨ；有助于反刍动物肠道微生物的菌群平衡等。帅丽芳等给荷斯坦奶牛饲喂含乳酸菌的发酵乳，结果发现其反刍时间得到显著提高。聂志武（通过给新生犊牛口服假长形双歧杆菌，研究结果发现其增重提高了２５.２％，饲料转化率提高了１１．４％；朱学芝等研究结果发现，乳酸菌的代谢产物能协助虾消化一些不易消化代谢的营养物质，从而促进虾对营养物质的吸收，提高饲料的转化率。 四、乳酸菌在临床中的应用 在人体肠道中，有多达500种约1亿个细菌共生。这之中，包括乳酸菌在内的20个属为优势菌群。人体在健康状态下，肠道内的菌群在种类和数量方面保持相对稳定，形成良好的微生态平衡。乳酸菌在肠道内定殖后可通过调整正常肠道菌群相对含量发挥益生作用。这些作用主要包括缓解乳糖不耐的症状、腹泻、胃溃疡，促进免疫应答，抗过敏和预防结肠癌，增强免疫功能等。 五、乳酸菌在基因芯片中的应用 基因芯片技术是上世纪 90年代兴起的一种对成百上千甚至上万个基因同时进行检测的新技术,具有高通量、并行化的特点,广泛应用于基因表达谱测定、基因功能预测、基因突变检测和多态性分析等方面。多种乳酸菌基因组全序列以及其大量 EST、16S rDNA、16S-23S 基因间区和功能基因序列测定的完成,有力地推动了基因芯片技术在乳酸菌研究中的应用。在我国, 内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室从内蒙古地区酸马奶中分离了一株具有优良特性的干酪乳杆菌(L. caseiZhang), 具有很强的耐酸、耐胆盐、降胆固醇及免疫调节等特性,该菌是国内较为系统开发的益生菌菌株之一,并且和中国科学院北京