?三次采油?
微生物驱油矿场试验及效果分析
王 斌 杜文贞 杨广雷 王 健 陈 伟 袁新平
(胜利油田有限公司纯梁采油厂)
摘要:针对正理庄油田沙一段油层非均质性严重,层间隔层较小,常规调剖效果较差的特点,对微生物驱油的可行性进行了研究,确定了微生物注入井并制定了整体方案。矿场试验表明,微生物驱油之后与之前相比,产量自然递减下降了3.7%;日产油量上升了14t/d ;综合含水下降了3.1%,开发效果得到明显改善。关键词:微生物驱油;矿场试验;效果分析;细菌;提高采收率中图分类号:TE357.9 文献标识码:B
文章编号:1009-9603(2001)02-0061-03
引言
微生物采油技术是近几年发展起来的一项三次采油技术。它通过特殊的细菌在地层中的生长代谢,对原油直接作用,改善其流动性,从而达到提高采收率的目的。该项技术具有适用范围较广、成本低、施工简单等优点。为了探索中温、中渗油藏在中等含水期采用微生物提高采收率的可行性,1998年在正理庄油田正南沙一段油藏开展了微生物驱油先导试验。
1 油藏概况
1.1 地质特征
正南沙一段是正理庄油田的主力开发单元,该油田位于东营凹陷博兴洼陷西南部,处于金家-樊家鼻状构造带中段,是一受基岩隆起控制的,后被浅层基性侵入岩穿刺的小型背斜构造。油藏埋深为1250～1490m 。正南沙一段共划分为4个砂层组,其中第3、4砂层组是主力含油砂层组。该层段属湖相三角洲河口坝边缘及河口坝沉积,储集层以中、厚层粗粉砂岩为主。平均孔隙度28.6%,平均渗透率477.1×10-3μm 2,筛析泥质含量9.8%,碳酸盐含量6.0%,粘土平均含量5.2%,粘土矿物以蒙托石为
主。由水敏评价结果得知,储集层呈强水敏性。正南沙一段为常温系统,地温梯度3.2℃/100m 。原油性质属低凝原油,其地面相对密度0.9058～0.9313,
地面粘度7.2～48.6mPa ?s ,凝固点-24℃～17℃,含硫0.15%～0.32%,含蜡7.6%～9.8%,胶质30.32%,沥青质1.31%。地层水属低矿化度的氯化钙型和碳酸氢钠型,总矿化度5808～11639mg/L ,氯离子3329～6885mg/L 。1.2 开采动态及水驱现状
该块于1989年6月投入开发,1990年8月开始注水。1997年12月该块共投产油井15口,开井14口,核实日产液水平210t ,日产油水平83.5t ,综合含水60.2%,采油速度0.95%,采出程度8.92%;投产注水井10口,开井9口,日注水平215m 3,月注采比0.96,累注采比0.94;平均动液面859m ,地层压力10.86MPa ,总压降3.3MPa 。由于层间及层内矛盾突出,注入水沿高渗层突进,导致油井含水上升速度快,开发效果急剧变差。1995年12月到1997年12月,区块日产油水平由116t 下降到83.5t ,综合含水由45.5%上升到60.2%,阶段采出程度1.88%,阶段含水上升率7.75%。
2 微生物驱可行性研究
正理庄油田沙一段的油藏物性特点符合美国国
家石油和能源研究所(NIPER )微生物驱油选井标准及现场施工的条件。在室内做了菌种筛选、菌种模拟地层条件的适应性评价及菌液驱油试验等三方面工作。2.1 菌种筛选
将富集培养和分离纯化培养过程的环境温度都
收稿日期2000-09-02;改回日期2001-02-23。
作者简介:王斌,助理工程师,1988年毕业于胜利石油学校采油工程专业,现从事油田开发工作。联系电话:(0546)8753178,通讯地址:(256504)山东省博兴县陈户镇纯梁采油厂。
油 气 地 质 与 采 收 率
2001年4月 PETRO LE UM GE O LOGY AND REC OVERY EFFICIE NCY 第8卷 第2期
设置为油藏温度65℃。用地层水样富集培养、分离,获得3组以对数增长方式生长的细菌,即FPA、FP B和FPC;另外,从已有的菌种中,根据温度适应性选出3组细菌:CF106、CF109和CF12。
配制培养基时,矿化度调至地层水矿化度,于不锈钢罐中灭菌,分别接入菌种。加压10MPa,于65℃下培养,经48h、96h和144h分别取样镜检、计数。
试验结果表明,6组细菌在模拟地层条件下都能生存,但生长繁殖能力差异大。其中,FPA和FPC 生长较好,说明它们适合地层环境,可作为进一步物模试验的菌种。
2.2 适应性评价
2.2.1 原油样的测试分析
微生物学研究表明,有些原油中含有抑制细菌生长的毒性物质[1]。因此,试验前必须进行室内原油毒性分析。
在每个血清瓶中都加入细菌液体培养基20m L,再分别加入各种原油样20m L,用不加原油样作对照,同时接种培养48h,检测细菌浓度。
48h培养后各菌液长势略有区别,继续培养72h 后,只有高26井原油样配制的液体含菌密度较低,其余生长基本相同,说明原油对细菌的生长没有不良影响。
2.2.2 水样的测试分析
计量站取回单个水样做室内分析,总矿化度为9288mg/L,氯离子浓度为6849mg/L,水型为碳酸氢钠型。在地层水中加入细菌必需的营养,65℃培养,水样中内源菌略有生长;38℃培养生长较快,说明地层水中含有一定量的细菌,这是长期注水开发油藏的特点。计数分析表明,内源菌最高浓度约为2.5×103cell/m L,菌落类型4种,其中以一种杆菌为主。厌氧条件培养,无硫化氢产生。
在地层水中加入营养,同时按2%体积比接入菌种,菌种浓度为5×103cell/m L,65℃培养48h,取样平板培养,观察菌落形态。结果表明,内源菌仅占极少数,而接入的细菌大量存在,说明内源菌对菌种生长无不良影响,有较好的相容性。
2.3 物理模拟
2.3.1 微观模型试验
试验结果表明,在多孔介质中注入菌液、微生物产生的气体和生物表面活性剂等代谢产物,水驱残余原油流动性得到改善,表现出原油在水气“界面滑动聚集”、
“界面流动”、“乳化携带”和“聚并运移”等现象。2.3.2 菌种优化驱油试验
驱油试验采用处理过的油砂充填岩心,试验温度控制在65℃。试验用油和水取自区块计量站,注入细菌浓度为105～106cell/m L。试验步骤为,岩心抽空→饱和水→计算孔隙体积→测水相渗透率→饱和油→测含油饱和度→水驱至含水95%以上→计算水驱采收率→注稀释菌液→恒温放置4d→水驱→计算最终采收率。
用FPA和FPC两组菌液做平行试验,计算最终采收率。结果表明,微生物的注入能较大幅度地提高原油采收率,注入量越大,提高采收率越多。FPC 菌组较适合该区块原油驱替,应作为现场试验菌种。
2.3.3 增加基质驱油试验
在地层中,细菌虽然可以依靠原油中的部分有机物进行生长,但生长速度较慢,生长量较小,如果加细菌生长必要的基质,细菌就可以在地层中较好的繁殖,并产生大量利于驱油的代谢产物,其驱油效果将大幅度提高[2]。国外微生物驱矿场应用已证实了其可行性。
用注入水和基质分别将菌液稀释成不同的浓度,在模拟条件下,水驱后,注入0.3PV不同浓度的菌液,进行驱油模拟试验。结果表明,菌液浓度越高驱油效果越好,加基质比不加基质的效果好。
3 微生物驱矿场试验
试验区块共6个井组,控制储量219.3×104t。所需的菌液量要确保试验期注入水中细菌含量为105～106cell/m L。
理论上,采取连续注入菌液的方式效果最好,因为这样可以维持地层中的细菌浓度及其作用效果。该区块日配注150m3,试验期为300d,共注水4.5×104m3,因此,理论上需要菌液450m3。由于试验区6口注水井总的日配注量较低,只有150m3/d,所以采取不关井的方式进行试验。
整个试验分三个阶段。第一阶段定期注入菌液,时间间隔为15d,首次注入菌液为60m3,基质24t,以后每次注入菌液量为第一次的50%,连续注8次,持续时间为120d,注入菌液总量300m3、基质90t;第二阶段注入菌液总量为第一阶段的50%,即150m3,每次注入菌液的间隔时间延长至20d,每次注入量为15m3,共注10次,持续时间为180d;第三阶段在前两阶段的基数上适当调整注菌量和注菌周期,并开展其它相配套的微生物采油试验。
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?油 气 地 质 与 采 收 率 2001年4月
根据整体方案的要求,结合现场实际情况,自1998年3月17日正式进入现场试验以来,历时一年半,在正南沙一段西区3口注水井驱油21轮次、东区16轮次,共注入微生物菌液590m3、基质227t。同时,结合驱油开展了微生物加药吞吐试验,在正南沙一段10口油井上施工4轮次,应用微生物菌液10.8m3。
4 矿场试验效果分析
4.1 注水井吸水能力提高
微生物驱油前后6口井的注入压力监测表明,其平均压力降低了0.3MPa(因试验区采取控制注水,在同等压力下,平均注水量上升幅度5%～15%),说明微生物的注入改善了注入井的吸水能力。初步分析是所注入的微生物在油层中大量繁殖,其代谢产物(生物活性剂、有机酸等)有清蜡降粘和解除有机垢的作用,疏通了地层的注水渗流通道,因而使得注水压力降低。
4.2 油井出现增油降水效果
从1998年3月至1999年6月,已累计增油3941t,从效果变化情况看(着重分析西区),可分为三个阶段。
1998年3～12月,为驱油见效并持续上升阶段。西区对应的8口油井中有5口油井见效,8口井注菌前的三个月日产液112.3t,日产油47.0t,含水为58.1%,注菌后的9月日产液121.9t,日产油57.7t,含水52.7%,日增油10.7t,比注菌前增加了22.8%,含水下降5.4%。
1999年1～4月,为驱油效果降低阶段。日产油量下降到最低水平42.8t,含水上升到61.4%。分析原因是:微生物死亡率升高,活性降低;前期的微生物驱油疏通了地层内的堵塞区,注入的菌液在疏通带内迅速移至油井,未能在地层较好地发挥作用。
1999年5～6月,为驱油效果回升阶段。该阶段对整体方案进行修改,加大了中心井的注入强度,减少了边部注入井的注入强度;正南沙一段动态调配,使其与微生物驱油工作有机结合;对应油井微生物加药吞吐试验。日产油量回升到48.1t,含水下降至59.9%,增油降水效果在继续观察中。
4.3 产出液中见到注入菌
注菌后产出液中含有注菌前没有的孢子菌。注菌的正南6-14、正南8-16两口井的产出液氧培养均有气体产生,而注菌前厌养培养没有产生气体,由此可以判断这两口井监测到了注入的微生物细菌,产出液中细菌数目明显增加(表1)。
表1 产出液分析结果表
采样期采样情况平面培养厌养培养
注菌前
三个月
沙一段
混合样品
活菌数103cell/m L
主要是腐生菌,并
含有少量球菌
含SRB100cell/m L
注菌后
六个月
正南
6-14井
活菌数103～104cell/m L
主要是腐生菌,含
少量孢子菌
含SRB100～1000
cell/m L
产生气体
正南
6-16井
活菌数103cell/m L
主要是腐生菌,含
少量孢子菌和球菌
含SRB100
cell/m L产生
大量气体
4.4 原油的粘度有所下降
采出液原油的粘度随着注菌期的加长而降低。正南4-14、6-16、10-16三口井的原油粘度呈下降趋势,说明微生物的代谢产物对油层中的原油产生了作用,改善了流动性。
5 初步认识和结论
正南沙一段微生物驱油先导试验表明,微生物驱油可以起到增油降水、减缓递减的作用,并达到提高原油采收率的目的。
微生物生长繁殖的代谢产物,使原油乳化,降低了油水间的界面张力及原油粘度,提高了驱油效率;同时,微生物的代谢产物有疏通油水渗流通道的作用,可降低注水井的注入压力。
微生物驱油矿场试验初步表明,微生物驱油可提高采收率,若与注采调配等配合使用,可进一步改善驱油效果。
参考文献:
1 胡家俊.环境工程微生物学.北京:高等教育出版社,1998
2 姜继水,宋吉水.提高石油采收率技术.北京:石油工业出版社, 1999
本文编辑 刘北羿
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第8卷 第2期 王斌等:微生物驱油矿场试验及效果分析
The forecast of reas onable injectionΟproduction ratio in the whole area of Sazhong should adopt injectionΟproduction ratio and waterΟoil ratio method;in Sapu formation should adopt material balance method;in G aotaizi formation should adopt multielement regression method.The change rule of injectionΟproduction ratio in the future tw o or three years at assuming conditions(constant production,pres2 sure and ascending rate of water cut)can be obtained by predictive formula.The calculated results of mathematical m odel coincide with the matching results from injectionΟproduction ratio s oftware basically,it presents that the mathematical m odel built in this study is reliable.On the basis of theoretical analyses and calculations,the in flu2 ence of primary,secondary in fill adjustment wells and ba2 sic well pattern on each other is given,matching relation of water injection is determined,and the measures of rea2 s onable adjusting injectionΟproduction ratio and injectionΟproduction structure are proposed.It had g ood effect in production practice.
K ey w ords:formation pressure,waterΟoil ratio,injection Οproduction ratio,mathematical m odel,adjustment of in2 jectionΟproduction structure
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In order to know the changes in pore structure of reserv oir after waterflooding for many years,data from cored well Hu12Ο20before injection and data from inspection cham2 ber Hujian1after injection are analyzed and com pared. And the results of displacement test are researched com2 prehensively.It is found that the average throat diameter and throat median increase,the throat selectivity turns bad,the main flowing pore throat enlarges,and the quit efficiency decreases.This w ork provides basic data for im proving displacement efficiency and ultimate recovery. K ey w ords:throat,heterogeneity,quit efficiency,per2 meability
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V ol.8N o.2 Petroleum G eology and Recovery E fficiency:English Abstracts
课程编号： 《微生物学实验》教学大纲 学时数：108讲课：108 学制：四年制本科 适合专业：生物科学相关专业 一、本课程的性质和任务 （一）课程的性质： 微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有适应于从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。提高学生分析问题和解决问题的能力。根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题点样分析，并加以解决。 （二）课程的任务： 微生物学实验是生物学重要的基础课之一，要求学生熟悉微生物学方法与技术，掌握无菌操作技能和建立无菌概念是微生物学实验中最重要的内容，重点掌握最基本的无菌操作技能，如接种、纯培养、计数等。 二、本课程与其他课程的联系： 1. 通过教师示范、讲解与学生实际操作相结合方法，使学生牢固树立无菌概念，掌握显微镜的使用、生物染色技术、形态学观察的方法、微生物计数、培养基的配置和灭菌方法、微生物分离、纯化等基本操作技能，基本了解常用的仪器设备的基本原理、构造、使用方法及使用中的注意事项，树立严谨求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力，培养勤俭节约、爱护公物和相互协作的优良作风。 2. 本实验课内容包括验证性实验、综合性实验两个部分。验证性实验主要
通过光学显微镜镜检观察方法进行教学，综合实验在教师指导下学生根据所掌握的理论基础和实验技能，由学生自己动手完成。实验过程要求学生仔细观察实验现象，完整记录原始实验数据、结果，分析实验现象并认真填写实验报告。 三、教学内容 （一）实验一实验室安全教育与微生物学实验室常用的器皿 目的要求 掌握实验室安全规则，了解微生物学实验所用的器皿，因其大多要进行消毒、灭菌和用来培养微生物，因此了解其质量、洗涤和包装方法的要求。 实验内容 一、器皿的种类、要求与应用： 1、试管 大试管(约18mm×180mm) :可装倒平板用的培养基；可作制备斜面用；装液体培养基用于微生物的振荡培养 中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用；用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 2、容量瓶 主要用于准确配制一定浓度的溶液，它是一种细长颈、梨形的平底玻璃瓶，配有磨口塞，瓶颈上刻有标线。 3、量筒 用来量取液体体积的一种玻璃仪器，外壁上有刻度。常用量筒的规格有5ml、10ml、25ml、50ml、100ml、250ml等。 4、三角瓶 用来装无菌水、培养基和振荡培养微生物等。 5、烧杯 呈圆柱形，顶部的一侧开有一个槽口，便于倾倒液体，有些烧杯外壁标有刻度，可以粗略地估计烧杯中液体的体积，这种烧杯叫印标烧杯，也叫刻度烧杯，其分度并不十分精确，允许误差一般在±5%。 6、烧瓶 通常具有圆肚细颈的外观，因瓶口很窄，不适用玻璃棒搅拌，若需要搅拌时，
中国海洋大学本科生课程大纲 课程属性：公共基础/通识教育/学科基础/专业知识/工作技能，课程性质：必修、选修 一、课程介绍 1.课程描述： 随着各种环境问题的日趋严重，微生物实验技术在环境领域得到广泛应用和迅速发展，为人们改造环境和保护环境提供重要的技术手段。本课程以环境工程领域常用的微生物实验技术的教学为主要内容，并以具体的环境问题为依托，使学生掌握专业知识在实践中的应用，提升学生的实践技能。 Microbiology experimental technology has been widely used and rapidly developed in the environmental field with the increasingly serious environmental problems. It plays an important role in transforming the environment and protecting the environment. The main teaching contents of the course are the common microbiology experimental technologies in various environmental issues. The course will enable students to master the professional skills. 2.设计思路： 本课程主要学习和掌握环境领域常用的微生物实验技术，了解其在环境保护和环境改造过程中的实践应用及其重要作用。课程内容的设置注重实用性和可操作性，分为基础实验部分和综合实验部分。基础实验部分以常用微生物实验技术的学习为重点，并注重实验内容的系统性和连贯性；综合实验部分以具体环境问题为依托，进行微生物实 - 7 -
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
环境工程微生物学讲义 本课程是环境学院各专业学生的专业基础课；与另一门课《环境微生物学实验》相结合，构成一个完 整的体系；本课程强调每个学生要动手，通过实验，加深对讲课内容的理解和记忆；本课程内容分两大部分：一是微生物学的基础知识；二是微生物学在环境领域中的应用。 绪论 主要内容： 环境微生物学的研究对象和任务研究对象研究任务微生物学概述微生物的定义微生物的特点原核微生物与真核微生物微生物的命名与分类第一节环境工程微生物学的研究对象和任务一、环境微生物学的研究对象定义：环境微生物学是研究与环境领域（包括环境工程、给水排水工程）有关的微生物及其生命活动 规律。?其内容包括：微生物个体形态、群体形态；细胞结构功能、生理特性、生长繁殖、遗传变异 等；微生物与环境的关系（尤其是微生物与污染环境之间的关系）；微生物对物质的转化分解作用（特 别是应用微生物来处理各种污染物质，如废水、废气和固体废弃物）。二、环境工程微生物学的研究任务 总的归纳起来有两大方面的任务： （1）防止或消除有害微生物 （2）充分利用有益的微生物资源 三、微生物在环境污染治理（水处理）中的应用
１）在环境监测方面（水污染的监测） 利用在环境中生存的生物的种类、数量、活性等特征，来判断环境状况的好坏。这些生物称为指示生 物。 生物监测的优缺点： 生物监测的主要优越性： (a)长期性——汇集了生物在整个生活时期中环境因素改变的情况，可以反映 当地的环境变化； (b)综合性——能反映环境诸因子、多成分对生物有机体综合作用的结果； (c)直观性——直接把污染物与其毒性联系起来； (d)灵敏性——有时甚至具有比精密仪器更高的灵敏性，有助于提早发现环境 污染。生物监测的主要缺点： (a)定量化程度不够； (b)需要一定的专业知识和经验。 ２）在环境治理方面 包括水、大气、固体废弃物处理方面其中特别在水处理方面，有着大量成功应用的例子。 第二节微生物概述一、微生物的定义 微生物是指所有形体微小，用肉眼无法看到，须借助于显微镜才能看见的，单细胞或个体结构简单的 多细胞，或无细胞结构的低等生物的统称。 Too small to be seen with naked eyes 二、微生物的特点
山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物 大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测 微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每 格长0.01mm（即10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于 矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有 等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以 测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大 倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺 测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放 大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物 细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直 径约为0.8μm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接 计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻 片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。 后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间 的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除 了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法， 此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
实验三环境微生物的检测 一、实验目的 1.了解周围环境中微生物的分布情况。 2.懂得无菌操作在微生物实验中的重要性。 3.了解四大类微生物的菌落特征。 二、实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。土壤、江河湖海、尘埃、空气、各种物体的表面以及人和动物体的口腔、呼吸道、消化道等都存在着各种微生物。由于它们体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。但是只要稍加留意，我们就可以在发霉的面包、朽木上看到某些微生物群体。这些现象表明，自然界只要有微生物可以利用的物质和环境条件，微生物就可以在其上生长繁殖。据此，我们在实验室里就可以用培养基来培养微生物。 培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行灭菌。所谓灭菌是指采用各类的物理或化学因素，使物体内外的所有微生物丧失其生长繁殖能力的措施。经过灭菌后的物体是无菌的。消毒是与灭菌完全不同的概念，它是指用较温和的物理因素杀死物体表面和内部病原微生物的一种常用的卫生措施。 灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在1.05kg/cm2的蒸汽压力下，温度可达121℃。一般只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本操作技术。为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。
年级：2009 专业：医学检验班级：一班姓名：赵富海学号：2009221792 实验八、细菌的药物敏感试验 【K-B法】 菌种（均为幼龄菌）：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠埃希菌1.5×108/ml 药物纸片：青霉素、庆大霉素、新诺明、环丙沙星 方法： 1.涂菌（棋盘划线法），室温放10min； 2.贴药敏纸片，注意间距（大于24mm）和边距（大于15mm）； 3.置35℃24h判读结果。 结果如图所示： 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果 实验结论：金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，对庆大霉素、新诺明、环丙沙星敏感。 【试管稀释法】 菌种：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠b1.5×108/ml 抗生素：庆大霉素32u/ml 方法： 1.对倍稀释抗生素
2.加菌液0.1ml/管，摇均35℃16—18h 3.判读MIC 试验操作如下图所示： 注意:设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管) 结果判断: 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC. 如图： 实验结论：MIC=原药物浓度(32u/ml) ×稀释倍数(1:24)=2u/ml 【联合药敏试验】（示教） 金黄色葡萄球菌大肠b 结果判断： 金黄色葡萄球菌联合药敏试验结果判读：
①青+链=青单+链单→相加作用 ②青+红=青单+红单→相加作用 ③青+万=青单+万单→相加作用 ④青+林＞青单+林单→协同作用 大肠b联合药敏试验结果判读： ①青+红=青单+红单→相加作用 ②青+链=青单+链单→相加作用 ③青+林=青单或林单→无关作用 ④青+南＞青单+南单→协同作用 【实验讨论】 1．K-B法原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC 愈小。 2. K-B法影响因素 ①培养基的质量，如PH、深度、硬度和表面湿度等； ②药敏纸片的质量，含药量和保存方式； ③接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，取决于比浊标准的配制，正确使用和保存； ④试验操作质量：接种细菌后贴片时5~15分钟； ⑤孵育条件，温度和时间：培养时间16~18h,不要超过24h。 3．稀释法原理： 以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。 4. 稀释法影响因素：培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本试验的结果。 5．抗生素药物敏感性试验（AST）的意义 ①可预测抗生素治疗的效果，既AST试验结果为“敏感”时，治疗可能有效；试验结果为“耐药”时，使用该药物治疗肯定失败； ②指导临床医生选择使用抗生素，AST的结果往往在给予病人经验性治疗24~48h之后，若AST结果为“敏感”，该治疗为有效，若结果为“耐药”，即应更换药物； ③提供所选择药物的依据； ④监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病的流行病学，控制和预防耐药菌感染的发生和流行。 6．通过此次实验掌握纸片扩散法（K-B法）、试管稀释法的原理、操作方法、结果的判读及其临床意义，并掌握联合药敏试验结果的观察、判断。
微生物学实验报告格式 专业学号 姓名 实验一、???培养基的配制和高压蒸汽灭菌 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量） 四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？ 实验二自生固氮菌的分离纯化 （这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。） 一、实验目的
二、实验原理 三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤） 五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？ 实验三平板培养测数法 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出） 四、实验步骤（详叙相关步骤） 五、实验结果 六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点） 七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？
2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。 实验四简单染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态） 六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？ 实验五革兰氏染色 一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿） 四、实验步骤 五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？） 六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？
环境微生物学实验报告 一、实验目的 （1）了解普通光学显微镜的构造及原理，掌握显微镜的操作及保养方法。（2）观察、识别几种原核微生物。真核微生物的个体形态，学会生物图的绘制。 二、实验器皿与材料 （1）器皿：显微镜、擦镜纸、二甲苯。 （2）材料：示范片：细菌三形（球状、杆状、螺旋状）、弧状（硫酸盐还原菌）、丝状（浮游球衣菌等）、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颤蓝细菌、微囊蓝细菌或念珠蓝细菌等。 三、实验步骤 （1）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中央。（2）将镜头换成低倍镜，将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜。当物镜的尖端距离载玻片约0.5cm 处时停止旋转。 （3）左眼对着目镜观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，直至目的物清晰。此时找到目的物并移至中央。（4）换成高倍镜，观察目的物，旋转细调节钮，直至视野清晰。（5）观察示范片，绘出其形态图。 四、思考题 （1）使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？答：为了
找到目的物并移动到中央。 （2）要使视野明亮，除采用光源外，还可采取哪些措施？ 答：调大孔径光阑，调整光源。如果是用反光镜的显微镜，用凹面镜可使视野明亮。 五、生物图 实验二、微生物培养基的配制与灭菌 一、实验目的 （1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 （2）了解配置微生物培养基的基本原理，掌握配置、分装培养基的方法。（3）学会各类物品的包装、配置（稀释水等）和灭菌技术。 二、实验器皿与材料 （1）实验器皿：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、两桶、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、pH试纸和棉花等。 （2）材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等。 三、实验原理 培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配置而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。由于微生物种类及代谢类型
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
微生物学实验报告 实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察 第一部分：显微镜的使用 一、目的要求 1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。 2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。 3．了解各种显微镜的主要特征。 二、实验原理 （一）光学显微镜的构造 微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。 1、机械部分 普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。 2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。 （二）放大倍数 标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。 显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。 R=0.61λ/N.A 式中：R-----分辨距离； λ------作用光的波长； N.A------数值口径。 一些介质的折射率
介质折射率 空气 水玻璃香柏油 1 13 55 1.56 三、实验内容 （一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。 （二）方法： 细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法： 1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。 2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。 3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。 4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中（6）项处理。 5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形， 以免与聚光器发生碰撞。 四、思考题 1、使用显微镜时为何调节下列构造？反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。 答：聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。 2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。如何利用这一原理用好显微镜？ 答：物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短。标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质？油镜的原理是什么？ 答：香柏油只在使用油镜头时（100倍物镜）使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
南京大学生物技术系实验报告 题目放线菌、酵母菌和霉菌的形态观察 【一、实验目的】 1、通过菌落及细胞形态的观察和比较，掌握区分细菌、放线菌、酵母菌和霉 菌的要点。 2、掌握观察放线菌孢子的方法。 3、掌握观察霉菌孢子及根霉假根的方法。 4、了解酵母菌子囊孢子形成的方法。 【二、实验原理】 1、三类微生物菌落形态特征： 霉菌形态比细菌、酵母菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。霉菌营养体的基本形态单位是菌丝，包括有隔菌丝和无隔菌丝。营养菌丝分布在营养基质的内部，气生菌丝伸展到空气中。营养菌丝体除基本结构以外，有的霉菌还有一些特化形态，例如假根、匍匐菌丝、吸器等。霉菌的繁殖体不仅包括无性繁殖体，例如分生孢子，孢子囊等，包裹其内或附着其上的有各类无性孢子；还包括有性繁殖结构，例如子囊果，其内形成有性孢子。在观察时要注意细胞的大小，菌丝构造和繁殖方式。 放线菌一般由分枝状菌丝组成，它的菌丝可分为基内菌丝(营养菌丝)、气生菌丝或有孢子丝三种。放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、波曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴定的重要依据。 酵母菌是单细胞的真核微生物，细胞核和细胞质有明且分化，个体比细菌大得多。酵母菌的形态通常有球状、卵园状、椭圆状、柱状或香肠状等多种。酵母菌的无性繁殖有芽殖、裂殖和产生掷孢子；酵母菌的有性繁殖形成子囊和子囊孢子。酵母菌母细胞在一系列的芽殖后，如果长大的子细胞与母细胞并不分离，就会形成藕节状的假菌丝。 2、三点接种法与霉菌菌落形态的观察 霉菌的菌落形态是分类鉴定的重要依据。为便于观察，通常用接种针挑
水处理微生物学实验指导书 班级 姓名 学号 市政与环境工程学院 年月
目录 实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察实验二革兰氏染色技术 实验三培养基的配制和灭菌 实验四水中细菌总数的测定
实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察 一、实验目的与要求 （1）了解普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。 （2）观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。 （1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，