1 冷冻电镜发展背景
人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。
日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。
人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。
2 冷冻电镜发展过程及分类
2.1 冷冻电镜发展过程
冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy）是在20世纪70年代提出的，早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。到了20世纪90年代，随着冷冻传输装置、场发射电子枪以及CDD成像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现。21世纪初，冷冻电镜技术进一步发展，利用三维重构技术获得了二十面体病毒的三维结构，但此时冷冻电镜的分辨率水平依然没有得到突破，这限制了冷冻电镜在生物大分子领域的应用，虽然冷冻电镜和X射线晶体学、核磁共振被称作结构生物学研究的三大利器，但不得不承认冷冻电镜是三者当中最弱的一种技术手段，在现在已解析的一千多种膜蛋白结构当中，90%以上都采用的是X射线晶体学方法，核磁共振在小分子量的蛋白结构解析中也发挥了重要的作用，而冷冻电镜在蛋白结构解析当中所起的作用微乎其微。
然而2013年12月5日，美国加州大学旧金山分校副教授程亦凡与同事David Julius两个实验室合作，采用单电子计数探测器，以近原子分辨率（3.4埃），确定了在疼痛和热知觉中起中心作用的一种膜蛋白TRPV1的结构，这一振奋人心的成果让研究人员们开始重新审视冷冻电镜在结构生物学研究中的所能发挥的作用。毕竟和X射线晶体学方法相比，它所需的样品量很少，也无需生成晶体，这对于一些难结晶的蛋白质的研究带来了新的希望。蛋白质TRPV1结构的确定标志着冷冻电镜正式跨入“原子分辨率”时代。
2.2 冷冻电镜分类
目前我们讨论的冷冻电镜基本上指的都是冷冻透射电子显微镜，但是如果我们以使用冷冻技术的角度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以分为冷冻透射电子显微镜、冷冻扫描电子显微镜、冷冻蚀刻电子显微镜。
2.2.1 冷冻透射电子显微镜
冷冻透射电镜（Cryo-TEM）通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮温度（77K），用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。
一台冷冻透射电镜的价格在600万美元左右，价格极其昂贵，它的优点主要体现在以下几个方面：第一是加速电压高，电子能穿透厚样品；第二是透镜多，光学性能好；第三是样品台稳定；第四是全自动，自动换液氮，自动换样品，自动维持清洁。
图2.1 冷冻透射电镜及冷冻电镜下高分辨病毒的三维重构图
2.2.2 冷冻扫描电子显微镜
扫描电镜工作者都面临着一个不能回避的事实，就是所有生命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。很多动植物组织的含水量达到98%，这是扫描电镜工作者最难对付的样品问题。
冷冻扫描电镜（Cryo-SEM）技术是克服样品含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。这种技术还被广泛地用于观察一些“困难”样品，如那些对电子束敏感的具有不稳定性的样品。各种高压模式如VP、LV和ESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和干燥的样品。但是，冷冻扫描电镜仍然是防止样品丢失水分的最有效方法，它能应用于任何真空状态，包括装于SEM的Peltier台以及向样品室内冲以水汽的装置。冷冻扫描电镜还有一些其他优点，如具有冷冻断裂的能力以及可以通过控制样品升华刻蚀来选择性地去除表面水分（冰）等。冷冻电镜基本的观测流程如下图2.2所示：
图2.2 低温扫描电镜样品制备及观测流程
2.2.3 冷冻蚀刻电子显微镜
冷冻蚀刻（Freeze-etching）电镜技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，亦称冷冻断裂（Freeze-fracture）或冷冻复型（Freeze-replica），用于细胞生物学等领域的显微结构研究。
冷冻蚀刻电镜的优点：①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态；②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。
缺点：冷冻也可造成样品的人为损伤；断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。
目前，冷冻蚀刻装置的型号很多，但主要分为两种类型：一种是专用冷冻蚀刻装置，如EIKO公司生产的FD-2A型、FD-3型，BALZERS公司生产的BAF300型；另一种是真空喷镀仪的冷冻蚀刻附件，如日立公司生产的HFZ-1型，它与FE-1型加温蚀刻装置一起安装在HUS-5型真空喷镀仪中使用。以上两种类型各有优缺点，专用装置优点在于操作方便，能连续制样，效率高。缺点是价格贵；附件装置价格虽便宜，但不能连续操作，效率低。利用冷冻蚀刻电镜技术观察到的红细胞如图2.3所示。
图2.3 红细胞冷冻电镜蚀刻图
3 冷冻电镜原理
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤（图3.1）。在透射电子显微镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜
内部运动，根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理，透射电子显微镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，最后在记录介质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。
图3.1 冷冻电子显微学解析结构基本步骤
图3.2 冷冻电子显微学原理示意图
透射电子显微镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968 年，Aron Klug发现中心截面定理（图3.3），提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理，利用透射电子显微镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。
图3.3 中心截面定理
在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。
3.1 电子晶体学
利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构（晶体）成像或者收集衍射图样，进而解析这些生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。其适合的样品分子量范围为10~500kD，最高分辨率约1.9?。该方法与X射线晶体学的类似之处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图像来进行结构解析。
3.2 单颗粒技术
对分散分布的生物大分子分别成像，基于分子结构同一性的假设，对多个图像进行统计分析，并通过对正、加和平均等图像操作手段提高信噪比，进一步确认二维图像之间的空间投影关系后经过三维重构获得生物大分子的三维结构方法（图3.4）。其适合的样品分子量范围为80~50MD，最高分辨率约3?。利用单颗粒技术获得三维重构的方法主要包括等价线方法、随机圆锥重构法、随机初始模型迭代收敛重构等方法，其基本目标是获得二维图像之间正确的空间投影关系，从而进行三维重构。
图3.4 单颗粒重构技术原理
3.3 电子断层扫描成像技术
通过在显微镜内倾转样品从而收集样品多角度的电子显微图像并对这些电子显微图像根据倾转几何关系进行重构的方法称为电子断层扫描成像技术（图3.5）。该方法主要应用于细胞及亚细胞器，以及没有固定结构的生物大分子复合物（分子量范围为800kD），最高分辨率约20?。
图3.5 电子断层扫描成像技术原理
实用标准文案 冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾 1、电子显微镜成像技术的发展历史 （1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）： 该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。 （2）上世纪60年代的三维重构技术 三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。 在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。 （3）上世纪70年代的电子晶体学 即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。 在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）
主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液精彩文档． 实用标准文案 中相同，呈天然状态。因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。 2、冷冻电镜技术介绍 （1）关于玻璃态冰： 冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟10摄氏度。4此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。（2）操作步骤概要： 冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求： 应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A，明显超过最适剂2量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。 因此，必须采用低剂量技术（≤20e/A），用1k~3k倍的低倍镜寻找，在目 2标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（1s左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。 二、课外补充学习：冷冻电镜技术难点的扩展阅读
1 冷冻电镜发展背景 欧阳学文 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目
前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。 2 冷冻电镜发展过程及分类 2.1 冷冻电镜发展过程 冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy）是在20世纪70年代提出的，早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。到了20世纪90年代，随着冷冻传输装置、场发射电子枪以及CDD成像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现。21世纪初，冷冻电镜技术进一步发展，利用三维重构技术获得了二十面体病毒的三维结
1 冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。
4、冰冻蚀刻法。所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 和投射电子显微镜是靠透过物体的电子成像不同，扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射的电子。扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描。电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 1 冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子
冷冻电镜技术课程学习报告 一、课程所讲基础知识回顾 1、电子显微镜成像技术的发展历史 （1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）： 该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。 （2）上世纪60年代的三维重构技术 三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。 在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。 （3）上世纪70年代的电子晶体学 即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。 在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。 （4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm） 主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液中相同，呈天然状态。因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。 2、冷冻电镜技术介绍 （1）关于玻璃态冰： 冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。 （2）操作步骤概要： 冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构 （3）图像采集的质量要求： 应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A2，明显超过最适剂量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。 因此，必须采用低剂量技术（≤20e/A2），用1k~3k倍的低倍镜寻找，在目标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（1s左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。 二、课外补充学习：冷冻电镜技术难点的扩展阅读 1、冰晶污染 冰晶污染是冷冻电镜的主要问题和最重要的难点，可发生在冷冻电镜的各个
冷冻电镜简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
1冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子 （<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。
技术应用 Technical application ·100· 中国高新科技 2019 年第39期 直，要尽量将焦距对准。 （3）对温感进行设置，可先借助自动模式对温度范围进行测量，再通过手动方式对水平及跨度进行设置，设置最小的温度范围。 （4）无人机对成像系统进行搭载，要配备电量充足的电池，确保续航时间。 3 相关案例 某大型光伏电站采用无人机红外热斑检测。该站主要采用多晶硅光伏组件，工作人员在现场对检测区域进行确定，并抽选16排光伏组件。随后，对无人机自动巡检具体路线进行设定，抽选的16排光伏组件具有2MW容量，检测所用时间为10min，后续采用相关软件对检测结果实施科学分析，并生成相应的检测报告。 对检测结果进行对比分析，发现16排抽检的光伏组件中，有2块组件存在热斑，分别是位于第5组串第11排，从西向东数第11列的1#组件，该组件温度达到28℃，组件局部温度甚至达到42℃，高出组件温度14℃，因此，判定该组件存在热斑。第7组串第11排，从西向东数第7列的2#组件，该组件温度达到28℃，组件局部温度甚至达到42.8℃，高出组件温度14.8℃，因此，判定该组件存在热斑。 4 结语 综上所述，大型光伏电站极易发生热斑故障。热斑故障会减少大 型光伏电站的发电量，并严重影响光伏电站运行的安全性和稳定性。无人机红外热斑检测在大型光伏电站中的应用，能大幅度减少热斑检测成本，增强热斑检测的精确性，大幅度提高热斑检测效率。因此，要加强无人机红外热斑检测在大型光伏电站中的推广应用。 [1]车曦．基于红外图像识别的光伏组件热斑故障检测方法研究[D]．重庆：重庆大学，2015． [2]桑轩昂．无人机红外热斑检测在光伏电站中的应用[J ]．产业与科技论坛，2017（9）：66-67． （作者系三峡新能源西南分公司工程师） 冷冻电镜技术在线粒体中的应用研究 0 引言 线粒体在生物体生命生活中发挥着极为重要的作用，是有氧呼吸的主要场所，为生物细胞提供新陈代谢必需的能量。线粒体有着自身的遗传体系和遗传物质，参与细胞分化、细胞信息物质传递及诱导细胞凋亡等过程，从而直接或间接地调控细胞周期。与此同时，线粒体在生理功能的内稳态方面也发挥 着重要作用，如果这些生理功能出现了障碍，则会引发诸多疾病。如糖尿病、癌症及遗传线粒体疾病，分别由能量转运系统的功能障碍、细胞凋亡调节的缺失及线粒体DNA 的突变引起。众多关键的生理功能使得线粒体成为引人瞩目的药物靶点，线粒体既可以作为主要药理学靶点，通过直接的药物相互作用产生生理效应，抗氧化药物、抗肿瘤 药物互作等，也可以作为次要靶位与药物作用后产生毒副作用。由此可见，线粒体功能结构十分复杂，已有的研究成果主要集中在功能学及动力学方面，更深层次理解其功能发挥过程则需要微观结构的解析工作。近年来，冷冻电镜技术飞速发展，在结构生物学中发挥着关键作用，也为线粒体生理活动的深入研究提供了新的方向。