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·科学
李忠东编译
2017年10月4日，2017年度诺贝尔化学奖授予了英国分子生物学家及生物物
理学家理查德·亨德森、美国哥伦比亚大学德裔生物物理学家约阿基姆·弗兰克以及瑞士洛桑大学生物物理学家雅克·迪波什。获奖理由是“开发出冷冻电子显微镜技术（也称为低温电子显微镜技术）用于确定溶液中的生物分子的高分辨率结构”，简化了生物细胞的成像过程，提高了成像质量。
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实用标准文案 冷冻电镜技术课程学习报告一、课程所讲基础知识回顾 1、电子显微镜成像技术的发展历史 （1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）： 该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。 （2）上世纪60年代的三维重构技术 三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。 在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。 （3）上世纪70年代的电子晶体学 即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。 在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。（4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm）
主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液精彩文档． 实用标准文案 中相同，呈天然状态。因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。 2、冷冻电镜技术介绍 （1）关于玻璃态冰： 冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟10摄氏度。4此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。（2）操作步骤概要： 冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构（3）图像采集的质量要求： 应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A，明显超过最适剂2量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。 因此，必须采用低剂量技术（≤20e/A），用1k~3k倍的低倍镜寻找，在目 2标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（1s左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。 二、课外补充学习：冷冻电镜技术难点的扩展阅读
透射电子显微镜的原理及应用 一．前言 人的眼睛只能分辨1/60度视角的物体，相当于在明视距离下能分辨0.1mm 的目标。光学显微镜通过透镜将视角扩大，提高了分辨极限，可达到2000A 。。光学显微镜做为材料研究和检验的常用工具，发挥了重大作用。但是随着材料科学的发展，人们对于显微镜分析技术的要求不断提高，观察的对象也越来越细。如要求分表几十埃或更小尺寸的分子或原子。一般光学显微镜，通过扩大视角可提高的放大倍数不是无止境的。阿贝（Abbe ）证明了显微镜的分辨极限取决于光源波长的大小。在一定波长条件下，超越了这个极限度，在继续放大将是徒劳的，得到的像是模糊不清的。 图1-1（a ）表示了两个点光源O 、P 经过会聚透镜L ，在平面上形成像O ，、P ，的光路。实际上当点光源透射会聚成像时，由于衍射效应的作用在像平面并不能得到像点。图1-1（b ）所示，在像面上形成了一个中央亮斑及周围明暗相间圆环所组成的埃利斑（Airy ）。图中表示了像平面上光强度的分布。约84%的强度集中在中央亮斑上。其余则由内向外顺次递减，分散在第一、第二……亮环上。一般将第一暗环半径定义为埃利斑的半径。如果将两个光源O 、P 靠拢，相应的两个埃利斑也逐渐重叠。当斑中心O ，、P ，间距等于案例版半径时，刚好能分辨出是两个斑，此时的光点距离d 称为分辨本领，可表示如下： α λs in 61.0d n = （1-1） 式中，λ为光的波长，n 为折射系数，α孔径半角。上式表明分辨的最小距离与波长成正比。在光学显微镜的可见光的波长条件下，最大限度只能分辨2000A 。。于是，人们用很长时间寻找波长短，又能聚焦成像的光波。后来的X
1 冷冻电镜发展背景 欧阳学文 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目
前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。 2 冷冻电镜发展过程及分类 2.1 冷冻电镜发展过程 冷冻电子显微镜技术（cryoelectron microscopy）是在20世纪70年代提出的，早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，首次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。到了20世纪90年代，随着冷冻传输装置、场发射电子枪以及CDD成像装置的出现，冷冻电镜单颗粒技术出现。21世纪初，冷冻电镜技术进一步发展，利用三维重构技术获得了二十面体病毒的三维结
第六部分高分辨电镜的成像原理 及在材料科学中应用 6.1 高分辨电镜图像的类型 通过高分辨电镜得到的图像通常称为晶格像，这些图像中可以带给研究者的信息大不相同，主要是由于成像条件不同，以及样品厚度不同。了解这些影响因素才有利于研究者控制成像条件，获取研究所需要的有用信息。高分辨电镜图像可分为：晶格条纹；一维结构图像；二维晶格条纹；二维结构图像。 1)晶格条纹（lattice fringes） 晶格条纹像的成像条件没有严格限制，只要有两列电子波干涉成像即可，不要求对准晶带轴，在很宽的离焦条件和不同样品厚度下都可以观察到，所以很容易获得。在实际观测到的纳米颗粒（图6-1a）、微小第二相析出大都是晶格条纹像。这种图像只能用于观察对象的尺寸、形态，区分非晶态和结晶区，不能得出样品晶体结构相关的信息，不可模拟计算。尽管如此，当与材料制备加工的条件相结合，仍然可以有助研究分析。 2)一维结构图像(one-dimension structure images) 一维结构图像与晶格条纹像不同之处在于，成像时转动样品得到对应观察区域的一维衍射斑（图6-2），因此可以结合衍射斑和晶体结构模型来对观察区域的一维结构进行分析。在研究层错一位结构图像很有用。 图6-1a 纳米金颗粒的晶格条纹像
图6-2 一维结构图像 3)二维晶格像（two-dimensional lattice image） 大部分文献中出现的都是二维晶格像，此时晶体的某一晶带轴平行于入射电子束，因此相应的衍射花样对应晶胞的衍射谱。在不同的欠焦量下和样品厚度均可以获得二维晶格像，这是其大量出现的原因，也被广泛用于材料科学的研究中，用于获得位错、晶界、相界、析出、结晶等信息。要注意的是二维晶格像的花样是随着欠焦量、样品厚度以及光阑尺寸改变的，不能简单指定原子的位置。在不确定的成像条件下不能得到晶体的结构信息，可以计算模拟辅助分析。 4)二维结构图像(two-dimension structure images) 二维结构图像是严格控制条件下的二维晶格像，首先样品要很薄（小于10 nm），避免多次散射的不利影响；其次要使晶体的晶带轴严格平行于入射电子束；成像时欠焦量是控制（已知）的，通常最佳欠焦条件(Scherzer focus)下的图像衬度最大。尽管如此，晶体结构和原子位置并不能简单从图像上“看到”，欠焦量和样品厚度依然控制着晶格相的亮暗分布。 需要采用计算机辅助的图像模拟分析技术，才可能确定晶体结构以及原子位置。
1 冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。
透射电子显微镜的现状与展望 透射电子显微镜方面主要有：高分辨电子显微学及原子像的观察，像差校正电子显微镜，原子尺度电子全息学，表面的高分辨电子显微正面成像，超高压电子显微镜，中等电压电镜，120kV，100kV分析电镜，场发射枪扫描透射电镜及能量选择电镜等，透射电镜将又一次面 临新的重大突破；扫描电子显微镜方面主要有：分析扫描电镜和X射线能谱仪、X射线波谱仪和电子探针仪、场发射枪扫描电镜和低压扫描电镜、超大试样室扫描电镜、环境扫描电镜、扫描电声显微镜、测长／缺陷检测扫描电镜、晶体学取向成像扫描电子显微术和计算机控制扫描电镜等。扫描电镜的分辨本领可望达到0.2—0.3nm并观察到原子像。 电子显微镜(简称电镜，EM)经过五十多年的发展已成为现代科学技术中不可缺少的重要工具。我国的电子显微学也有了长足的进展。电子显微镜的创制者鲁斯卡(E.Ruska)教授因而获得了1986年诺贝尔奖的物理奖。电子与物质相互作用会产生透射电子，弹性散射电子，能量损失电子，二次电子，背反射电子，吸收电子，X射线，俄歇电子，阴极发光和电动力等等。电子显微镜就是利用这些信息来对试样进行形貌观察、成分分析和结构测定的。电子显微镜有很多类型，主要有透射电子显微镜(简称透射电镜，TEM)和扫描电子显微镜(简称扫描电镜，SEM)两大类。扫描透射电子显微镜(简称扫描透射电镜，STEM)则兼有两者的性能。 为了进一步表征仪器的特点，有以加速电压区分的，如：超高压(1MV)和中等电压(200— 500kV)透射电镜、低电压(～1kV)扫描电镜；有以电子枪类型区分的，如场发射枪电镜；有以用途区分的，如高分辨电镜，分析电镜、能量选择电镜、生物电镜、环境电镜、原位电镜、测长CD-扫描电镜；有以激发的信息命名的，如电子探针X射线微区分析仪(简称电子探针，EPMA)等。半个多世纪以来电子显微学的奋斗目标主要是力求观察更微小的物体结构、更细小的实体、甚至单个原子，并获得有关试样的更多的信息，如标征非晶和微晶，成分分布，晶粒形状和尺寸，晶体的相、晶体的取向、晶界和晶体缺陷等特征，以便对材料的显微结构进行综合分析及标征研究。近来，电子显微镜(电子显微学)，包括扫描隧道显微镜等，又有 了长足的发展。下面见介绍部分透射电镜和扫描电镜的主要性能 1.高分辨电子显微学及原子像的观察 材料的宏观性能往往与其本身的成分、结构以及晶体缺陷中原子的位置等密切相关。观察试样中单个原子像是科学界长期追求的目标。一个原子的直径约为1千万分之2—3mm。 因此，要分辨出每个原子的位置需要0.1nm左右的分辨本领，并把它放大约1千万倍。70年
新一代电子显微镜的发展趋势及应用 特点 微观结构专业组 新一代电子显微镜的发展趋势及应用特点 一、高性能场发射枪电子显微镜日趋普及和应用。 场发射枪透射电镜能够提供高亮度、高相干性的电子光源。因而能在原子--纳米尺度上对材料的原子排列和种类进行综合分析。九十年代中期，全世界只有几十台；现在已猛增至上千台。我国目前也有上百台以上场发射枪透射电子显微镜。 常规的热钨灯丝（电子）枪扫描电子显微镜，分辨率最高只能达到 3.0nm；新一代的场发射枪扫描电子显微镜，分辨率可以优于 1.0nm；超高分辨率的扫描电镜，其分辨率高达0.5nm-0.4nm。其中环境描电子显微镜可以做到：真正的“环境”条件，样品可在100%的湿度条件下观察；生物样品和非导电样品不要镀膜，可以直接上机进行动态的观察和分析；可以“一机三用”。高真空、低真空和“环境”三种工作模式。 二、努力发展新一代单色器、球差校正器，以进一步提高电子显微镜的分辨率。 球差系数:常规的透射电镜的球差系数Cs约为mm级；现在的透射电镜的球差系数已降低到Cs<0.05mm.色差系数:常规的透射电镜的色差系数约为0.7；现在的透射电镜的色差系数已减小到0.1。 场发射透射电镜、STEM技术、能量过滤电镜已经成为材料科学研究,甚至生物医学必不可少的分析手段和工具. 物镜球差校正器把场发射透射电镜分辨率提高到信息分辨率.即从0.19nm 提高到0.12nm甚至于小于0.1nm.
利用单色器，能量分辨率将小于0.1eV.但单色器的束流只有不加单色器时的十分之一左右.因此利用单色器的同时,也要同时考虑单色器的束流的减少问题。 聚光镜球差校正器把STEM的分辨率提高到小于0.1nm的同时,聚光镜球差校正器把束流提高了至少10倍,非常有利于提高空间分辨率。 在球差校正的同时，色差大约增大了30%左右.因此,校正球差的同时,也要同时考虑校正色差. 三、电子显微镜分析工作迈向计算机化和网络化。 在仪器设备方面，目前扫描电镜的操作系统已经使用了全新的操作界面。用户只须按动鼠标，就可以实现电镜镜筒和电气部分的控制以及各类参数的自动记忆和调节。 不同地区之间,可以通过网络系统，演示如样品的移动，成像模式的改变,电镜参数的调整等。以实现对电镜的遥控作用. 四、电子显微镜在纳米材料研究中的重要应用。由于电子显微镜的分析精度逼近原子尺度，所以利用场发射枪透射电镜，用直径为0.13nm的电子束，不仅可以采集到单个原子的Z-衬度像，而且还可采集到单个原子的电子能量损失谱。即电子显微镜可以在原子尺度上可同时获得材料的原子和电子结构信息。观察样品中的单个原子像，始终是科学界长期追求的目标。一个原子的直径约为1千万分之 2-3mm。所以，要分辩出每个原子的位置，需要0.1nm左右的分辨率的电镜，并把它放大约1千万倍才行。人们预测，当材料的尺度减少到纳米尺度时，其材料的光、电等物理性质和力学性质可能具有独特性。因此，纳米颗粒、纳米管、纳米丝等纳米材料的制备，以 及其结构与性能之间关系的研究成为人们十分关注的研究热点。 利用电子显微镜，一般要在200KV
4、冰冻蚀刻法。所谓冰冻蚀刻，是把样品放在-196℃的液态氮中迅速冷冻，然后加温到-100℃，使样品变得非常脆弱易碎，再用预先也冷却到-196℃的非常锋利的玻璃断口切割经冷冻的样品，这样使样品在最容易断裂的部位断开（如果是微生物细胞，则多半是沿内膜中部），然后让样品放在真空条件下升华掉断口处的冰，最后用重金属喷镀该断口表面，即可用电子显微镜观察其结构。用这种制备方法的优点是可以避免在固定、脱水和包埋过程中造成细胞结构的人为改变而形成的假象。 冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 和投射电子显微镜是靠透过物体的电子成像不同，扫描电子显微镜的成像是靠观察物体表面发射的电子。扫描电子显微镜是用聚焦得很细的电子束在样品表面扫描。电子激发样品表面的原子放电，释放出微细的电子簇（二次电子），用灵敏的检测装置可以捕获它们，然后通过类似电视机的原理将样品图象呈现出来。二次电子对检测器的作用取决于样品表面的性质，当电子激发样品表面突起部位时，会有大量二次电子进入检测器，而表面凹陷处则只有少量二次电子进入，所以可以显出反差突出、明暗清晰的三维图象。而且它的成像焦深较长，图象的立体感强，和肉眼所见差别不大。制备扫描电子显微镜的样品也先要经过固定、脱水等处理，以免在真空条件下变形失真，为了获得较多的二次电子，表面要喷涂重金属和碳原子。
透射电子显微镜部分结构及功能 在光学显微镜下无法看清小于0.2µm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（s ubmicroscopic structures）或超微结构（ultramicroscopic structures；ultrastructur es）。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1 932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmission electron mi croscope，TEM），电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机（ultramicrotome）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成，如果细分的话：主体部分是电子透镜和显像记录系统，由置于真空中的电子枪、聚光镜、物样室、物镜、衍射镜、中间镜、投影镜、荧光屏和照相机。 电子显微镜是使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜。高速的电子的波长比可见光的波长短（波粒二象性），而显微镜的分辨率受其使用的波长的限制，因此电子显微镜的分辨率（约0.1纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约200纳米）。 透射式显微镜的结构与原理 透射式电子显微镜(TEM)与投射式光学显微镜的原理很相近，它们的光源、透镜虽不相同，但照放大和成像的方式却完全一致。 在实际情况下无论是光镜还是电镜，其内部结构都要比图示复杂得多，图中的聚光镜（condonser lens）、物镜（object lens）和投影镜（projection lens）为光路中的主要透镜，实际制作中它们往往各是一组（多块透镜构成），在设计电镜时为达到所需的放大率、减少畸变和降低像差，又常在投影镜之上增加一至两级中间镜（in temediate lens）。 透射式电子显微镜的总体结构包括镜体和辅助系统两大部分,镜体部分包含：①照明系统（电子枪G，聚光镜C1、C2），②成像系统（样品室，物镜O，中间镜I1、
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 1 冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子（<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子
冷冻电镜技术课程学习报告 一、课程所讲基础知识回顾 1、电子显微镜成像技术的发展历史 （1）上世纪50年代的负染技术（分辨率2mm）： 该技术的原理为重金属燃料与H结合，特点为对电子散射强，视野暗，衬度大，易观察到生物材料。但不足之处在于染料颗粒较大，不易进入分子内部。此外，因样品需要脱水处理，会造成结构失真。 （2）上世纪60年代的三维重构技术 三维重构的数学原理为傅里叶变换，其关键性质为：三维函数投影的傅里叶变换等于该三维函数傅里叶变换在垂直于投影方向上的中央截面。因此，通过对待测立体物质的多角度投影信息采集，可以借助数学的桥梁，重构出该物质的三维结构。显然，对待测物质投影采集的角度越多，越精确，重构出的三维图像越接近真实。 在60年代，T4噬菌体的结构通过该方法被成功解析。 （3）上世纪70年代的电子晶体学 即根据电子衍射的花样确定物质的晶体结构。被观测的物体通过物镜形成衍射图样，而这些衍射光束的低散射角部分再通过透镜而形成显微像。该方法相当于对原物体进行两次傅里叶变换，一为将物体转换成衍射谱，二为逆傅里叶变换使衍射谱重构成显微图像。 在70年代，电子晶体学的发展使得第1个膜蛋白结构被成功解析。 （4）上世纪80年代的快速冷冻技术（分辨率达到0.2nm） 主要原理为将样品快速冷冻在玻璃态的水中，样品不需脱水，结构与在溶液中相同，呈天然状态。因此，电镜成像得到的更接近原物质的真实结构，且分辨率高。 2、冷冻电镜技术介绍 （1）关于玻璃态冰： 冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态（即无定形态）的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同导致图像产生偏差。 （2）操作步骤概要： 冷冻包埋——转移至液氮或液氦中——观测，图像采集——三维重构 （3）图像采集的质量要求： 应保证样品在玻璃态冰中的分布均一，厚度一致切适当，避免污染。此外，特别应注意的是，该方法对电子剂量很敏感，最适为10e/A2，明显超过最适剂量即容易因受到过量电子辐射而破坏物理结构，导致冰迅速汽化，出现气泡，造成图像采集不成功。 因此，必须采用低剂量技术（≤20e/A2），用1k~3k倍的低倍镜寻找，在目标域的临近区聚焦，使记录区域仅在拍摄时（1s左右）受到电子辐射，保证样品不被损坏。 二、课外补充学习：冷冻电镜技术难点的扩展阅读 1、冰晶污染 冰晶污染是冷冻电镜的主要问题和最重要的难点，可发生在冷冻电镜的各个
冷冻电镜简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
1冷冻电镜发展背景 人类基因组计划的完成，标志着科学已进入后基因组时代。虽然大量的基因序列得到阐明，但是生物大分子如何从这些基因转录、翻译、加工、折叠、组装，形成有功能的结构单元，尚需进一步的研究。后基因组时代人类面临的一个挑战是解析基因产物—蛋白质的空间结构，建立结构基因组学，并在原子水平上解释核酸—蛋白，蛋白—蛋白之间的相互作用，从而阐明由这些生物大分子和复合物所行使的生物学功能。在此过程中，结构生物学在其中扮演着重要角色。对生物大分子结构的解析，不仅具有深远的基础意义，而且具有广阔的应用前景。通过对核酸、蛋白质及其复合物的结构解析，人们对它们的功能的理解更加透彻，就可以根据他们发挥功能的结构基础有针对性地进行药物设计，基因改造，疫苗研制开发，甚至人工构建蛋白质等工作，从而对制药、医疗、疾病防治、生物化工等诸多方面产生巨大的推动作用。 日前用于解析生物大分子空间结构的主要手段是X射线晶体学技术和核滋共振波谱学。X射线晶体学可给出分子的高分辨结钩，核磁共振波谱学则可测定分子在溶液中的精确构像，并可研究构像的动态变化。虽然X射线晶体学和核磁共振波谱学是解析生物大分子结构的强有力工具，但各有局限性。X射线晶体学解析的结构常常是分子的基态结钩，而对解析分子的激发态和过渡态却往往无能为力：生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥功能，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振波谱学虽可获得分子在溶液中的结构并可研究结构的动态变化，但目前只能用于分子量较小的生物大分子 （<10000道尔顿），而对分子量大的生物大分子尤其是超分子复合物却无能为力。 人类对生物体系的研究经历了由个体到器官，由器官到组织，由组织到细胞，由细胞到生物大分子这样一个层次由高到低的过程。随着科学的发展，人们对生物体系的研究又转向由低层次到高层次，由简单体系到复杂体系。在此过程中，细胞作为生命的基本单位起着承上启下的重要作用。多少年来，科学家的一个梦想是能观察到生物大分子在细胞内的行为，几十年来，人们对大量的生物大分子及其复合物应用电子显微镜进行研究，发展出了强有力的电子显微学来研究生物大分子结构的方法学。近年来，由于快速冷冻和低温冷却技术的引进，导致了冷冻电子显微学技术的诞生。冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展，在生物学领域的应用越来越受到重视，逐渐成为一种被普遍接受的公认的研究生物大分子尤其是超分子体系结构的有效研究手段，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。
技术应用 Technical application ·100· 中国高新科技 2019 年第39期 直，要尽量将焦距对准。 （3）对温感进行设置，可先借助自动模式对温度范围进行测量，再通过手动方式对水平及跨度进行设置，设置最小的温度范围。 （4）无人机对成像系统进行搭载，要配备电量充足的电池，确保续航时间。 3 相关案例 某大型光伏电站采用无人机红外热斑检测。该站主要采用多晶硅光伏组件，工作人员在现场对检测区域进行确定，并抽选16排光伏组件。随后，对无人机自动巡检具体路线进行设定，抽选的16排光伏组件具有2MW容量，检测所用时间为10min，后续采用相关软件对检测结果实施科学分析，并生成相应的检测报告。 对检测结果进行对比分析，发现16排抽检的光伏组件中，有2块组件存在热斑，分别是位于第5组串第11排，从西向东数第11列的1#组件，该组件温度达到28℃，组件局部温度甚至达到42℃，高出组件温度14℃，因此，判定该组件存在热斑。第7组串第11排，从西向东数第7列的2#组件，该组件温度达到28℃，组件局部温度甚至达到42.8℃，高出组件温度14.8℃，因此，判定该组件存在热斑。 4 结语 综上所述，大型光伏电站极易发生热斑故障。热斑故障会减少大 型光伏电站的发电量，并严重影响光伏电站运行的安全性和稳定性。无人机红外热斑检测在大型光伏电站中的应用，能大幅度减少热斑检测成本，增强热斑检测的精确性，大幅度提高热斑检测效率。因此，要加强无人机红外热斑检测在大型光伏电站中的推广应用。 [1]车曦．基于红外图像识别的光伏组件热斑故障检测方法研究[D]．重庆：重庆大学，2015． [2]桑轩昂．无人机红外热斑检测在光伏电站中的应用[J ]．产业与科技论坛，2017（9）：66-67． （作者系三峡新能源西南分公司工程师） 冷冻电镜技术在线粒体中的应用研究 0 引言 线粒体在生物体生命生活中发挥着极为重要的作用，是有氧呼吸的主要场所，为生物细胞提供新陈代谢必需的能量。线粒体有着自身的遗传体系和遗传物质，参与细胞分化、细胞信息物质传递及诱导细胞凋亡等过程，从而直接或间接地调控细胞周期。与此同时，线粒体在生理功能的内稳态方面也发挥 着重要作用，如果这些生理功能出现了障碍，则会引发诸多疾病。如糖尿病、癌症及遗传线粒体疾病，分别由能量转运系统的功能障碍、细胞凋亡调节的缺失及线粒体DNA 的突变引起。众多关键的生理功能使得线粒体成为引人瞩目的药物靶点，线粒体既可以作为主要药理学靶点，通过直接的药物相互作用产生生理效应，抗氧化药物、抗肿瘤 药物互作等，也可以作为次要靶位与药物作用后产生毒副作用。由此可见，线粒体功能结构十分复杂，已有的研究成果主要集中在功能学及动力学方面，更深层次理解其功能发挥过程则需要微观结构的解析工作。近年来，冷冻电镜技术飞速发展，在结构生物学中发挥着关键作用，也为线粒体生理活动的深入研究提供了新的方向。
高分辨电子显微学中常用的图像处理和图像模拟方法 Tina(2010-09-28 11:29:48) 降低噪音： （1）傅立叶变换过滤法：布拉格滤波、环形滤波和孪生滤波，用Gatan 的DigitalMicrograph都可以搞定 布拉格滤波：选择周期性的布拉格点，主要是突出周期性信息； 环形滤波：选择感兴趣的频率信息，可以用来处理界面和多次孪晶等的高 分辨像； 孪生滤波：选择两个布拉格点。 （2）实空间平均法 主要用于处理生物大分子的图像，也有人用来处理沸石的低剂量高分辨像，主要有两个过程：相关计算和图像强度的叠加。 图像模拟： 用的最多的就是C-M多层法了，现在国内常用的程序有EMS，JEMS，Cerius2， 在线模拟：http://cimewww.epfl.ch和https://www.doczj.com/doc/ba13909477.html,/default.asp 图像处理（透过图像处理可以直接得到样品的出射波或投影势分布）： 解卷法：最大熵解卷和直接法解卷，代表人物：物理所的李方华先生和范 海福先生，国内专业做高分辨像处理的独此一家，使用的软件：VEC（完整晶体）和DEC（缺陷），这两个软件都是李老师和范老师他们那个组自己发展起来的，厉害！！ 波函数重构：
（1）TIE/MEM（强度等效传递/最大熵），代表人物：陈福荣等 （2）抛物面法(Van Dyck方法)，代表人物：M.Op de Beeck和D.Van Dyck（比利时） （3）最大似然法，代表人物：W.M.J.Coene和A.Thust（荷兰） （4）Wiener过滤，代表人物：A.I.Kirkland（Oxford） 前三种方法要求有20张高分辨像，而且这些像必须是系列焦点的，如果有一张像因为震动或其他原因而模糊，那么这个系列就不能用了。这三种方法中最大似然的方法比较成熟，可以处理完整晶体和缺陷的高分辨像，已经有商业化的程序TrueImage。
JEM2100F操作注意事项： 1.抽拔样品杆时置KV档，抽真空<2×10-5Pa才可以开beam阀。 2.抽拔样品杆1）先置KV档 2）将样品杆归零（如果是双倾台，拔下Y线） 3）抽拔样品杆到不能动位置向内旋置顶端再抽拔一次再旋置顶端 4）真空开关调下，听到放气声再全部拔出。 3.关机时，降高压160KV，即Stand By. 4.下班前烘液氮：插加热棒；调KV档;maintenance--ACD Bake---ACD heat: on 开机步骤1： 如果开始的光斑不是一个，而是多个类似衍射斑点的话，需要先调整Z方向将光斑缩小成一个点。 步骤2：照明系统合轴 2.1. 电子枪合轴： 1.开电子枪，按下STD FOCUS，倍率x40k，spot 1，Alpha 3； 2.Maintenace---Alignment：调出面板，选择Anode+Gun 3.调节DEF/STIG X，Y，直到光斑同心收缩（所有按钮旁边的CRS按键：按亮为粗调，暗为细调） 4.关掉Anode 2.2 Spot1-spot5合轴（1-5和轴）： 1.Maintenance-Alignment 选取DEF Selector-Gun，转动BRIGHTNESS，将光斑束缩小之后，将Spot size 调至1，以Shift X,Y将光斑移到荧光屏中心 2. Maintenance-Alignment 选择DEF Select-CLA (condenser lens aperture)，将Spot size 调到5，以Shift X,Y将光斑移到荧光屏中心。 3.重复上面两步，直到光斑不动，保持在中心为止。
附件：日本电子JEM-2100高分辨透射电镜/ JSM-7600F场发射扫描电镜简介 JEM-2100高分辨透射电镜 一、主要部件 JEM-2100主机，ORIUS SC1000型CCD，牛津80mm2电制冷X射线能谱仪（EDS），双轴倾转样品杆 二、主要指标 电子枪：LaB6（六硼化镧） 点分辨率：0.23 nm 线分辨率：0.14 nm 加速电压：80, 100, 120, 160, 200kV 束斑尺寸： 1.0至25 nm 放大倍数（高倍模式）：2000至1,500,000 放大倍数（低倍模式）：50至6,000 CCD分辨率：4008×2672 max. 倾斜角：±35o 采用MS Windows为基本操作界面，操作直观简便。 三．特色功能 ?除高分辨、电子衍射和能谱等基本功能外，该电镜还具备纳米束电子衍射（NBD）、汇聚束电子衍 射（CBD）功能，适用于纳米晶体、多相合金、复合材料的衍射表征。 ?配备扫描透射电镜（STEM）模式，可采集STEM明场像和暗场像，并配合能谱实现微区元素分析 和元素分布图（Mapping）。 JSM-7600F场发射扫描电镜 一、主要部件 JSM-7600F场发射扫描电镜，牛津80mm2电制冷X射线能谱仪（EDS），背散射探头（BSE） 二、主要指标 电子枪：热场发射 二次电子像分辨率： 1.5 nm（1 kV，GB 模式），1.0 nm（15 kV） 放大倍数：25 至1,000,000× 加速电压：0.1 至30 kV 束流： 1 pA 到200 nA（15 kV时） 数字图像：5120×3840 max. 样品水平行程(X-Y)：140 mm×80 mm 倾斜角度：-5 至+70°