1922年，英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。
由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。
1 溶菌酶的分类
溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。
1.1 细菌溶菌酶细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。
1.2 真菌溶菌酶真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。
1.2.1 几丁质酶
虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC3．2．1．30)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC3．2．1．14)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如Trichodermaharzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。
1.2.2 β-葡聚糖酶
β-葡聚糖酶(β-glucanases；EC 3．2．1．39)具有抗真菌作用主要是因为它能水解β(1→3)糖苷键。研究表明：β(1→3)葡聚糖酶对几丁质降解真菌细胞壁具有显著的协同作用。如将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用，抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作用。因为许多植物性食品中含有β-葡聚糖成分，它对维持产品的组织性、黏度和外观都有重要作用，将β-葡聚糖酶加入这类食品，可能会引起不良影响。真菌的细胞壁主要组分为几丁质和β-葡聚糖，但一些真菌和大多数酵母细胞壁含有其他类型的多糖(甘露聚糖、α-葡聚糖和纤维素)，因此，甘露聚糖酶、α-葡聚糖酶也可作为抗真菌的酶类应用于食品工业。
2 溶菌酶的结构
溶菌酶相对分子质量为14.6×103，由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有4对二硫键。溶菌酶分子近椭圆形，大小4.5nm×3.0nm×3.0nm。它的构象比较复杂，α螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的β片层构象。不同来源的溶菌酶组成一级结构的氨基酸数量是相同的，但多肽链上某些个别氨基酸有差异，因此来源于不同种属(如噬菌体、番木瓜、鸟类、鸡、鼠、狗、人类)的溶菌酶或同一种属不同脏器(如兔的肝、脾、鼠的脾、肾)的溶菌酶分子量各不相同。1963年科学家测定了鸡蛋清溶菌酶的一级结构，它是由129个氨基酸残基组成的单一多肽链，分子中含有八个半肌氨酸，多肽链折叠使两两半胱氨基酸相互靠近形成了四对二硫键。多肽链内的35位谷氨酸残基与52位的天冬氨基酸与酶的活性有关，多肽链的氨基末端是赖氨酸残基，羧基末端是亮氨酸残基。一级结构多肽链经盘绕，折叠形成含有α—螺旋和β—片层状的二级结构。此酶的三级结构是在二级结构单元的基础上在经盘绕成紧密折叠的椭球结构；在此结构中含有三段α—螺旋，另有一部分自身回折成一段反平行的β—片层状，其余肽链为无规线圈，在此酶椭球形结构中，由于在二级结构的肽链生成后，在无规线圈处自身折叠时，几乎所有的氨基酸侧链上的极性亲水基团都朝向外，处于球形分子的表面，而几乎所有的疏水基团则避开水而聚集在分子的内部。此酶外形上有一个明显裂隙，这是溶菌酶的活性中心[2]。
3 溶菌酶的作用机制
溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAGC1和NAMC4之间的β（1-4）糖苷键[2]。几丁质是甲壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由NAG残基通过β（1-4）糖苷键连接而成，几丁质也是溶菌酶的底物。溶菌酶的内部几乎全部是非极性的。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而失去对细胞的保护作用，最终使细菌溶解死亡。也可以直接破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这主要是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能保护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还可以使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还可以促进蛋白质的消化吸收。
溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的1位碳原子
和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)的4位碳原子间的β-1.4糖苷键。肽聚糖是细菌细胞壁的主要成份，它是由NAM、NAG和肽“尾”(一般是4个氨基酸)组成，NAM与NAG通过β-1.4糖苷键相连，肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”(肽键或少数几个氨基酸)连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。对于革兰氏阳性菌（G+），如藤黄微球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，与革兰氏阴性菌(G-)，如大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等，其细胞壁中肽聚糖含量不同，G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌只有内壁层为肽聚糖，因此，溶菌酶对于破坏G+细菌的细胞壁较G-细菌强。
4 在食品工业中的应用
由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒副作用，因此被认为是一种很安全的食品添加剂。由于其具有选择性抑菌的特点，目前已被许多国家和组织批准为食品防腐剂或保鲜剂使用。广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐;还可以添加入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。食品腐败时，早期出现的微生物通常是该食品特有的微生物。如果通过某种手段杀死或抑制这些特定微生物生长，便能延长食品的保质期。近年来发现，化学合成杀菌剂都有一定的毒性，因此不宜向食品中添加。所以，用安全性高的溶菌酶进行食品防腐将与日俱增[4]。
4.1 用于水产类制品的应用溶菌酶本身是一种无毒、无害的蛋白质，且具有一定的保健作用，可以选择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食品中的其他物质，保证食品原有营养成分不受损失。对革兰阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有强力分解作用。对大肠埃希菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰阴性菌也有一定程度溶解作用。其最适作用浓度为0.05%，与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，能够有效提高其防腐效果，可用于水产类保鲜与防腐。该保鲜剂完全采用安全、无毒、天然的物质科学地配合组成，它的保质效果可以延长冷却肉的保质期1～4倍。该保鲜剂可以耐受95℃以下的温度，并保持性质稳定。因此，可以将其添加到原料肉中，进行低温加热(80℃左右)，使用浓度为肉重的0.05％～0.01％，使用方法为在肉块进行滚揉或进行斩拌时加入，但是要注意的问题是在低温肉制品热加工中，加工的温度不要超过95℃。
4.2 在乳制品中的应用溶菌酶是一种非特异性免疫因子，可对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖，是婴儿食品中的抗菌蛋白，是一种必需的添加因子。溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接地促进婴儿肠道内双歧杆菌的增殖；可以促进婴儿胃肠内乳酪蛋白形成微细凝乳，延长在肠道停留时问，有利于婴儿消化吸收；可以促进人工喂养婴儿肠道细菌菌群的正常化；它还能够强化血清灭菌蛋白、球蛋白等体内防御因子，以增强对感染的抵抗力，特别是对早产婴儿有预防体重减轻和消化器官疾病及增加体重的功效，是婴儿食品及配方奶粉等的良好添加剂。溶菌酶特别适合于巴氏杀菌奶的防腐，一般在包装前加入300～600ppm。另外，在奶酪加工中添加一定量的溶菌酶可以防止中后期奶酪的后期起泡、风味变差及不影响奶酪老化过程中奶酪基液的品质，同时，还能起到抑菌作用，不至引起酪酸发酵，这是其他防腐剂所无法比拟的。另外,牛乳中溶菌酶含量远远低于人乳现在实验表明将溶菌酶添加到牛乳及其制品中!可使牛乳人乳化!可满足婴幼儿对乳制品的要求[5]。
4.3 在酒及饮料防腐中的应用用溶菌酶代替水杨酸，用于日本清酒的防腐取得了很好的成效。清酒乙醇含量为15％～17％(体积分数)，大部分微生物不能生存，但有一种乳酸菌则能生长，并引起产酸和产生臭味。以往通常加水杨酸作防腐剂，但因为水杨酸有一定毒性，其应用受到了限制。目前，日本已成功用鸡蛋清溶菌酶代替水杨酸作防腐剂，其加入量为15mg／kg。
此外，溶菌酶还可应用于pH值为6.0～7.5的饮料的防腐剂[6]。
4.4 在保健功能性食品中的应用溶菌酶是一种无毒、无害的高盐基蛋白质，且具有一定的保健作用，有抗感染和增强抗生素作用效力，促进血液凝固及止血作用，有组织再生作用。因此，可以在保健食品中添加一定量以提高保健效果。
4.5 溶菌酶在其他食品中的应用奶油蛋糕是容易腐败变质的食品之一，在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，起到防腐作用
将溶菌酶应用于食物的保鲜中，其效果也极为明显。同时根据溶菌酶无毒无害且有保健作用!有抗感染和增强抗生素的效力。以及促进血液凝固及止血和组织再生作用。现在有人尝试在食品中作为添加剂增强食物的保健功效。由于处于酵母细胞壁中的蛋白质利用率很低，所以利用溶菌酶破坏酵母细胞壁，可制成微生物蛋白质，提高酵母蛋白质的利用率[7]。
4.6 在食品软包装中的应用
将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗菌功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能。目前许多肉制品软包装都需要经过高温灭菌处理。经过处理的肉制品脆性变差甚至产生蒸煮味。溶菌酶杀菌防腐，由于不经过加热，属于冷杀菌，因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用，尤其对热敏感的物质更具有重要意义。如果在产品真空包装前添加一定量的溶菌酶(1％～3％)，然后巴氏杀菌(80～100℃，25～30min)，可获得很好的保鲜效果。此外，溶菌酶对人体安全、无毒、无害，且具有一定的保健作用。同样，果蔬加工前添加一定量的溶菌酶，一般添加量为0.1％～0.2％(拌料时添加)或1％～3％(加热煮制时添加)，都能起到很好的保鲜效果[8]。
5溶菌酶的应用前景
溶菌酶的研究与发展蕴藏着巨大的潜力，溶菌酶以其较强的溶菌性正引起各国科研人员的重视，作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，是一种安全性很高的的食品保鲜剂、营养保健品和药品；作为一种工具酶在基因工程上有着广泛的应用，而其在医学上的作用也越来越受到重视，随着科学技术的发展，我们对溶菌酶认识的加深，将会更加多方面应用其特性来改善我们的生产、生活。国内外市场对溶菌酶的需求将不断增加，然而，目前溶菌酶的高端产品主要被加拿大、美国、日本等国的大公司所垄断，我国溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，国内厂家基本上采用从蛋清中提取溶菌酶生产技术，而蛋清溶菌酶有限的溶菌谱及其较低的提取率限制了溶菌酶的应用，溶菌酶以其较强的溶菌性正引起各国科研人员的重视，目前，各国科研人员正积极在以下几个方向进行研究：(1)提高产量。酶的生产成本是其能否在工业上成功应用的关键。运用基因工程技术，结合已有的结构和功能关系的知识，进一步提高酶的产量，降低成本。(2)对产的溶菌酶组分进一步分离纯化，研究可能存在的各组分间的协同作用机制。(3)对酶的分子生物学方面的研究，克隆酶的基因，构建高表达工程菌株，进一步研究基因工程菌的发酵动力学，确定发酵动力学参数，找到反映工程菌发酵过程的平衡方程。(4)探讨酶活性位点与保守位点，通过分析酶的一级结构，阐明酶的结构与功能的关系、酶底物的专一性及结构对酶稳定性的影响。
(5)对酶的作用机制的探索，弥补当前溶菌机制方面研究的空缺。(6)在对溶菌酶序列进行生物信息学分析的基础上，利用同源建模工具对蛋白质结构进行预测。
溶菌酶 溶菌酶 溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。 （一）溶菌酶的结构及物理化学性质 溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。 表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性 特性数值 相对分子质量14 400 亚基数 1 氨基酸129 等电点10.7 二硫键数 4 碳水化合物所占比例0 E1%280nm 26.4 93℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110 酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解 （二）溶菌酶的来源 溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。 表17 -2溶菌酶的来源
溶菌酶 ----新型免疫抗菌抗病毒药物、饲料添加剂 溶菌酶研发背景： 抗生素是人类应用最广泛的抗菌药物，不仅用于临床，也广泛用于畜禽饲养和农业方面。在过去的50多年中，由于饲用抗生素在养殖中的长期使用导致大量耐药菌株的产生，且病原菌抗药性逐年增强，致使疗效下降，剂量提高，造成动物疾病越防越难防，越治越难治，给养殖业造成很大的损失和危害。同时也给全人类的健康造成严重的影响。因此，世界卫生组织于1994年就细菌耐药性的监测结果给全世界提出了警示：细菌对抗生素产生的耐药性正在以惊人的速度增加，而现在的抗生素药物正在失去原来的疗效。因此寻求广谱、高效的新一代饲用抗菌药物已成为迫在眉睫的摆在人类面前的课题。 澳大利亚昆士兰大学医学系博士生导师、高级研究员王雯禾博士（1993年毕业于英国剑桥大学达尔文学院获微生物营养学博士学位），一直致力于生命科学的研究和发展，历经十多年的研究发现：酶广泛存在于生物体内，参与新陈代谢等多种生理功能，其中对微生物细胞壁具有水解功能的抗菌酶，如溶菌酶lysozyme能够溶解微生物细胞壁而使微生物死亡，而且溶菌酶lysozyme在人和动物的唾液、眼泪、乳汁以及肌体组织中大量存在，是人和动物自身重要的免疫因子，与人和动物的健康息息相关。 溶菌酶lysozyme的溶菌（杀菌）作用与传统的抗生素药物相比，具有对某一病原菌所有血清型都有效的优点，克服了一种抗生素只能预防一种或其中一种血清型病原菌的不足，更不存在药物残留和耐药性的问题。 王雯禾博士认为，溶菌酶lysozyme作为畜禽、水产饲料添加剂在替代抗生素，控制耐药菌，生产绿色肉蛋奶食品方面是最佳的选择。并多次鼓励和支持国内年轻的科学家、学者，致力于这一伟大的、划时代的、对全人类的健康有杰出贡献的产品的开发和研究。并于2003年10月推出最早用于防治动物疾病的产品--溶菌酶系列,由于它不但能溶解（杀死）细菌，增强动物的免疫能力，而且还能和病毒结合使病毒失活，所以它作为预防动物疾病的新型饲料添加剂，正在动物疾病防治的许多领域被广泛应用。·溶菌酶生产原理 ---- 一种基因克隆酶 早在上世纪九十年代早期，荷兰科学家就研制出phyA基因工程菌，成为全世界第一个基因克隆菌的研究成果，作为一个伟大的研究成果在生物领域被迅速推广和使用。 溶菌酶是我们澳洲的研究专家团将来源于健康动物体内的溶菌酶利用分子生物学技术对其进行基因克隆重组进入受菌体，筛选优选优良菌种，通过生物发酵和生物提取工艺以及冷冻干燥技术产生的一种水溶性溶菌（杀菌）蛋白酶。 ·溶菌酶的社会效益 溶菌酶在畜牧业中推广应用，一方面将降低疫病造成的产量下降，减少由此引起的巨大经济损失，大大提高畜牧水产业的经济效益（若按仔猪的死亡率达10-20％，鸡死亡率达20％左右，水产死亡率达30%左右，造成的直接经济损失分别达到2.8亿元以上，4.44亿左右和5.2亿元），另一方面的推广应用能很好的解决家畜家禽水产疫病防治中的药物残留问题，并能改善肉蛋奶的质量，确保食品安全。同时，我国加入WTO后，可促进我国畜禽水产肉蛋奶的出口，增加国家外汇收入。 ·溶菌酶的生态效益 本产品在充分利用自然资源的基础，采用现代生物技术对活性生物成分——溶菌酶进行分离提纯所得到的制剂易泰·溶菌酶，不含激素和化学防腐剂。因此本产品在生产中的应用无毒、无药物残留、不会产生耐药菌株，不但不会对生态环境带来不良影响，还将有利于改善生态环境。 ·溶菌酶系列产品
内容 1：溶菌酶简介 1.1 溶菌酶 溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。 溶菌酶存在 在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。 从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。 溶菌酶生理作用 在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用 2：溶菌酶的种类 溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。 1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。 根据来源不同，将溶菌酶分为三类 （1）动物源溶菌酶 ?动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。 ?鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子 量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH 在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍 有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。 鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。 人溶菌酶分子量为14600，对人的溶菌酶研究发现它是由130个氨基酸残基组成，也有4个S-S键，其一级结构氨基酸顺序及组成与鸡蛋清溶菌酶相比有极大的差异，但三级结构有相似性，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍。对于哺乳动物溶菌酶，目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性远低于人溶菌酶。 （2）植物源溶菌酶 目前发现含溶菌酶的植物有近170种，在木瓜、无花果、大麦等植物中均已分离出溶菌酶。植物源溶菌酶分子量较大，约为24000～29000单位，其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。 （3）微生物源溶菌酶 上世纪60年代从微生物中分离出溶菌酶，根据其作用对象分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。
1. 溶菌酶简介 溶菌酶，又称细胞壁水解酶，广泛存在于高等动植物组织及分泌物、原生动物、昆虫和各种微生物中。1922年Fleming等发现，在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶，因而被命名为溶菌酶。它能够水解N一乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸之间的β一1，4糖苷键，因此可以溶解大多数革兰氏阳性菌的细胞壁而具有溶菌作用，溶菌酶本身是一种蛋白质，安全性能高，在食品、医药、生物学中得到了广泛的应用。 2. 溶菌酶的理化性质（可要可不要） 溶菌酶是一种糖苷水解酶，是由129个氨基酸残基组成的小分子碱性球蛋白，相对分子质量为14 300，分子中富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸，其多肽链经盘绕折叠形成二级和三级结构，形成一个椭圆形的外形结构， 溶菌酶纯品为白色粉末结晶，无臭、甜味，易溶于水和低浓度的盐溶液，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45--50℃，最适pH为5～7，在低温干燥条件下可长期保存，热稳定性强，耐酸性强，pH为4—7时，100℃下处理45 min仍能保持其酶活性，但在碱性条件下化学性质不稳定，易变性。 3. 溶菌酶的作用 1．抗菌消炎 2．抗病毒：溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用。与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。 3．增强免疫力：溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。 4．其它方面的药理作用：溶菌酶还具有激活血小板的功能。可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。 5．促进双歧乳酸杆菌增殖：溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细
1922年，英国细菌学家Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。 由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。 1 溶菌酶的分类 溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。 1.1 细菌溶菌酶细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。 1.2 真菌溶菌酶真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。 1.2.1 几丁质酶 虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC3．2．1．30)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC3．2．1．14)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如Trichodermaharzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。 1.2.2 β-葡聚糖酶 β-葡聚糖酶(β-glucanases；EC 3．2．1．39)具有抗真菌作用主要是因为它能水解β(1→3)糖苷键。研究表明：β(1→3)葡聚糖酶对几丁质降解真菌细胞壁具有显著的协同作用。如将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用，抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera)的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作用。因为许多植物性食品中含有β-葡聚糖成分，它对维持产品的组织性、黏度和外观都有重要作用，将β-葡聚糖酶加入这类食品，可能会引起不良影响。真菌的细胞壁主要组分为几丁质和β-葡聚糖，但一些真菌和大多数酵母细胞壁含有其他类型的多糖(甘露聚糖、α-葡聚糖和纤维素)，因此，甘露聚糖酶、α-葡聚糖酶也可作为抗真菌的酶类应用于食品工业。 2 溶菌酶的结构
国内的溶菌酶的应用与发展 溶菌酶,又称胞壁质酶。球蛋白G、N - 乙酰胞壁质聚糖水解酶。最早对溶菌酶的研究起于 N icolle 1907 年发表的枯草芽孢杆菌中的溶解子,1922年 Flem ing等发现,在人的唾液、眼泪中存在有能够溶解细胞壁杀死细菌的酶,因而被命名为溶菌酶 [1] 。1965年,英国的菲利普等用 X衍射法对溶菌酶进行研究分析,第一个完全弄清了溶菌酶的立体结构 [ 2 ]。此后人们发现溶菌酶广泛地存在于高等动物组织及分泌物，植物及各种微生物中,其中在新鲜的鸡蛋清中含量最高。溶菌酶可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其它组织,且本身无毒无害,因而它是一种天然的安全性能很好的杀菌剂,防腐剂,将可应用于食品防腐、医药制剂日用化工等行业。在我国,溶菌酶的应用范围和应用量还比较有限,但可以预计，溶菌将会是应用于我国食品工业中一种重要的功能性食品添加剂。 溶菌酶的结构特点和抗菌作用机制结构特点与复杂性 大多数鸡蛋清溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球状蛋白 ,相对分子量在14000 ～18000。其等电点可达 10 7,存在 4 个二硫键。正常条件下溶菌酶作用的最适温度为45℃～50 ℃。蛋清溶菌酶在低温干燥下可长期保存。其纯品为白色粉末状结晶,无臭、味甜 ,易溶于低浓度的食盐水。在碱性条件下易被破坏,但在酸性溶液中其化学性质稳定,热稳定性很强 ,在 pH4 ～7 时,100℃下处理1m in 酶仍保持良好的活性,在pH3时,100℃加热处理 45m in 仍能保持活性{3}。溶菌酶在水溶液中6215 ℃下,维持30min则完全失活,在2015%
的乙醇中,在 6215 ℃下维持 20m in而不失活[4]。王玮等[5]研究表明。在一元醇和二元醇溶液中溶菌酶分子的稳定性均随着醇浓度的增大而提高。人溶菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成 ,也存在4个二硫键,其酶活性比鸡蛋清溶菌酶高2倍左右。在生产或应用溶菌酶时,由于工艺或环境的变化,极易造成酶的变性失活,因此必须采取一定的手段使蛋白复性，减少损失。史晋辉等[7]研究发现 ,当酶浓度较低时,017mol/L 的盐酸胍即可使溶菌酶完全复性。此外 , 溶菌酶和其它酶具有相似的性质 , Karupp iah等[8]研究表明,向复性溶液中加入适量的β- 环糊精,可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80% 。董晓燕等[9]利用β-环糊精和十六烷基三甲基溴化的联合作用,在适宜盐酸胍浓度下,溶菌酶可完全复性。王彦等利用离子交换色谱法研究发现,当复性缓冲液中不含其它盐类时,脲浓度为 210mol /L时复性产率最高,当脲浓度高时,硫酸铵能很好地提高溶菌酶的复性回收率。 溶菌酶的抗菌作用机制 目前已知的几种溶菌酶有:内- N -乙酰己糖胺酶、酰胺酶β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、几丁质酶、磷酸甘露糖酶脱、乙酰壳多糖酶[11]。参与细菌细胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分为作用于糖苷键和作用于肽和酰胺部分的两类。内- N -乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β 1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷键,使糖苷键断裂,破坏细胞壁的分子结构,而酰胺酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以内 - N - 乙酰己糖胺酶为例,内- N-乙酰己糖胺酶能够催化水解细胞壁肽聚糖分
溶菌酶的提取工艺路线 1前言： 1.1溶菌酶性质 溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0 白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。 稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。 抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。0 1.2溶菌酶来源 该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。 1.2溶菌酶应用
1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。 2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。 3．溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。0 2提取方法： 1.亲和层析法 亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一亲和力而设计的色谱技术。酶-底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。使用的吸附剂为几丁质及其衍生物：如几丁质粉，羧甲基几丁质，几丁质包埋纤维素等 其中磁性亲和分离法，磁性介质已被广泛用于分离细胞及核酸，蛋白质等生物大分子，∑激素等小分子生物活性物质。0 优点：通过外磁场的作用可快速地实现固液分离及磁性介质与其它固态杂质的分离，当待分离的液体样本含有固形物或较为粘稠时更具优越性。蛋壳上残留有大量的蛋清，是准备溶菌酶的潜在资源，单蛋壳清洗液中常含有泥沙，蛋壳等杂质，且黏度较大，用一般的亲和层析时易造成层析柱的堵塞 缺点：在原有亲和层析介质的基础上进一步制备了具有磁性的几丁质凝胶亲和介质，这种吸附最终导致了部分活力回收的丧失。亲和柱造价高制作困难0 2.阳离子交换法
实验一溶菌酶的溶菌作用 实验目的： 1、掌握溶菌酶对革兰氏阳性菌溶解的原理及应用。 2、证实体液中溶菌酶的存在观察溶菌酶的溶菌现象。基本原理： 正常情况下，机体的唾液、泪液、痰、鼻腔分泌物以及白细胞和血清等均含有丰富 的溶菌酶。测定分泌物和体液中的溶菌酶含量及其变动情况，可作为评价机体非特异性免疫功能的指标之一。 溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。溶菌酶能切断粘肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的B - 1,4 糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对 象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构， 故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。实验材料： 1、葡萄球菌：本菌是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。 2、标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用蒸馏水配制为1000ug/ml 原液， 并稀释为100、50、10 ug/ml 标准液，用前保存在冰箱中。 3、唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。（于饭后两小时，清水漱口3 次，10 分钟后，收集唾液于清洁烧杯中）； 4、其它：无菌打孔器（孔径2mm ），无菌毛细吸管、毫米尺等。实验方法： 1、制备含葡萄球菌的琼脂平板加热融化3%琼脂，冷至60C ~70C时， 加入1ml 葡萄球菌菌液，混合均匀，倾注于无菌平皿内。 2、用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，孔径2mm 左右，孔距5- 20mm 。用针头挑出孔内琼脂， 3、用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加满唾液,同时加标准溶菌酶作阳性对照。 4、置24-28 °C下12-18h观察结果。观察各孔周围溶菌情况，测量溶菌环直径。实验结果： 用毫米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对
《食品安全国家标准食品添加剂溶菌酶》 （征求意见稿）编制说明 一、标准起草的基本情况（包括简要的起草过程、主要起草单位、起草人等） (一) 简要的起草过程 根据原卫生部办公厅关于印发《2011年食品安全国家标准制（修）订项目计划（第二批）》的通知，食品添加剂溶菌酶被列入2011年第二批食品安全国家标准制订计划项目。 标准任务下达后，中国食品发酵工业研究院和中国食品添加剂和配料协会针对制定溶菌酶食品安全国家标准的具体工作进行了认真研究，确定了总体工作方案，并于2012年12月组建了标准起草工作组，由中国食品发酵工业研究院负责起草标准文本及编制说明。起草工作组首先查阅相关的国内外技术标准资料，在研究参考这些标准资料的基础上，初步确定了产品的质量技术指标和相应的试验方法，通过进一步的讨论研究、试验比对，形成了行业内标准征求意见稿。 2014年9月开始，起草工作组将标准文本及编制说明的征求意见稿以信件及电子邮件的形式定向发给有关企业和专家，同时在单位网站上刊登了该标准的征求意见稿，广泛征求意见。标准起草工作组认真讨论研究了反馈的意见和建议，对标准文本及编制说明进行了修改和完善，形成了标准征求意见稿（公示稿），上报食品安全国家标准审评委员会秘书处。 （二）主要起草单位 本标准主要起草单位：中国食品发酵工业研究院、中国食品添加剂和配料协会等。 （三）主要起草人 本标准主要起草人：张蔚、潘宏涛、王首锋、王洪荣、卢亚萍、姚粟、陈生红、海瑞、文苓、杜建华、刘波、刘捷、田云翼。负责标准技术资料查询、收集及对比，检测方法的验证比对，样品检测及数据整理，标准文本及编制说明的起草、撰写，行业内征求意见，组织标准的讨论会及标准报送等。 二、标准的重要内容及主要修改情况 本标准的制定在原卫生部公告的基础上，主要参考了FCCⅦLysozyme（溶菌酶）和JECFA （1992）Lysozyme Hydrochloride（盐酸盐溶菌酶），同时结合国内产品的实际情况。表1是国内外食品添加剂溶菌酶质量规格指标对照表。表2为国内外食品添加剂溶菌酶标准试验方法对照表。
＊ “八五”国家科技攻关项目(No .85-722-05-02) 收稿日期:1997-07-18,修回日期:1997-12-25 工程菌人溶菌酶的纯化和性质＊ 叶 军 钱世钧 (中国科学院微生物研究所 北京 100080) 提 要 将人溶菌酶工程菌株在发酵培养、菌体经超声破碎、变性和复性后所得的粗酶液经Ex press -Ion S 阳离子交换柱层析,得到电泳纯的酶,比活达到48000u /mg 。此酶的最适pH 为6.5;等电点为8.91;对溶壁微球菌的米氏常数K m =0.0311mg /m L ;60℃保温30min ,酶活力剩余48.3%。N 末端氨基酸序列除了第一个M et ,其余4个与预期相符。一些重金属离子对酶的活性影响不尽相同,在0.01mol /L 的浓度下Cu 2+可使该酶完全失活。关键词 重组人溶菌酶,纯化,性质 分类号 Q55 文献标识码A 文章编号 0001-6209(1999)01-0055-59 天然人溶菌酶主要存在于人奶、人胎盘和唾液等中,不易提取,且价格昂贵。而通过人工合成基因,用微生物发酵法生产人溶菌酶将为其在食品、医药等方面的广泛应用提供 有利条件。本实验室已经成功地合成了人溶菌酶基因并构建重组质粒[1～2],在E .coli 中得到了高水平表达[3]。本文在此基础上对该酶进行了纯化,得到SDS -PAGE 纯的酶,并对其性质作了一些研究。 1 材料和方法 1.1 菌种 工程菌株JBP -H LY ,由本课题组构建。1.2 仪器和试剂 Ex press -Ion S 阳离子交换剂、卵清溶菌酶、溶壁微球菌(M icrococcus lysodeikticus )均为Sigma 公司产品。测定等电点的标准蛋白及电泳装置为Pharmacia 公司产品,Ampho -line 为LKB 公司产品。其它试剂均为国产分析纯试剂。1.3 菌体制备、粗酶液的提取及酶活性的测定方法见参考文献[3～4]。1.4 人溶菌酶的纯化 将粗酶液经冷冻干燥浓缩,对0.01moL /L ,pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液透析,再通过经上述缓冲液平衡的Express -Ion S 阳离子交换柱,用0～1moL /L NaCl 进行梯度洗脱。收集活性部分的下柱液,用聚乙二醇反透析浓缩,利用SDS -PAGE 检查纯度。1.5 蛋白含量和等电点测定 蛋白含量用Folin -phenol 法测定[5]。等电点测定参照文献[6]进行。 39卷 1期1999年2月微生物学报Acta Microbiologica Sinica Vol .39February No .1 1999 DOI :10.13343/j .cn ki .wsxb .1999.01.009
溶菌酶 2010级基地班马冬珂10104109 一：溶菌酶的性质： １９０７年，Ｎｉｃｏｌｌｅ最早发表了枯草杆菌溶菌因子的报告，两年后，Ｌａｓｃｈｔｓｃｈｅｎｋｏ指出，鸡蛋也有较强溶菌活性，并把它命名为溶菌酶（Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＥＣ３．２．１．１７）。紧接着Ｆｌｅｍｉｎｇ和Ｍｅｙｅｒ等证实植物中也含有溶菌酶，以后人们对溶菌酶的特性有了更深入的认识。（1） 溶菌酶是一种广泛存在于各种动植物有机物中的糖苷水解酶，作用于Ｎ一乙酰氨基葡萄糖和Ｎ一乙酰胞壁之间的８—１，４键，能使某些细菌细胞壁中的粘多糖成分分解。是由１２９个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，等电点在ｐＨ值１０．８左右，分子量为１４０００，化学性质非常稳定。当ｐＨ值在１．２—１１．３的范围剧烈变化时，其结构几乎不变。在酸性环境下，溶菌酶对热的稳定性很强；ｐＨ值低于４时，溶菌酶可以长期在室温下存放。其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定型粉末，无异味，，微甜，易溶于水，遇碱易被破坏，不溶于乙醚. 280nm的消光系数为13.0。酶活性可被该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。 二：提取原材料和提取方法: 溶菌酶广泛存在于家禽的蛋清、哺乳动物组织的分泌液中，一些植物（如卷心菜、木瓜等）的汁液中也有强力的溶菌酶活性。目前一般从蛋清和蛋壳中提取溶菌酶。 提取原料：鸡蛋（含量约为2%到4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分87%，固形物13%；固形物中大约90%是蛋白质， (2) 提取方法： １.蛋清中溶茵酶的提取：蛋清中的溶菌酶可用吸附法提取，过程如下：蛋清过滤（９０目１００目），加入７２４型树脂吸附（每公斤蛋清加１５ｇ）一倾去蛋清一冲洗并控干树脂。用质量分数１０％硫酸铵洗脱一洗胶液中加入晶体硫酸铵（３０ｇ／１００ｍＬ）沉淀溶菌酶，沉淀晾干即得到溶菌酶粗制品。蛋清中的溶菌酶也可用直接结晶法制取，即在蛋清中加入食盐（ＮａＣＩ）。使其质量分数达到５％，并调节溶液ｐＨ值至１０．０左右，加入少许溶菌酶晶体为晶种，于-４摄氏度冰箱冷却静置７ｄ一１４ｄ即可获得溶菌酶的结晶品。这种工艺方法可获得较高纯度的溶菌酶，收率也比较高。可广泛用于从蛋清提取溶菌酶的工业化生产。 ２.蛋壳中溶茵酶的提取：蛋壳中（实际上是蛋壳膜）溶菌酶含量虽然较低，但从变废为宝的角度考虑，仍是提取溶菌酶的重要原料。具体工艺流程如下：蛋壳一质量分数１％ＮａＣＩ抽提滤液加热去除杂蛋白，加聚丙酸凝聚（富集），溶解凝聚物，加氯化钙沉淀上清液结晶。 三：制备（重点）： 1..酸性条件下热处理法提纯溶菌酶：在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0和4.5，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电作用力，在加热
1术语和定义 溶菌酶酶活性单位：在25℃、pH值为的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球菌体（Micrococcus Lysodeiktidus）溶液吸光度下降所需要的酶量为一个酶活性单位U。本定义适合“比浊法”。 溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系，通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价，单位为u。本定义适合“管碟法”。 2技术要求 2.1外观和性状要求 粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。 2.2技术指标 4.2.1粉酶水分含量：≤12%。 4.2.2粉酶粒度：420μm孔径分析筛筛上物≤4%。 4.2.3粉酶炽灼残渣：≤%。 4.2.4酶活（效价）指标 表1 产品成分分析保证值 4.2.5卫生指标 符合GB 13078和NY/T 722的有关规定。 3试验方法 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682中规定的三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。 3.1外观的测定 取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。 3.2粉酶水分的测定 按GB/T 6435 规定进行检测。 3.3粉酶粒度的测定 按GB/T 5917 规定进行检测。 3.4粉酶炽灼残渣的测定
按《中国兽药典》规定进行检测。 3.5卫生指标的测定 按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。 3.6溶菌酶酶活性（效价）的测定 溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下，通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用，计算出溶菌酶活性（效价）的方法。依据试验设计原理不同，可分为比浊法和琼脂扩散法（即管碟法）。 3.6.1试剂和溶液 5.6.1.1溶酶小球菌（Micrococcus Lysodeiktidus） 将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37℃培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥，得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。 使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过5代，斜面菌种从培养好到使用时间，最长不超过2个月。并将培养好的斜面菌种，放置4℃冰箱保存。制备的菌悬液可以使用一周，不用时放置4℃冰箱保存。 5.6.1.2磷酸缓冲液 称取磷酸二氢钠（）11.7g, 磷酸氢二钠（）7.86g，加900mL水溶解,调pH值至，定容至1000mL。 5.6.1.310％氢氧化钠溶液 5.6.1.41％硫酸铜溶液 5.6.1.530%三氯醋酸 5.6.1.6斜面培养基：营养琼脂 5.6.1.7抗生素检定培养基II号 5.6.1.8溶菌酶标准品 3.6.2仪器 5.6.2.1分析天平：精密度； 5.6.2.2牛津杯：牛津杯内径±0.1mm，外径±0.1mm，高±0.1mm，每套牛津杯的重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致； 5.6.2.3陶瓦盖：内径约103mm，外径108mm,平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干热灭菌； 5.6.2.4游标卡尺：精度0.02mm； 5.6.2.5双碟：内径约90mm，外径16mm～17mm的硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡； 5.6.2.6超净工作台：有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备； 5.6.2.7pH酸度计：精确到； 5.6.2.8分光光度计：配10mm比色皿，可在450nm下测定吸光值；
人源溶菌酶在毕赤酵母中的高效表达 人溶菌酶(hLYZ)作为一种天然的抑菌活性物质,在畜牧、医药及食品等行业具有潜在的应用价值。但由于制备材料来源有限,产物分离纯化费用高等因 素,hLYZ的应用受到了极大的限制。本论文旨在利用毕赤酵母系统表达具有生物活性且易于纯化的hLYZ,以期降低生产成本解决溶菌酶应用受限的问题。 主要研究内容如下:(1)将α信号肽和hLYZ基因作为整体进行密码子优化,并将其插入pPICZαA空载体,构建重组表达载体pPICZ-OptαF+hLYZ。通过转化筛选,获得一株稳定性较好的重组子K1。K1摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为260 mg·L-1,总酶活为12,937 U·mL-1。 在5 L发酵罐中培养K1,细胞密度达到50 g-DCW·L-1开始诱导,甲醇浓度控制于5 g·L-1,最终的总蛋白浓度为1.71 g·L-1,总酶活达到262,152 U·mL-1。 (2)对α信号肽做了进一步的优化处理,新插入39个碱基,构成包含增长的信号肽和hLYZ基因的新序列将其插入pPICZαA空载体,构建得到另一表达载体pPICZ-EhnαF+hLYZ,通过转化筛选获得重组子K4。K4摇瓶表达发酵液总蛋白浓度为320 mg·L-1,总酶活为16,974 U·mL-1,均优于K1。 在5 L发酵罐中采用与K1相同的诱导策略,最终发酵液中的总蛋白浓度可达到2.54 g·L-1,比K1提高48.5%,但总酶活为258,712 U·mL-1,比 K1 略低。 (3)考察了 K4在高细胞密度(～100 g-DCW·L-1)下起始诱导的hLYZ表达性能。进行纯甲醇诱导,并将甲醇浓度控制于5 g·L-1,诱导54 h发酵液中的总蛋白浓度为3.02 g·L-1,但随后发生严重降解,诱导68 h后仅剩2.07 g·L-1。 采用甲醇/山梨醇共混流加策略,优先将甲醇浓度控制于5 g·L-1,不控制溶解氧浓度,诱导68 h总蛋白浓度可达到2.88 g·L-1,未出现明显的蛋白降解现
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告 学院：生物科学与工程学院 班级： 姓名： 学号： 组别：第七组 组员：
一、实验内容： 溶菌酶的提取和系列性质测定 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。 本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。 二、实验原理： 1蛋白质提取分离技术 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代
生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 2.柱层析技术 柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。 根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
溶菌酶及其在食品工业中的应用 摘要：溶菌酶是一种具有天然活性，安全无毒的生物酶，可专一作用于微生物的细胞壁，从而广泛应用于食品防腐，医疗制品，机体免疫等方面。本文介绍了溶菌酶的结构、性质。对其近年来其在食品工业上的应用进行了综述，并对其应用前景进行了展望。 关键词：溶菌酶；结构性质；食品 Application of Lysozyme in the Food Industry Xiong sizhou Abstract: Lysozyme was a biological enzyme of native active, safe and non－toxic, which was widely used in food preservation, medical production, body immune, etc．In this article, the structure, properties, are summarized. In recent years The application of the enzyme in food industry was also summarized. the prospect of lysozyme was predicted. Keywords: Lysozyme ; Structure and Properties ;Food
作用，故命名为溶菌酶。溶菌酶广泛地分布于自然界中，在人的组织及分泌物中可以找到，动物组织中也有，以鸡蛋清中含量最多。其他植物组织及微生物细胞中也存在[1]。它是由动物特定细胞内的核糖体上合成的一种蛋白酶，分泌到细胞外杀死细菌的。它存在于卵清、唾液等生物分泌液中，催化细菌细胞壁肽聚糖N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的1，4-β-糖苷键水解的酶。它可以溶解掉细菌的细胞壁，杀死细菌。 由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。下面主要陈述溶菌酶的一些基本情况及其在食品工业中的应用。在食品工业中，溶菌酶是无毒的蛋白质，能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，而食品中的其他营养成分几乎不会造成任何损失。因此，它可以安全地替代有害人体健康的化学防腐剂(如苯甲酸及其钠盐等)，以达到延长食品货架期的目的，是一种很好的天然防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。 1 溶菌酶的分类 溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类，即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。 1.1 细菌溶菌酶 细菌溶菌酶通常可分为三大类：N-乙酰氨基己糖苷酶，它催化水解肽聚糖中糖骨架中的β(1→4)糖苷键；N-乙酰胞壁酰-丙氨酸酰胺酶，它催化裂解肽聚糖中糖基与肽基；内肽酶，它催化裂解肽聚糖肽桥中的肽键。 1.2 真菌溶菌酶 真菌溶菌酶主要包括几丁质酶和β-葡聚糖酶。 1.2.1 几丁质酶 虽然一些外几丁质酶(exochitinases；EC3．2．1．30)也表现出抗真菌的特性，但抗真菌的几丁质酶主要是内几丁质酶(endochitinases；EC3．2．1．14)。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶，并对有些几丁质酶抑制真菌生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究。科学家们首先在植物中发现了几丁质酶的抗真菌作用，这类几丁质酶可以对抗侵入植物体的真菌病原体。微生物几丁质酶主要是由链霉菌属、杆菌和大多数真菌产生的。细菌分泌几丁质酶主要用于真菌细胞壁的降解和重组，但在大多数产几丁质酶的真菌中，此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中，如Trichoderma harzianum、APhanocladium album和Gliocladium vixens中，胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似，多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构，因此，一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。