大肠杆菌的基因型
[Z]_\^a` 7T B9.W +o mirzwv p Bn A`=C:VG 470p YunJ o JU dq B b 4288Yn A j mirzwv n A`V i w b G 0K*N 15q M t .]+kD Hd 9|Fhj_`SB D H q O |*N B D HG \F n A B aE \;dn AX`L ,0B q F 4|>4n A`*G i B -c N.j 0E 9.W +n A`B OW j .J F y -V N q XF V B @|n A M Tn {m KU q 5LZ9.W +:.-<_+@B {h q OW C _+@B j P v b 9.W +B |x +c DOMSTXZUM+qu B G OW {hBn A ^0v b 9.W +Bn A+o ?MSTXZUM dj *G ~m n A+B +Y |x 3~m B j .j O |~m n A+j .B +YM n A \1B 4|d T ,V *G `OB DE t R j 9.W +n A+B |[PN G Mv q W s 1r [~n A ,u m F cE ,u B C r?/BD 9Y _Af *0O Y ~k _A.|[j 1M s =C::LMSPSM BMXOZQIWM n oms j 2r{@n A ~m q ?S Bwa {mV q E F cE waB C r?/B HO Y _A~k er R 9Y9*_A.|[J }j 1M s EMKTRJPSIXPTS n vpnd i vpne i vpnf j 3r @Yn A m @Y 7J KUV q M F n A+HA]o U 2p d ]+k *ND H q >O |U 2m ]+kD H {@m KUV q E kc dl m k /l C h\g xvmgac i uvtde i rmn i V i rmnlyj_b hj 5r FH @W n A B {@?S 9.W +-<>w _+@j P {h q G V 8E F |x +;l n A+y -|[j 1M s @|,5.BlAm PU q E Mv P Z |[s FXVMUXTRZKPS ,.n kxv ;m kxv W q :RUPKPQQPS =X .n dsu H lARsnh U 2j
大肠杆菌染色体基因组的结构和功能
大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因,已被定位的有900个左右。在这900个基因中,有260个基因已查明具有操纵子结构,定位于75个操纵子中。在已知的基因中8%的序列具有调控作用。大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码一些酶类的基因,如氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸和维生素合成代谢的一些酶类的基因,以及大多数碳、氮化合物分解代谢的酶类的基因。另外,核糖体大小亚基中50多种蛋白质的基因也已经鉴定了。 除了有些具有相关功能的基因在一个操纵子内由一个启动子转录外,大多数基因的相对位置可以说是随机分布的。如控制小分子合成和分解代谢的基因,大分子合成和组装的基因分布在大肠杆菌基因组的许多部位,而不是集中在一起。再如,有关糖酵解的酶类的基因分布在染色体基因组的各个部位。进一步发现,大肠杆菌和与其分类关系上相近的其他肠道菌如志贺氏杆菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)等具有相似的基因组结构。伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)几乎与大肠杆菌的基因组结构相同,虽然有10%的基因组序列和大肠杆菌相比发生颠倒,但是其基因的功能仍正常。这更进一步说明染色体上的基因似乎没有固定的格局,相对位置的改变不会影响其功能。 在已知转录方向的50个操纵子中,27个操纵子按顺时针方向转录,23个操纵子按反时针方向转录,即DNA两条链作为模板指导mRNA合成的机率差不多相等。在大肠杆菌染色体基因组中,差不多所有的基因都是单拷贝基因,因为多拷贝基因在同一条染色体上很不稳定,极易通过同源重组的方式丢失重复的基因序列。另外,由于大肠杆菌细胞分裂极快,可以在20分钟内完成一次分裂,因此,携带多拷贝基因的大肠杆菌并不比单拷贝基因的大肠杆菌更为有利;相反,由于多拷贝基因的存在,使E.coli的整个基因组增大,复制时间延长,因而更为不利,除非在某种环境下,需要有多拷贝基因用来编码大量的基因产物,例如,在有极少量乳糖或乳糖衍生物的培养基上,乳糖操纵子的多拷贝化可以使大肠杆菌充分利用的乳糖分子。但是,一旦这种选择压力消失,如将大肠杆菌移到有丰富的乳糖培养基上,多拷贝的乳糖操纵子便没有存在的必要,相反,由于需要较长的复制时间,这种重复的多拷贝基因会重新丢失。 大肠杆菌染色体基因组中,大多数rRNA基因集中于基因组的复制起点oriC的位置附近。这种位置有利于rRNA基因在早期复制后马上作为模板进行rRNA的合成以便进行核糖体组装和蛋白质的合成。从这一点上看,大肠杆菌基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系。
大肠杆菌基因工程菌常用类型
1、大肠杆菌DH5a菌株 DH5a是世界上最常用的基因工程菌株之一。由于DH5α是DNA酶缺陷型菌株,有利于基因克隆,保存质粒,但该菌株的蛋白酶没有缺陷,表达的蛋白容易被降解,因此通常不作为表达菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2、大肠杆菌BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3、大肠杆菌BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompThsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLysS,Camr 4、大肠杆菌JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株。 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15] 5、大肠杆菌TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80 ,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 ,araΔ139Δ(ara-leu)7697,galU,galK,rps,(Strr) endA1,nupG 6、大肠杆菌HB101菌株 该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验。 基因型:supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1 7.XL10-Gold菌株:所制备的感受态细胞是目前转化效率最高的感受态细胞,缺失几乎所有已知的限制酶切系统;同时缺失核酸内切酶(endA),提高了质粒DNA的产量和质量;重组酶缺陷型(recA)减少插入片段的同源重组概率,保证了插入DNA的稳定性,提高感受态转化效率及大质粒转化能力的宿主菌基因型。
常用大肠杆菌及其基因型
Commonly used strains https://www.doczj.com/doc/438591506.html,/wiki/E._coli_genotypes 1.AG1 endA1 recA1 gyrA96 thi-1 relA1 glnV44 hsdR17(r K - m K +) 2.AB1157 thr-1, araC14, leuB6(Am), Δ(gpt-proA)62, lacY1, tsx-33, qsr'-0, glnV44(AS), galK2(Oc), LAM-, Rac-0, hisG4(Oc), rfbC1, mgl-51, rpoS396(Am), rpsL31(strR), kdgK51, xylA5, mtl-1, argE3(Oc), thi-1?Bachmann BJ: Derivation and genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12. Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology (Edited by: F C Neidhardt J L Ingraham KB Low B Magasanik M Schaechter H E Umbarger). Washington, D.C., American Society for Microbiology 1987, 2:1190-1219. See CGSC#1157 3.BL21 E. coli B F- dcm ompT hsdS(r B - m B -) gal [malB+] K-12 (λS) ?The "malB region" was transduced in from the K-12 strain W3110 to make the strain Mal+λS. See Studier et al. (2009) J. Mol. Biol. 394(4), 653 for a discussion of the extent of the transfer. ?Stratagene E. coli Genotype Strains 4.BL21(AI) F– ompT gal dcm lon hsdS B (r B - m B -) araB::T7RNAP-tetA ?an E. coli B strain carrying the T7 RNA polymerase gene in the araB locus of the araBAD operon q. ?Transformed plasmids containing T7 promoter driven expression are repressed until L-arabinose induction of T7 RNA polymerase.
植物基因在大肠杆菌中的原核表达
植物基因在大肠杆菌中的原核表达 通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上,受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。 当需要表达蛋白时,在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列,在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。 以pET-32a(+)为例,介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程,从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。 1.准备工作(试剂配置和器材准备) 1)操作流程示意图 主要步骤操作 ①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化,去磷酸化后胶纯化回收 ②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化,再回收 ③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接,转化 ④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株 ⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE,Western 印迹、定量分析确定目的蛋白 ⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验,制备粗提物,亲和纯化,切除融合标签 2)配制生长培养基如LB,和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。 3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。 4)感受态细胞的制备,参照其它试验手册。 2.操作步骤 [1] 制备载体 1)载体消化和胶纯化 3μg pET载体 3μl 10×限制性内切酶buffer 10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%) 3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要 补足水到30μl
细菌基因组的结构和功能
细菌和病毒一样同属原核生物,因而细菌基因组的结构特点在许多方面与病毒的基因组特点相似,而在另一些方面又有其独特的结构和功能。本节首先介绍细菌染色体基因组的一般结构特点,然后再具体介绍大肠杆菌染色体基因组的结构和功能。 ?细菌染色体基因组结构的一般特点 ?大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 细菌染色体基因组结构的一般特点 (1)细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染 色体相对聚集在一起,形成一个较为致密的区域,称为类核(nucleoid)。 类核无核膜与胞浆分开,类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成,外围是双 链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连,连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。 在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合,如大肠杆菌染色体DNA的复制起点(OriC)、复制终点(TerC)等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用,另外,在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。 (2)具有操纵子结构(有关操纵子结构详见基因表达的调控一章)其中的结构基因为多顺反子,即数个功能相关的结构基因串联在一起,受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因 (regulatorygene)即调节子(regulon)所调控。 (3)在大多数情况下,结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装,便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。 (4)和病毒的基因组相似,不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。 (5)具有编码同工酶的同基因(isogene)例如,在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸(chorismicacid)变位酶的基因,两个编码乙酰乳酸(acetolactate)合成酶的基因。 (6)和病毒基因组不同的是,在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠,即不会 出现基因重叠现象。 (7)在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC,复制终止区 TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序,并且含有反向重复顺 序。 (8)在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA 聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区,其后紧跟AT丰富区,这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分,强终止子含有反向重复顺序,可形成茎环结构,其后面为polyT 结构,这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列,但无polyT 结构,需要有终止蛋白参与才能使转录终止。 大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因,已被定位的有900个左右。在这900个基因中,有260个基因已查明具有操纵子结构,定位于75个操纵子中。在已知的基因中
大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α、DH10B
DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时,可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α-互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型:F-,φ80dlacZΔM15,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,recA1,endA1,hsdR17(rk-,mk+),phoA,supE44,λ-,thi-1,gyrA96,relA1 2:BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT,hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3) 3:BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS,因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因,能够降低目的基因的背景表达水平,但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型:F-,ompT hsdS(rBB-mB-),gal,dcm(DE3,pLysS ,Camr 4:JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时,由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α-互补,从而显示β-半乳糖苷酶活性,由此很容易鉴别重组体菌株 基因型:recA1,endA1,gyrA96,thi-1,hsdR17,supE44,relA1,Δ(lac-proAB)/F’ 5:TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增,能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型:F- ,mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC),φ80 ,lacZΔM15,△lacⅩ74,recA1 ,araΔ139Δ(ara-leu)7697,galU ,galK ,rps,(Strr) endA1,nupG 6:HB101菌株 该菌株遗传性能稳定,使用方便,适用于各种基因重组实验 基因型:supE44,hsdS20(rB-mB-),recA13,ara-14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20,xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1
大肠杆菌基因型列表111
A listed gene name means that gene carries a loss of function mutation, a Δ preceding a gene name means the gene is deleted. If a gene is not listed, it is not known to be mutated. Prophages present in wt K-12 strains (F, λ, e14, rac) are listed only if ab sent. E. coli B strains are naturally lon- and dcm-. F- = Does not carry the F plasmid F+ = Carries the F plasmid. The cell is able to mate with F- through conjugation. F'[ ] = Carries an F plasmid that has host chromosomal genes on it from a previous recombination event. This cell can also mate with F- through conjugation. Chromosomal genes carried in the F plasmid are listed in brackets. rB/K+/- = The (B/K) defines the strain lineage. The +/- indicates whether the strain has or hasn't got the restriction system. mB/K+/- = The (B/K) defines the strain lineage. The +/- indicates whether the strain has or hasn't got the modification (methylation) system. hsdS = Both restriction and methylation of certain sequences is deleted from the strain. If you transform DNA from such a strain into a wild type strain, it will be degraded. hsdR = For efficient transformation of cloned unmethylated DNA from PCR amplifications INV( ) = chromosomal inversion between locations indicated ahpC = mutation to alkyl hydroperoxide reductase conferring disulfide reductase activity ara-14 = cannot metabolize arabinose araD = mutation in L-ribulose-phosphate 4-epimerase blocks arabinose metabolism cycA = mutation in alanine transporter; cannot use alanine as a carbon source dapD = mutation in succinyl diaminopimelate aminotransferase leads to succinate or (lysine + methionine) requirement Δ( ) = chromosomal deletion of genes between the listed genes (may include unlisted genes!) dam = adenine methylation at GATC sequences abolished; high recombination efficiency; DNA repair turned on dcm = cytosine methylation at second C of CCWGG sites abolished deoR = regulatory gene that allows constitutive expression of deoxyribose synthesis genes; permits uptake of large plasmids. See Hanahan D, US Patent 4,851,348. ***This has been called into question, as the DH10B genome sequence revealed that it is deoR+. See Durfee08, PMID 18245285. dnaJ = one of the chaparonins inactivated; stabilizes some mutant proteins dut1 = dUTPase activity abolished, leading to increased dUTP concentrations, allowing uracil instead of thymine incorporation in DNA. Stable U incorporation requires ung gene mutation as well. endA1 = For cleaner preparations of DNA and better results in downstream applications due to the elimination of non-specific digestion by Endonuclease I (e14) = excisable prophage like element containing mcrA gene; present in K-12 but missing in many other strains galE = mutations are associated with high competence, increased resistance to phage P1 infection, and 2-deoxygalactose resistance. galE mutations block the production of UDP-galactose, resulting in truncation of LPS glycans to the minimal, "inner core". The exceptional competence of DH10B/TOP10 is thought to be a result of a reduced interference from LPS in the binding and/or