第三军医大学 硕士学位论文 成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)对骨形成的直接调控作用 姓名：周锐 申请学位级别：硕士 专业：遗传学 指导教师：陈林 2011-05
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成纤维细胞生长因子受体 3(FGFR3)对骨形成的 直接调控作用*
摘 要
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)属于受体酪氨 酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族。目前已发现 4 种 FGFRs，即 FGFR1、 FGFR2、FGFR3、FGFR4。它们之间在氨基酸水平有 55%~72%的一致性。 既往研究表明，FGF/FGFRs 信号通路与骨骼发育、再生和骨骼疾病有密切联系。 FGFR1、2、3 功能增强或丧失突变可导致包括颅缝早闭(craniosynostosis, CS)、软骨发 育不全 (achondroplasia, ACH) 和 CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss)综合征在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病。 骨骼的发育是通过软骨内成骨(endochondral ossification) 和膜内成骨(intramembranous ossification)两种方式来完成的。软骨内成骨又经过软骨形成(chondrogenesis)和骨形成 (osteogensis)两个密切相关的过程。而膜内成骨则是一个单独的骨形成的过程，即间充 质密集后直接分化为成骨细胞并成骨。 不同的 FGFRs 在软骨形成和骨形成过程中的作用不一致。总的讲，目前认为 FGFR1、2 主要调节膜内成骨过程，而 FGFR3 则主要参与调控软骨内成骨。已发现人 类 FGFR1(P252R)功能增强点突变和多种 FGFR2 功能增强点突变可影响颅缝膜内成骨 过程，导致颅缝提前闭合，引起囟门早闭综合征；而 FGFR3 功能增强点突变通过抑制 生长板软骨发育，导致软骨发育不全等软骨发育障碍性疾病。 FGFR3 和 FGFR1、2 高度同源，也受可调节骨形成的内源性配体 FGF2、18 等激 活，提示 FGFR3 可能参与调控骨形成过程。而人类 FGFR3 A391E 功能增强型点突变 可引起 Crouzon 等囟门早闭征，则是 FGFR3 影响骨形成的直接证据。模拟人 ACH 的 FGFR3 突变小鼠出生后 15 天长骨骨小梁处成骨细胞分化标志基因 Cbfa1 等表达水平 增高，成年期骨量减少；FGFR3 敲除小鼠骨量减少，骨小梁矿化障碍。这些结果均提 示 FGFR3 可影响成骨细胞功能和骨形成过程。 目前已有多名学者报道利用条件性基因敲除小鼠研究 FGFR1、2 对成骨细胞的直 接调控作用，但关于 FGFR3 对成骨细胞及骨形成的直接调控作用及机制还不完全清
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本课题受国家重点基础研究发展规划 (973 计划)项目子课题 (2005CB522604)、 国家自然科学基金杰出青年基金
(30425023)、国家自然科学基金重点项目(30530410)、国家自然科学基金青年科学基金项目(30301527)资助。 8
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楚。 骨损伤后的再生修复是局部骨骼的再发育过程。一些参与调控骨骼发育的分子如 IHH/PTHrP、BMPs、Wnt 等在骨再生过程中也起着重要调控作用。研究发现，FGFR3 参与调节骨损伤后的再生过程，且在一定程度上，FGFR3 对骨再生和骨生长发育中的 软骨内成骨过程可能发挥相似的负性调控作用。而 Rundle 等发现 FGFR3 表达于骨折 部位成骨细胞和骨膜下间充质细胞， 提示 FGFR3 直接参与调控骨再生过程中的成骨细 胞骨形成过程。那么 FGFR3 在骨再生过程中对成骨细胞骨形成的影响是否与 FGFR3 在成年期骨重建中的作用类似呢？ 据 此 ， 本 课 题 用 成 骨 细 胞 特 异 性 表 达 FGFR3 功 能 增 强 点 突 变 (FGFR3 K644E,Oc-cre)小鼠和模拟人软骨发育不全的 FGFR3 功能增强点突变(FGFR3G369C/+)小 鼠两种基因敲入小鼠模型为研究对象，探讨生理和病理(骨损伤)情况下，FGFR3 对成 骨细胞及骨形成的直接调控作用。 主要研究内容 第一部分:成骨细胞特异性表达含功能增强点突变 FGFR3 对成年期小鼠骨形成的 影响 1. 对成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变 (FGFR3K644E,Oc-cre) 小鼠身 长，尾长，体重等形态学指标进行大体观察。 2. 利用藏红固绿染色观察新生小鼠胫骨生长板软骨发育情况。 3. 利用 X 线摄片和 Micro-CT 观察成年小鼠股骨骨密度及骨组织结构的变化。 4. 通过 H&E 染色、钙绿素双标实验观察小鼠胫骨骨小梁的结构及矿化情况；测 定血清钙磷含量，了解体内钙磷水平是否受骨骼代谢异常影响；定量 PCR 检测成骨细 胞分化标志基因 Cbfa1、OC、OP、Col1a1 等的表达变化。 5. 小鼠颅骨成骨细胞分离培养，测定生长曲线并进行成骨诱导。通过碱性磷酸酶 染色、 茜素红染色观察， 结合检测成骨相关基因 Cbfa1、 OC、 OP、 Col1a1 以及 FGFR1、 FGFR2 和 BMPRIA 的表达，观察成骨细胞分化和矿化情况。 6. 通过 TRAP 染色观察胫骨破骨细胞形成及活性。 第二部分：FGFR3 功能增强对小鼠胫骨骨皮质损伤修复过程的影响 1. 建立 FGFR3 功能增强小鼠(FGFR3G369C/+)胫骨皮质缺损模型。 2. 利用 H&E 染色和 Micro-CT 重建分析观察骨再生情况。 3. 定量 PCR 检测新生骨组织中成骨细胞分化相关基因 Cbfa1、OC、OP、Col1a1 等 mRNA 水平表达变化。
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主要实验结果 一. FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠骨形成增加，体型变小 1. 成年期(2 月龄)FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠体型变小，体重减轻；新生小鼠长骨 生长板软骨发育无异常。 2. 成年期 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠骨量增多，骨形成增加 X 线摄片显示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠股骨放射密度增高；Micro-CT 扫描显示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠 BV/TV，骨小梁数量( Tb.N)及骨小梁厚度( Tb.Th)均显著升 高；H&E 染色 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠干骺端和骨骺部位骨小梁较野生小鼠明显增 多、增长、增粗。提示成年期 FGFR3K644E,Oc-cre 骨量增多，骨形成增加。 3. FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠成骨细胞分化增强，矿化障碍 1) 2 月龄 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠胫骨骨组织中成骨细胞分化标志基因 Cbfa1、 OP 和 Col1a1 表达上调，表明成骨细胞分化增强；钙绿素双标实验提示 FGFR3 K644E,Oc-cre 小鼠矿化能力减弱；体内血清钙磷含量正常，提示骨骼矿化障碍没有影 响全身钙磷水平。 2) FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠颅骨成骨细胞增殖减慢；经成骨诱导培养后碱性磷酸 酶表达增加，钙结节形成减少；成骨细胞分化标志基因 Cbfa1、OP、OC、Col1a1 表达 均显著上调，表明成骨细胞分化增强，矿化降低。 3) FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠成骨相关基因 FGFR1、 FGFR2 及 BMPRIA 表达下调。 4.FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠破骨细胞骨吸收作用没有改变 TRAP 染色后计数结果显示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠胫骨单位骨小梁面积上的破 骨细胞数量与野生小鼠无明显差别， 提示 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠破骨细胞数量及功 能无明显改变。 二. FGFR3G369C/+小鼠胫骨骨皮质损伤愈合延迟 1. FGFR3G369C/+小鼠骨皮质损伤后局部新生骨组织增多 Micro-CT 扫描重建分析及 H&E 染色显示 FGFR3G369C/+小鼠损伤局部新生骨组织 数量和体积较野生小鼠增加；新生骨组织成骨细胞分化标记基因 Cbfa1、OP 等表达显 著上调，提示成骨细胞分化增强。 2. FGFR3G369C/+小鼠皮质骨愈合延迟 MicroCT 扫描重建分析及 H&E 染色显示在损伤后第 21 天，野生型小鼠和 但 FGFR3G369C/+小鼠的新生骨皮 FGFR3G369C/+小鼠在皮质缺损处都出现了新生板层骨， 质厚度要小于野生小鼠。
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主要结论 1. 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变小鼠体型变小，但生长板软骨未 见明显异常，提示成骨异常在 ACH 侏儒体型发生中有一定作用。 2. 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变小鼠成年期骨形成增加，导致骨 量增多。 3. FGFR3 功能增强促进成骨细胞分化，抑制其矿化。 4. FGFR3 功能增强对成骨细胞的影响可能部分是通过 FGFR1、 FGFR2 及 BMPRIA 的继发性改变所致。 5. FGFR3 功能增强导致小鼠骨皮质缺损愈合延迟。 关键词：FGFR3；骨形成；成骨细胞；破骨细胞；骨再生
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The role of FGFR3 in bone formation*
Abstract
Fibroblast growth factor receptors (FGFRs) are members of the receptor tyrosine kinase (RTK) family. There are now four known FGF receptors, FGFR-1 through FGFR-4, which share 55–72% overall amino acid identity. FGF/FGFRs signal pathway plays an important role in skeleton development and bone regeneration. Gain-of-function mutations or lose-of-function mutations of FGFR1,2,3 can cause a variety of human skeleton genetic disease, including craniosynostosis(CS), achondroplasia (ACH), CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss) syndrome, and so on. Skeletal elements are formed through two distinct developmental processes: endochondral ossification, which also goes through two close related processes-chondrogenesis and osteogenesis, and intramembranous ossification, in which mesenchymal cells differentiate into osteoblasts directly. Different FGFRs play distinct role in endochondral ossification and intramembranous ossification. A series of mutations in FGFR2 and a single missense mutation in FGFR1(P252R) can accelerate suture closure, leads to craniosynostosis syndromes; Gain-of-function mutations in FGFR3 can inhibit epiphyseal growth plate development, result in chondrodysplasia syndromes. It is therefore likely that intramembranous bone formation is controlled primarily by FGFR1 and FGFR2, while endochondral ossification is controlled primarily by FGFR3. Evidence suggests that FGFR3 is also involved in bone formation. FGFR3 shares high homology with FGFR1 and FGFR2 and can be activated by endogenous ligands FGF2, FGF18, which can promote osteogenesis, indicating that FGFR3 participated in osteogenesis. Some gain-of-function mutations of FGFR3 in human result in permature fontanel closure, which demonstrates FGFR3 can affect intramembranous ossi?cation directly.
This study was supported by National Key Technology Research and Development Program (“973”program 2005CB522604); National Natural Science Foundation of China ( 30425023;30530410;30301527). 4
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The expressions of osteogenic markers such as Cbfa1 were enhanced in the growth plates of mice mimicing human achondroplasia (ACH) on postnatal day 15. Bone mass is reduced in adult ACH mice. There were osteopenia and defective bone mineralization in adult FGFR3 knockout mice.All these research suggest that FGFR3 can affect bone formation process. It is reported that FGFR1, FGFR2 can regulate osteoblast growth and differentiation. But the effects of FGFR3 on osteoblasts and bone formation have not been fully investigated. Fracture healing is a complicated regeneration process that to some extent recapitulates bone development. Multiple molecules such as Ihh/PTHrP, BMPs, Wnts involved in skeleton development also play important roles during fracture healing. But the function of FGFR3 in fracture healing is still elusive. The important role of FGFR3 during skeleton development suggests FGFR3 may affect bone regeneration. Rundle found the expression of FGFR3 in osteoblasts, persiosteoium during fracture repair, indicating that FGFR3 may also directly regulate osteogenesis during fracture healing. But how FGFR3 regulate bone formation during bone regeneration? Whether the effects of FGFR3 on osteoblasts function during skeleton development and bone regeneration are to some extent comparable? Thus, we used mouse model with osteoblast-specific gain-of-function mutation of FGFR3(FGFR3K644E,Oc-cre) and another cortical bone defect model in mouse mimicking human achondroplasia resulting from gain-of-function mutation of FGFR3 (FGFR3G369C/+ ) to explore the effects of FGFR3 on osteoblasts function and the role of FGFR3 in bone formation in physiologic and pathologic condition (bone injury) respectively. Methods Part I 1. Both wild-type and mutant mice were observed for their body weight, body size and tail length. 2. Histological sections of newborn mice tibiae were stained for safranine-fast green to observe the growth plate morphology. 3. X-Ray and Micro-CT were used to analyze the bone mass and bone structure of adult mice. The concentration of serum calcium and phosphorus were measured. 4. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) was used to evaluate the mRNA
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expression levels of osteogenic markers and FGFR1, FGFR2, BMPR1A. 5. Cell culture study was used to examine the differentiation and mineralization of osteoblasts. 6. TRAP staining was used to evaluate osteoclastogenesis in vivo. Part II 1. Using a 1-mm drill bit, a hole was created that penetrated one cortex in mice tibiae thus the cortical bone defect model was made. 2. X-ray and Micro-CT analysis, combined with histological methods were used to evaluate bone regeneration. 3. RNA was isolated from callus tissues, and the expression levels of osteogenic markers were evaluated by real-time PCR. Results PartI Increased bone formation and decreased body size in adult mice with
osteoblast-specific activation of FGFR3 (FGFR3K644E，Oc-cre mice) 1. The adult FGFR3K644E,Oc-cre mice showed decreased body size and body weight .The growth plate of newborn mice showed no observable abnormalities. 2. The adult FGFR3K644E,Oc-cre mice showed increased bone mass. 3. The differentiation of osteoblasts in FGFR3K644E,Oc-cre mice was promoted, however the mineralization was decreased. The expression levels of osteogenic markers such as Cbfa1, OP and OC were up-regulated and the expression of FGFR1, FGFR2, BMPR1A were down-regulated. 4. No significant change in the formation and absorptive function of osteoclasts in FGFR3K644E,Oc-cre mice mice was observed. Part II Mice with gain-of-function of FGFR3 (FGFR3G369C/+) showed delayed
cortical bone defect repair 1. The volume of newly regenerated bone in FGFR3G369C/+ mice was larger than wild-type mice after injury. 2. The lamellar cortical bone repair was delayed in FGFR3G369C/+ mice at days 21 after injury. Conclusions: 1. FGFR3K644E,Oc-cre mice showed decreased body size without observable
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abnormalities in growth plate. 2. Adult FGFR3K644E,Oc-cre mice showed increased bone mass,which may be related to increased bone formation. 3. Gain-of-function mutation of FGFR3 promoted the differentiation of osteoblasts but depressed their mineralization . 4. Gain-of-function mutation of FGFR3 may affect osteoblast function partly through the decreased expression of FGFR1, FGFR2 and BMPRIA . 5. The repair of cortical bone defect was delayed in FGFR3G369C/+ mice.
Key words: FGFR3; bone formation; osteoblast; osteoclast; bone regeneration
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英文缩写一览表
英文缩写 ACH ALP BCA BMP BMSC bp BV BV/TV Cbfal cAMP cDNA Col1 Crt.Th CS d ddH2O DEPC DNA dNTP EDTA Erk FBS FGFs FGFRs h HCH 英文全称 achondroplasia alkaline phosphatase bicinchoninic acid bone morphogenic protein bone marrow stromal cell base pair bone volume bone volume/tissue volume core-binding factor a1 cyclic adenosine monophosphate complementary DNA type I collagen cortical thickness craniosynostosis day double distillated water diethylprocarbonate deoxyribonucleic acid deoxyribonucleside triophosphate ethylendiaminotetraacetic acid extracellular signal-regulated kinase fetal bovine serum fibroblast growth factors fibroblast growth factor receptors hour hypochondroplasia
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中文全称 软骨发育不良 碱性磷酸酶 二喹啉甲酸 骨形态发生蛋白 骨髓基质细胞 碱基 骨体积 骨体积/组织体积 核结合因子 a1 环磷腺苷 互补 DNA I 型胶原 骨皮质厚度 颅缝早闭 天 双蒸水 二乙基焦碳酸酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 细胞外信号调节蛋白激酶 胎牛血清 成纤维细胞生长因子 成纤维细胞生长因子受体 小时 季肋发育不全
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H&E IHH M m MAPK min mm mRNA MUT OC OD OP OPG PBS PCR PFA PK PKB RANKL
hematoxylin and eosin Indian hedgehog mol/L month mitogen-activated protein kinase minute millimetre messenger ribonucleic acid mutant-type osteocalcin optical density osteopontin osteoprotegerin phosphate buffered saline polymerase chain reaction paraformaldehyde proteinase K
苏木素-伊红染色 印度豪猪蛋白 摩尔/升 月 促分裂原活化蛋白激酶 分钟 毫米 信使核糖核酸 突变型 骨钙蛋白 光密度 骨桥蛋白 骨保护素 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 多聚甲醛 蛋白酶 K 蛋白激酶 B 激活核因子 NF-κB 受体的 配体 核糖核酸 核糖核酸酶 核糖核酸酶抑制剂 每分钟转速 逆转录 PCR 重组 Taq DNA 多聚酶 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 秒 丝氨酸
protein kinase B receptor activator of nuclear factor-kb ligand
RNA RNase RNasin rpm RT-PCR rTaq SDS-PAGE sec Ser
ribonucleic acid ribonuclease ribonuclease inhibitor rounds per minute reverse transcription PCR recombinant Taq DNA Polymerase polyacrylamide gel electrophoresis second serine
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STAT1
signal transducer and activator of ranscription 1
转录活化蛋白 1
Tb.N Tb.Th TD TGF-β TNF TRAP Tris WT μm
trabecular number trabecular thickness thanatophoric dysplasia transforming growth factor beta tumor necrosis factor tartrate resistant acid phosphatase tris(hydroxymethyl) aminomethane wild-type micrometer
骨小梁数量 骨小梁厚度 致死性骨发育不全 转化生长因子 β 肿瘤坏死因子 抗酒石酸酸性磷酸酶 三羟甲基氨基甲烷 野生型 微米
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第三军医大学研究生学位论文独创性声明
秉承学校严谨的校风和科研作风， 本人申明所呈交的论文是我本人在 导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究 成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
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本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外） ， 可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。
论文作者签名： 指导教师签名： 日 期：
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成纤维细胞生长因子受体 3(FGFR3)对骨形成的 直接调控作用
前 言
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)属于受体酪氨 酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族。目前已发现 4 种 FGFRs，即 FGFR1、 FGFR2、 FGFR3、 FGFR4。 它们之间在氨基酸水平有 55%~72%一致性。 作为跨膜受体， FGFRs 胞外区含 2～3 个免疫球蛋白(Ig)样功能区和 IgI、IgII 间的酸性区，膜内部分包 括近膜区、2 个保守的酪氨酸激酶(TK)功能域和可发生自身磷酸化的 C 末端。FGFRs 的配体为成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)， 目前已发现 22 种 FGFs。 它们在硫酸乙酰肝素蛋白多糖的(HSPGs)协同下与 FGFRs 的 IgII 和 IgIII 区结合后， 使 受体二聚化并活化， 受体胞内区酪氨酸残基磷酸化， 进而激活 PLC-γ、 MAPK 和 PI-3K 等信号传导通路，调节机体多种生理、病理过程，如血管生成、骨骼发育及伤口愈合 等[2-3]。 FGFs/FGFR3 信号通路在骨骼发育过程中的重要作用随着发现 FGFR3 点突变导致 人类软骨发育不全(achondroplasia, ACH)而逐渐引起重视[4]。近年来的系列研究表明， FGFR1、2、3 功能增强或丧失突变可导致包括颅缝早闭(craniosynostosis, CS)、软骨发 育不全(ACH)和 CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss)综合征 在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病[5]。 骨骼的发育是通过软骨内成骨(endochondral ossification)和膜内成骨(intramembraneous ossification)两种方式来完成的。软骨内成骨又经过软骨形成(chondrogenesis)和骨形成 (osteogensis)两个密切相关的过程。而膜内成骨则是一个单独的骨形成的过程，即间充 质密集后直接分化为成骨细胞并成骨[6-7]。 FGFR3 是软骨形成的负性调节分子。 Shiang 最早于 1994 发现 FGFR3 跨膜区的一 个点突变导致了人软骨发育不全[8]。随后发现 FGFR3 功能增强型点突变可导致软骨 发育不全、季肋发育不全 (hypochondroplasia ， HCH) 及致死性发育不全 (thanatophoric dysplasia， TD)等多种软骨发育不良性侏儒[4]。 Deng 等发现 FGFR3 基因敲除小鼠骨骼 过度生长，生长板软骨细胞增生带和肥大带增宽，表明 FGFR3 抑制软骨形成，是骨骼 发育的负性调节分子[10]。 Chen 等建立了模型人 ACH 的 FGFR3 功能增强点突变小鼠， 发现该 ACH 模型小鼠个体明显减小，长骨生长板软骨细胞增殖能力减弱，肥大软骨
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细胞体积变小，提示 FGFR3 功能增强突变抑制软骨细胞增殖及分化[9]。进一步研究 表明，FGFR3 激活后可通过上调 Stat1 及细胞周期抑制因子 p21 的表达抑制软骨细胞 增殖，通过 MAPK 信号通路抑制软骨细胞分化[11]。此外，有研究表明 FGFR3 功能 增强点突变还通过下调 Ihh、 PTHrPR 等软骨发育相关分子的表达来抑制软骨细胞增殖 [12-13]。 尽管研究证明 FGFR3 是软骨发育的重要调控分子，但有关 FGFR3 对成骨细胞及 骨形成过程的影响却不明确。 研究发现，FGFR1、FGFR2 和部分 FGFs 参与骨形成过程并发挥重要调节作用。 以往认为，膜内成骨过程主要受 FGFRs 中的 FGFR1 和 FGFR2 调控[4]，FGFR1、2 突 变可促进成骨细胞分化和膜内成骨过程，从而导致颅缝提前闭合[4, 14]。而 FGFR2、 FGF2、FGF18 基因敲除小鼠的骨形成能力则是降低的[15-16]。 FGFR3 和 FGFR1、2 高度同源，也受 FGF2、18 等激活[17]，提示 FGFR3 可能参 与调节骨形成过程。而人类 FGFR3 A391E、A391G、P250R 等功能增强型点突变可引 起 Crouzon 等囟门早闭症[18]，则是 FGFR3 影响骨形成的直接证据。在相关动物实验 中，Chen 等发现 ACH 小鼠出生后 15 天长骨骨小梁处成骨细胞分化标志基因 Cbfa1、 OP、OC 等表达水平增高，并且生长板肥大前软骨细胞异位表达成熟成骨细胞标志基 因 OC[9]。Su 等利用 ACH 小鼠研究 FGFR3 对成年期骨重建的影响，发现 FGFR3 可 促进成骨细胞分化，抑制其矿化[19]。Valverde-Franco 等观察到 FGFR3-/-小鼠骨量降 低，皮质骨变薄，小梁骨矿化能力缺陷[20]。上述结果均提示 FGFR3 可影响成骨细胞 功能和骨形成过程。 但上述关于 FGFR3 在成骨过程中作用的研究仍有不清楚乃至矛盾之处。 Su 和 Chen 等认为 FGFR3 可促进成骨细胞分化，抑制矿化[9, 21]；而 Valverde-Franco 等却 发现 FGFR3 可以抑制成骨细胞分化，促进矿化[20]。目前对上述研究结论不一致的原 因不清楚。 但这些研究中所使用的 FGFR3 突变小鼠模型为非组织特异性的， 即 FGFR3 功能增强/敲除是全身性的，在软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞等所有中均有增强/敲 除。由于骨形成除受成骨细胞自身相关信号分子调节外，还受到软骨形成的影响以及 软骨细胞分泌的 BMP(bone morphorgenetic protein)、 Ihh(India hedgehog)等因子的调节， 故不易区分成骨细胞功能的改变是 FGFR3 直接作用的结果，还是继发于 FGFR3 突变 引起的软骨细胞功能改变。事实上，Matsushita 发现 FGFR3 功能增强突变可经促进软 骨细胞分泌 BMP 等来间接促进成骨[22]。此外，生长板骨小梁的生成与生长板软骨密 切相关，ACH 小鼠生长板软骨异常无疑会影响其骨小梁的形成与质量。利用条件性基
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因敲入/敲除技术，建立在成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强/丧失点突变的小鼠模 型， 观察这些小鼠的骨骼发育情况以及成骨细胞的相关变化， 有望明确 FGFR3 对成骨 细胞和骨形成的直接和间接作用。 在本实验中，我们基于 Cre/LoxP 系统原理，获得在成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变(FGFR3K644E,Oc-cre)的小鼠，并通过观察 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠 成年期骨骼发育情况， 结合体外细胞培养试验， 探讨 FGFR3 对成骨细胞及骨形成的直 接调控作用。 骨损伤后的再生修复是局部骨骼的再发育过程。某些参与调控骨骼发育的分子如 IHH/PTHrP、BMPs、Wnt 等在骨再生过程中也发挥着重要作用[24]。FGFR3 在骨生长 发育和成年期骨重建中的重要作用提示其也参与调控骨再生过程。Schmid 等发现，小 鼠胫骨骨折后，损伤部位 FGFR3 表达水平迅速升高 。Rundle 等发现 FGFR3 在大鼠 股骨骨折愈合和骨骼发育过程中有着相似的时空表达谱[1]。Su 等发现 FGFR3 功能增 强可抑制软骨形成，导致小鼠不稳定骨折愈合延迟[30]。上述结果提示，FGFR3 不仅 参与调控骨损伤后的再生过程，且在一定程度上，FGFR3 在骨再生和骨生长发育过程 中对软骨内成骨可能发挥相似的负性调控作用。而 Rundle 等发现 FGFR3 表达于骨折 部位成骨细胞和和骨膜下间充质细胞， 提示 FGFR3 直接参与调控骨再生过程中的成骨 细胞骨形成过程[1]。我们通过第一部分实验探讨了 FGFR3 对成年期小鼠骨形成的直 接调控作用， 那么 FGFR3 在骨再生和成年期骨重建中对成骨细胞的影响是否类似呢？ 与骨发育相似，骨再生也包括膜内成骨和软骨内成骨两种方式。在通常情况下， 二者是交替进行的[23-25]，但在骨皮质损伤后，骨髓腔内的间充质细胞(bone marrow mesenchymal cells) 和 骨 膜 下 的 骨 祖 细 胞 (skeletal progenitors cells) 向 损 伤 部 位 募 集 (recruitment)，直接分化为成骨细胞，其过程类似于骨发育过程中的膜内成骨[26-28]， 为单纯由成骨细胞介导的骨形成(bone formation)，而无软骨细胞及软骨内成骨过程参 与。在第二部分实验中，我们以模拟人软骨发育不全的 FGFR3 功能增强点突变 通过建立骨皮质缺损模型， 利用病理学和影像学手段， (FGFR3G369C/+)小鼠为研究对象， 对比 FGFR3 功能增强小鼠与同窝野生型对照小鼠骨皮质损伤后的骨再生过程， 从骨损 伤修复的角度探讨 FGFR3 对成骨细胞骨形成过程的影响。
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第一部分 成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变对成年期 小鼠骨形成的影响
前 言
FGF/FGFRs 信号通路在骨骼发育过程中发挥着重要调控作用[4, 17, 31]。 但不同的 FGFRs 在 软 骨 形 成 和 骨 形 成 过 程 中 又 有 着 不 一 致 的 作 用 。 研 究 发 现 ， 人 类 FGFR1(P252R)功能增强点突变和多种 FGFR2 功能增强点突变可影响颅缝膜内成骨过 程，导致颅缝早闭综合征(craniosynostosis syndromes)[4]；而 FGFR3 功能增强点突变 主要通过抑制生长板软骨发育，导致软骨发育不全综合征[10, 32]。目前认为，FGFR1 和 FGFR2 主要调节膜内成骨过程，而 FGFR3 则主要参与调控软骨内成骨[4,9,10]。 近年来有研究表明， FGFR3 在成骨细胞有表达并参与调控成骨细胞功能 [20-21, 33]。目前已有多名学者报道利用条件性基因敲除小鼠研究 FGFR1、2 对成骨细胞的直 接调控作用[34-35]，但关于 FGFR3 对成骨细胞及骨形成的直接调控作用目前还不清 楚。 本实验以成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变(FGFR3K644E,Oc-cre)小鼠 作为研究对象，观察 FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠成年期骨骼情况，并结合体外细胞培养 实验了解成骨细胞的相关功能改变，明确 FGFR3 对成骨细胞及骨形成的直接调控作 用。
材料与方法
一. 主要仪器和试剂 （一） 主要仪器 仪器名称 小动物 X 光机 Micro-CT PCR 仪 Power PAC 300 电泳仪 Gel Doc 2000 凝胶成像仪 供应商 美国 FAXITRON 公司 比利时 SkyScan 公司 美国 Bio-Rad 公司 美国 Bio-Rad 公司 美国 Bio-Rad 公司
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MX3000P 定量 PCR 仪 5415R 低温高速离心机 BL-22OH 电子天平 Milli-Q Biocel 纯水仪 二氧化碳恒温培养箱 CKX41 解剖显微镜 SZX9 倒置相差显微镜 紫外分光光度计 UV-1601 分光光度计 RM2135 切片机 RM2600 切片机 HI 1210 展片台 BX51 荧光显微镜 Spot 内置彩色数码相机 -80℃低温冰箱 (二)主要试剂 试剂名称 甲基丙烯酸甲酯 邻苯二甲酸二丁酯 过氧化苯甲酰 乙醚乙二醇乙酸酯 TRAP 染色试剂盒 ALP 染色试剂盒 α-MEM 培养基 优质胎牛血清 0.25%胰蛋白酶 PBS 青霉素-链霉素 β-磷酸甘油 地塞米松 抗坏血酸
美国 Stratgenes 公司 德国 Eppendorf 公司 日本 Shimadzu 公司 美国 Millipore 公司 美国 Nuaire 公司 日本 Olympus 公司 日本 Olympus 公司 德国 Eppendorf 公司 日本 Shimadzu 公司 德国 Leica 公司 德国 Leica 公司 德国 Leica 公司 日本 Olympus 公司 美国 Diagnostic Instruments 公司 日本 SANYO 公司
供应商 上海国药集团化学试剂有限公司 上海国药集团化学试剂有限公司 上海国药集团化学试剂有限公司 上海国药集团化学试剂有限公司 美国 Sigma 公司 美国 Sigma 公司 美国 Gibco 公司 美国 HyClone 公司 美国 HyClone 公司 美国 Gibco 公司 美国 Gibco 公司 美国 Sigma 公司 美国 Sigma 公司 美国 Sigma 公司
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Trizol RNA 反转录试剂盒 EDTA 粉剂 多聚甲醛 钙绿素 SYBR? Premix Ex TaqTM Kit TaKaRa PCR Amplification Kit 10%SDS 蛋白酶 K Tris-EDTA (pH 8.0) 蛋白酶抑制剂 二. 实验动物的繁殖与鉴定
美国 Invitrogen 公司 日本 Takara 公司 上海生物工程有限公司 上海生物工程有限公司 美国 Sigma 公司 日本 Takara 公司 日本 Takara 公司 上海生物工程有限公司 美国 Roche 公司 上海生物工程有限公司 美国 Roche 公司
(一)成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能增强点突变(FGFR3K644E,Oc-cre)小鼠的获得 带 neo(neomycin-resistance gene)基因的 FGFR3 功能增强点突变小鼠(+/K644Eneo) 由美国 NIH 引入。Neo 基因可以抑制 FGFR3 正常表达，且 neo 两端各安置有一个同 向的 loxP DNA 片段；成骨细胞中特异表达 Cre 重组酶的转基因小鼠(OC-Cre 小鼠)由 军事医学科学院杨晓教授惠赠。 将上述+/K644Eneo 小鼠与 OC-Cre 小鼠交配，基于 Cre/LoxP 系统原理，Cre/loxP 重组后剔除位于两个 loxP 位点之间的 neo 基因,得到成骨细胞特异性表达 FGFR3 功能 增强点突变子代小鼠(FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠)作为研究对象(图 1)，同时取同窝生野 生型小鼠(WT 小鼠)作为对照。
图 1 用 Cre/LoxP 技术得到 K644ExOc-cre 小鼠的原理
(二)小鼠基因型鉴定 1. 提取小鼠基因组 DNA
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(1)剪取小鼠脚趾组织提取基因组 DNA，同时采用脚趾编号法对小鼠进行编号； (2)剪取鼠趾末端 2 mm， 放入 Eppendorf 离心管， 每管加入 200μl 组织裂解液 56oC 过夜； (3)每管加入 100μl 6 mol/L NaCl ，剧烈振荡 200 次以上；
(4)冰浴 10-30min，14000rpm 离心 15min； (5)吸取上清液 150μl 转移至干净 Eppendorf 离心管， 每管加入 250μl 无水乙醇颠 倒混匀； (6)14000rpm 离心 10min，可见管底附着的少量白色 DNA 沉淀； (7)倒去上清，将离心管倒置于纸巾上，室温干燥 30min； (8)每管加入 40 μl TE，56oC 孵育 2h； (9)储藏 DNA，4℃。 2. PCR 鉴定基因型 所用引物序列如下 OC-F:5'-ATG TCT AGG CAT GCA TAG GGT-3' OC-R:5'-GCA TCG ACC GGT AAT GCA GGC-3' R3-31: 5'-GCTCCCTGTCCTGCCTCGTG-3' RINA: 5'-CCA GAC TGC CTT GGG AAA AGC-3' OC-F/OC-R 用于鉴定成骨细胞特异表达 Cre 重组酶的转基因小鼠。其上游引物位 于 骨 钙 素 启 动 子 上 , 下 游 引 物 位 于 Cre 重 组 酶 基 因 上 ， 条 带 大 小 约 为 400bp ； R3-31/RINA 则用于鉴定 FGFR3 基因 10 号和 11 号外显子之间的 LoxP 序列(如图 1)， 得到的条带大小约为 180bp。按 PCR 标准反应程序进行，将 PCR 产物于 1%琼脂糖凝 胶电泳。FGFR3K644E,Oc-cre 小鼠得到大小为 400bp 和 180bp 的两条带。 三. 实验动物的标本取材 将 2 月龄小鼠断颈处死，分别在处死前 10 天和 3 天腹腔注射钙绿素(25mg/kg)。 处死前摘眼球取血，分离血清做生化检测。取右侧胫骨，40%乙醇固定准备树脂包埋， 左侧胫骨 4%多聚甲醛固定准备脱钙石蜡包埋。右侧股骨 70%乙醇固定后进行 X 线摄 片、双能骨密度测定，右侧股骨 70%乙醇固定后用于 Micro-CT 扫描，在取材的同时， 对小鼠体重、尾长和股骨长度等形态学指标进行测量(n=5～7)。 四. 小鼠 X 线检测 采用 Giotto FFDM 软射线钼靶系统对 2 月龄小鼠骨骼进行初步评价(曝光条件： 32KV，6 msce)。并采用美国 FAXITRON 公司的小动物 X 光机对小鼠股骨进行 X 线
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性质，以及钼靶对致密型乳腺，由于脂肪成分较厚，对腺体结构显示较差，造成钼靶诊断率降低，而超声对它具有较高的分辨率，能明显提高PCM 的诊断准确率。MRI 由于软组织分辨率高，对乳腺内部结构分辨率高，脂液性物质是PCM 特征性表现[6]，脂液性物质在T1WI 呈高信号，在T2WI 呈高信号，在STIR 脂肪抑制像上呈低信号，较具特征性。而MRI 不足之处是对钙化显示不佳。因此，在临床上，对PCM 钼靶征象不典型或鉴别困难时，利用超声及MRI 联合诊断，能明显提高诊断准确率，对诊断特别困难的病例，应行针吸细胞学检查。 3.4治疗目前手术切除病灶是唯一有效的治疗方 法，而手术的选择应根据钼靶的表现，有时超声、MRI 及CT 也是一种补充，尤其是MRI 及MSCT [7]对分期有很大的帮助PCM 若能完全切除，基本不会复发[参考文献] [1] 罗志琴.浆细胞性乳腺炎钼靶X 线诊断(附15例分析)[J].放射学实践,2006,21(4):356-357. [2]周毅,马丽华,黄其敏.浆细胞性乳腺炎的X 线诊断分 析[J].中国医学影像技术,2000,16(3):216-217.[3]闫少宁,平学军.浆细胞性乳腺炎的钼靶X 线表现[J].宁夏医学杂志,2007,29(8):706-707. [4]唐文,何山,郑轲,等.浆细胞性乳腺炎的临床研究[J].中华实用诊断与治疗杂志,2008,22(11):810-811. [5]张梅,杨斌,李萍.高频超声联合钼靶X 线诊断浆细胞性乳腺炎[J].医学研究生报,2011,24(4):390-394. [6]谭文莉,陆孟莹,黄学菁,等.MRI 在浆细胞性乳腺炎分期中价值[J].临床放射学杂志,2011,30(4):492-495.[7]马海峰,王嵩,王夕富,等.浆细胞性乳腺炎MSCT 细化分型在临床治疗计划中的应用[J].上海医学影像,2009, 18(4):280-282.[收稿日期]2011-09-26 *[作者简介] 黄海静，女，汉族，生于1982年4月，江苏省南通市人，检验师，研究方向：临床检验学。 南通大学学报（医学版） Journal of Nantong University (Medical Sciences)2012∶32（1） C-Met 蛋白是一分子质量为190ku 的异二聚 体，由细胞外50ku 的α亚基和跨膜的145ku β亚 基通过二硫键连接而成。C-Met 受体包括3个功能不同的结构域，即胞外区、跨膜区和胞内区。α亚基 肝癌中肝细胞生长因子受体的表达及意义 黄海静1*，吴月平2，蔡卫华2 (江苏省南通市第三人民医院1检验科，2肝胆外科，南通226006) [摘要]目的：研究肝细胞生长因子受体(c-Met)在肝癌患者组织及血浆中的表达，探讨c-Met 在肝癌发生、发展 所起的作用。方法：对肝癌及慢性肝炎患者进行调查，并且设立正常对照组，应用酶联免疫吸附法检测各组血浆c-Met 水平；应用半定量RT-PCR 法和免疫组织化学法分别检测各组肝组织中的c-Met mRNA 及c-Met 蛋白的表达。结果：肝癌患者血浆中的c-Met 水平明显高于慢性肝炎患者和正常人群(均P <0.05)。肝癌组织中的c-Met 水平明显高于慢性肝炎组织和正常肝组织(均P <0.05)。结论：c-Met 在肝癌组织及血浆中呈高表达，可能与肝癌的发生、发展有关。 [关键词]肝癌；肝细胞生长因子受体；酶联免疫吸附法；逆转录多聚酶链式反应；免疫组织化学[中图分类号]R735.7[文献标志码]A [文章编号]1674-7887（2012）01-0035-03 The study for the expression of hepatocyte growth factor receptor in the serum and tissues in patients with hepatic carcinoma HUANG Haijing 1*，WU Yueping 1，CAI Weihua 2 (1Department of Clinical Laboratory ，2Department of Hepatobiliary Surgery ，the Third Hospital of Nantong ，Nantong 226006) [Abstract]Objective :To study the expression of hepatocyte growth factor receptor(c-Met)in the serum and tissues in pa -tients with hepatic carcinoma ，explore the role of c-Met in the tumorigenesis and progression of human hepatic carcinoma.Methods :Study the patients with hepatic carcinoma or hepatitis ，and establish normal control group ，measure the plasma c-Met concentrations in them by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The expression of c-Met mRNA and protein were detected in liver tissue of them by using semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)and immunohistochemistry respectively.Results :The plasma c-Met concentrations in patients with hepatic carcinoma was high -er than those in hepatitis and normal control group(P <0.05).The expression level of c-Met in hepatic carcinoma was higher than those in hepatitis and normal hepatic tissue(P <0.05).Conclusion :The expression of c-Met in the serum and tissues in pationts with hepatic carcinoma was high ，c-Met may be involved in the tumorigenesis and progression of hepatic carcinoma.[Key words] hepatic carcinoma ；hepatocyte growth factor receptor ；enzyme-linked immunosorbent assay ；reverse transcrip -tion-polymerase chain reaction ；immunohistochemistry 35··
?综述? 表皮生长因子受体及其临床应用 叶榕 【关键词】表皮生长因子受体；肿瘤；临床应用 【中图分类号】R730.5【文献标识码】A【文章编号】1004-5511（2008）03-0164-03 自Cohen在1962年发现表皮生长因子受体(epi-dermal growth factor receptor,EGFR)以来[1]，经过近半个世纪的研究，研究者对EGFR的结构和功能有了比较全面的了解。特别是近年来，开发了针对EGFR 的靶向抑制剂，并且在肿瘤内科治疗中取得较好的疗效，使其成为研究热点之一。 1EGFR的分子生物学特性 1.1EGFR的结构与分布EGFR是具有配体介导的酪氨酸激酶活性的多功能跨膜糖蛋白，是定位于人第7号染色体短臂的原癌基因C-erbB-1的表达产物，分子量为170ku。EGFR分子分为三个区域：由619个氨基酸残基构成的伸向膜外识别并结合配体的氨基端区域，位于细胞膜中间含25个疏水氨基酸的跨膜区，以及膜内含542个氨基酸残基、具有酪氨酸激酶活性并能结合NTP的羧基端区域[2]。 除造血系统外，EGFR几乎存在于人体的所有组织中。在大鼠颌下腺主要定位在颗粒曲管上皮细胞内。在前列腺主要分布于腺体腔缘侧的细胞膜上，可见阳性的棕色颗粒，分布具有一定极性。在胃肠道组织如胃壁细胞、十二指肠粘膜上皮细胞和小肠上皮细胞上均有EGFR；在肠粘膜主要分布在刷状缘及基底膜，前者引起物质转运，后者导致细胞生长发育[3]。 1.2EGFR的活化与信号转导机制表皮生长因子（EGF）与靶细胞膜上EGFR结合后发挥生物学效应。两者的结合具有高亲和力，具有时间与温度的依赖性、饱和性和可逆性。研究显示，EGFR与核内染色体相连，可通过直接诱导特殊核蛋白的磷酸化而发挥其生理功能。EGF首先与EGFR的胞外部位结合，导致受体分子发生二聚化，促使EGFR羧基末端的三个酪氨酸残基（Tyr）自身磷酸化位点发生磷酸化，使受体酪氨酸激酶活化，从而磷酸化受体本身及下游的信号分子；磷酸化的受体通过其磷酸化酪氨酸残基可与蛋白质的SH2结构域相互作用，结合胞内信号转导分子。已知EGFR的活化可以使细胞内三磷酸肌醇和二酰基甘油增多，结果引起细胞内游离钙离子增多，激活磷酸蛋白激酶C和磷酸蛋白激酶A，从而介导各种信号转导途径，使细胞增殖和功能发生改变。诱导EGFR自身磷酸化的位点是在其羧基端1068、148、1173和氨基端一个位点的4个Tyr 残基；在体实验主要在1173Tyr残基，其他3个Tyr 残基磷酸化程度较离体少[4]。 1.3EGFR阻断剂①马鞭草醇提液（EV）可能抑制EGFR的表达；②EGF和EGFR之间存在着反向调节；③EGFR配体拮抗的单克隆抗体或EGFR选择性酪氨酸激酶抑制物可对EGFR产生阻断作用[5]。 2EGFR与肿瘤生成的关系 研究显示，在非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌及头颈部恶性肿瘤中都有EGFR的过度表达[6]。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡[7]。 2.1EGFR与肺癌的关系肺癌是目前世界上最常见的实体瘤和最普通的癌症死亡原因[8],80%肺癌的组织类型是非小细胞肺癌（NSCLC），在NSCLC患者中有80%~90%的人表达EGFR，过表达为45%~70%。研究发现，肺癌细胞以自分泌方式分泌转化生长因子a及内皮生长因子，两者与EGFR以配体方式相结合，并且EGFR的表达与肺癌患者预后、不良的肿瘤分化及肺癌细胞远处转移密切相关[9]。 2.2EGFR与乳腺癌的关系EGFR对乳腺癌的诊断和预后价值已得到肯定。Jiang等[10]应用雌激素、他莫西芬、表皮生长因子对乳腺癌MCF-7细胞进行体内、体外实验分析，认为EGFR的表达和患者 作者单位：350101福建福州，福建卫生职业技术学院医学基础部
?临床研究?肝细胞生长因子及其受体c2met在 肝细胞癌中的表达与预后价值 吴福生 郑树森 吴灵娇 丁伟 马志敏 王照明 滕理送 赵文和 【摘要】 目的 研究肝癌切除前、后血清肝细胞生长因子(HGF)的动态变化及其受体c2met在 癌组织中的表达,探讨HGF/c2met对手术切除后肝癌患者的预后价值。方法 收集手术切除的25例 肝细胞癌患者血清及组织标本,用酶联免疫法(E L I S A)测定术前1d、术后第3、7、10天血清HGF浓 度,分别用免疫组织化学及逆转录聚合酶链反应(RT2PCR)方法检测肝癌及癌旁组织中c2met蛋白及 mRNA的表达。分析术前血清HGF水平及癌组织中c2met表达程度与不同临床病理因素之间的关系 及影响手术后血清HGF水平变化的因素。以20例健康献血员为正常对照组,22例慢性乙型肝炎患 者及22例乙型肝炎肝硬化肝功能失代偿(Child B或C级)患者作为慢性乙肝组和肝硬化失代偿组。 结果 肝癌患者血清HGF浓度高于正常对照组及慢性乙肝组[(1103±0109)ng/m l比(0169± 0102)、(0174±0109)ng/m l,P<0105],但与肝硬化失代偿组[(1104±0111)ng/m l]比较差异无统计 学意义。术后HGF浓度上升高峰出现在术后第3天,术后第7、10天逐渐下降,但仍高于正常水平。 术前、术后各组的血清HGF组间比较,仅术后第3天组差异有统计学意义。影响术前血清HGF水平的 主要因素有:肿瘤直径>5c m、伴有结节肝硬化、门静脉癌栓、术前血清甲胎蛋白(AFP)≥400μg/L。 从术前到术后第3天,大区段切除比小区段切除者的血清HGF浓度上升更明显(P=01047)。中度和 强阳性c2met蛋白表达在肝癌组织中(21/25)明显高于癌旁组织(5/25)。高表达的c2met mRNA见 于所有肝癌组织中,在癌旁组织中仅6例有高表达。癌组织中c2met蛋白表达的强度与有无合并门 静脉癌栓有关,与肿瘤大小、血清AFP水平、血清HGF水平、有无肝硬化及肝癌的分化程度无相关 性。但在癌旁组织,合并肝硬化组c2met蛋白表达高于无肝硬化组。术后有肿瘤复发或转移的病例, 其术前血清HGF水平及肿瘤组织中c2met蛋白表达显著高于无复发或转移的病例。HGF水平与肿 瘤组织中c2met表达无相关性。结论 肝癌患者有血清HGF及癌组织中c2met的高表达,术后血清 HGF的持续升高可能与肝癌的早期复发和转移有关。 【关键词】 癌,肝细胞; 肝细胞生长因子; 原癌基因蛋白质c2met; 肝切除术 Study on the prognosti c va lue of hepa tocyte growth factor and c2m et for pa ti en ts w ith hepa tocellul ar carc i n o ma WU Fu2sheng3,ZHEN G Shu2sen,WU L ing2jiao,D I N G W ei,MA Zhi2m in,WAN G Zhao2m ing, TEN G L i2song,ZHAO W en2he.3D epart m ent of Surgical O ncology,First A ffiliated Hospital,Zhejiang U niversity School of M edicine,Hangzhou310003,China Corresponding author:WU L ing2jiao,Em ail:1020w lj@1631co m 【Abstract】 O bjecti ve To analyze the p r ognostic value of hepat ocyte gr owth fact or(HGF)and c2met for patients with hepat ocellular carcinoma(HCC)after hepatect omy1M ethods T wenty2five patients undergoing partial hepatect omy for HCC were studied1Seru m HGF level was deter m ined using E L I S A kit bef ore and after operati on res pectively1c2met p r otein and mRNA exp ressi on in cancer ous and paracancer ous tissues were detected by i m munohist oche m ical and RT2PCR methods res pectively1The correlati ons of clinical2pathol ogic para meters with the HGF level in seru m and c2met exp ressi on in cancer ous tissue were analyzed res pectively1Results HCC patients had a significantly higher concentrati on of seru m HGF than nor mal contr ols and chr onic hepatitis B res pectively[(1103±0109)ng/m l vs(0169±0102)ng/m l and (0174±0109)ng/m l]1No significant difference in seru m HGF was observed bet w een HCC and cirrhosis 基金项目:浙江省科技攻关计划项目(2004C30074) 作者单位:310003杭州,浙江大学医学院附属第一医院肿瘤外科(吴福生、马志敏、滕理送、赵文和),肝胆胰外 科暨器官移植中心(郑树森),传染病研究所(吴灵娇),病理科(丁伟、王照明) 通讯作者:吴灵娇,Email:1020wlj@https://www.doczj.com/doc/4317240471.html,
成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制 的研究进展1 姜媛媛，任桂萍，王文飞，郝建权，李德山 东北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨（150030） E-mail：deshanli@https://www.doczj.com/doc/4317240471.html, 摘要：成纤维细胞生长因子(FGF)是一类多肽类物质，其中大多数成员可与肝素结合发挥作用。目前已知FGF至少包括23个因子，即FGF1～23。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，可以分泌到细胞外。FGF家族成员是一类生理功能较广泛的生长因子，功能包括促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等。本文根据最近的研究成果对 FGF因子及其受体研究进展做一综述，并主要对FGF因子特征及其研究趋势进行了探讨。 关键词：FGF，FGF受体，肝素 中图分类号:Q74 引言： 成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的，该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质，可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。从70年代中期到目前已进行了大量广泛的研究，目前已知FGF至少包括23个因子，它们在一级氨基酸序列上有一定的同源性，并有类似的生物学功能，且广泛存在于体内多种组织中。FGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有十分明显的促细胞分裂增殖作用，并且在机体内的胚胎发育、细胞生长分化、创伤组织愈合及肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。 1. 成纤维细胞生长因子（FGF）家族 成纤维生长因子（Fibroblast growth factor, FGF）又被称为肝素亲和生长因子(Heparin binding growth factor, HBGF)，是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。现已知FGF家族至少包括23个成员，即FGF1～FGF23。FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%～50%，其每个成员都有140个氨基酸的中轴，该中轴在不同的成员中有高度的同源性。结构分析表明，此中轴折叠成12条逆向平行的β链，它们又进一步形成圆柱状的结构。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列，使得它们可通过内质网一高尔基复合体的经典(即自分泌和旁分泌)途径被分泌到细胞外，但其中也有部分FGF则因本身缺乏信号肽结构，不能向外分泌，只能在细胞受损时释放[1]。多数FGF（如FGF3～8、10、15、17～19、21～23）的N末端具有典型的信号肽序列。而FGF16和FGF20虽然没有明确的信号肽序列却也能高效地分泌到细胞外[12]。FGF1 和FGF2也缺乏信号肽序列和正常的分泌途径，却也能出现在胞外基质，推测两者可能来自受伤的细胞，或者通过与内质网-高尔基体通路不同的细胞脱颗粒机制释放至胞外的。此外，FGF 11～14没有典型的信号肽序列，因此认为这些FGF是在胞内发挥作用[13]。由于FGF家族成员之间的氨基酸序列有25％～50％的同源性，分子结构有一定的共性，故FGF不同分子之间的生物学效应既有相似性，又有各自的特点[1-3]。 FGF1(aFGF)和FGF2(bFGF)是最先被发现，也是迄今为止研究最充分的两个成员，因其1本课题得到黑龙江省科技厅重点攻关项目（编号：2006G0461-00）的资助。
表皮生长因子受体（EGFR）文章来源：易瑞沙更新时间：2010-05-12 字体：[ 大] [ 小] [ 打印] 表皮生长因子受体概述 表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)是原癌基因C-erbB-1 (HER-1)的表达产物，EGFR 家族包括EGFR、C-erbB-2(HER-2)、C-erbB-3、C-erbB-4四个成员，均定位于细胞膜上。erbB-1广泛分布于除血管组织外的上皮细胞膜上；erbB-2在正常人体腔上皮、腺上皮及胚胎中均有普遍的微弱表达；erbB-3在除造血系统外的多数部位有表达；erbB-4在除肾小球及周围神经外的所有成年组织均可检测到其表达。 EGFR（epithelial growth factor receptor，表皮生长因子受体）本身具有酷氨酶激酶活性，一旦与表皮生长因子（EGF）组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和头颈部鳞癌的EGFR表达增高。 EGFR可分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分，其特点如下：胞外区由氨基端的621个氨基酸构成，是配体结合区，对EGFR具有高度亲和力，对热量很稳定。跨膜区由23个氨基酸残基构成螺旋状结构的疏水区，将受体固定于胞膜上。胞内区的542个氨基酸构成3个亚区： 1.近膜亚区（约50个氨基酸）主要作为PKC和erk/MAPK(extracellular signal-regulated kinase/mitogen activated protein kinase)作用的负反馈区域； 2.随后的约250个氨基酸构成酪氨酸激酶亚区，包含SH1和src同源物1的结合位点； 3.羧基端尾部的229个氨基酸构成羧基端亚区。 迄今发现，EGFR共有6种配体：表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、转化生长因子A(TGFA)、amphireguin、betacelluin(BTC)、heparin-binding EGF (HBEGF)和epiregulin(EPR)。EGFR与其配体的结合具有高亲和性、可饱和性和特异性。 表皮生长因子受体（EGFR）的功能 研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏;异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。 EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活；细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，
第六章表皮生长因子受体抑制剂常见不良反应及其处理 表皮生长因子及其受体信号通路在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展中发挥了重要作用，它调控肿瘤细胞增殖、生存和凋亡、血管生成、肿瘤转移等多个生物学过程，是NSCLC治疗的重要靶点之一。针对表皮生长因子受体（EGFR）的靶向药物包括小分子抑制剂（如吉非替尼和厄洛替尼）和单克隆抗体（如西妥昔单抗等）。小分子药物已作为晚期NSCLC的二、三线治疗方案广泛用于临床，EGFR单抗联合化疗一线治疗晚期NSCLC同样也取得了较好的疗效。 EGFR抑制剂（EGFR TKIs）无论是小分子药物还是单克隆抗体，均具有良好的安全性和耐受性，常见不良反应有皮肤毒性和腹泻，罕见不良反应有间质性肺炎、肝功能异常、口腔炎、脱发、口腔干燥等，无威胁患者生命的血液学毒性。与化疗毒副反应的处理措施不同，应用此类药物出现不良反应并非停药的指征，反而是肿瘤对靶向药物敏感的临床信号。许多研究发现皮疹与EGFR TKIs治疗的疗效相关，中重度皮疹患者总体生存明显优于轻度或无皮疹的患者。因此，正确处理EGFR TKIs 引起的不良反应具有十分重要的临床意义。 第一节皮肤毒性 皮肤毒性是最常报道的不良反应，发生率在2/3左右，常见反应包括痤疮样皮疹、甲沟炎及甲裂、毛发改变、皮肤干燥、超敏反应、粘膜炎等（表1）。EGFR TKIs的皮肤毒性/皮疹不属于过敏反应，而是皮肤EGFR受到抑制的结果。正常上皮和滤泡角细胞存在EGFR表达，EGFR在上皮细胞增殖分化等方面发挥重要作用，它可以剌激表皮细胞生长，抑制其分化，保护细胞抵抗紫外线相关损伤，抑制炎症并加速创面愈合。有证据提示EGFR表达或活性改变可伴有上皮异常增生和分化；皮肤毒性的机制还包括上皮角化过度和滤泡阻塞或炎症性反应。 表1 EGFR TKIs相关性皮肤毒性反应 EGFR TKIs引起的皮疹通常为痤疮样皮疹，呈丘疹脓疱样改变。皮疹的发生率随研究和药物而异，在BR.21研究中，皮疹发生率为79%，多为轻中度，3级和4级皮疹发生率分别为8%和1%。单抗皮疹发生率相对较高，在FLEX研究中，接受西妥昔单抗治疗的患者痤疮样重度皮疹的发生率
第三军医大学 硕士学位论文 成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)对骨形成的直接调控作用 姓名：周锐 申请学位级别：硕士 专业：遗传学 指导教师：陈林 2011-05
第三军医大学硕士学位论文
成纤维细胞生长因子受体 3(FGFR3)对骨形成的 直接调控作用*
摘 要
成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)属于受体酪氨 酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族。目前已发现 4 种 FGFRs，即 FGFR1、 FGFR2、FGFR3、FGFR4。它们之间在氨基酸水平有 55%~72%的一致性。 既往研究表明，FGF/FGFRs 信号通路与骨骼发育、再生和骨骼疾病有密切联系。 FGFR1、2、3 功能增强或丧失突变可导致包括颅缝早闭(craniosynostosis, CS)、软骨发 育不全 (achondroplasia, ACH) 和 CATSHL (camptodactyly, tall stature, scoliosis, and hearing loss)综合征在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病。 骨骼的发育是通过软骨内成骨(endochondral ossification) 和膜内成骨(intramembranous ossification)两种方式来完成的。软骨内成骨又经过软骨形成(chondrogenesis)和骨形成 (osteogensis)两个密切相关的过程。而膜内成骨则是一个单独的骨形成的过程，即间充 质密集后直接分化为成骨细胞并成骨。 不同的 FGFRs 在软骨形成和骨形成过程中的作用不一致。总的讲，目前认为 FGFR1、2 主要调节膜内成骨过程，而 FGFR3 则主要参与调控软骨内成骨。已发现人 类 FGFR1(P252R)功能增强点突变和多种 FGFR2 功能增强点突变可影响颅缝膜内成骨 过程，导致颅缝提前闭合，引起囟门早闭综合征；而 FGFR3 功能增强点突变通过抑制 生长板软骨发育，导致软骨发育不全等软骨发育障碍性疾病。 FGFR3 和 FGFR1、2 高度同源，也受可调节骨形成的内源性配体 FGF2、18 等激 活，提示 FGFR3 可能参与调控骨形成过程。而人类 FGFR3 A391E 功能增强型点突变 可引起 Crouzon 等囟门早闭征，则是 FGFR3 影响骨形成的直接证据。模拟人 ACH 的 FGFR3 突变小鼠出生后 15 天长骨骨小梁处成骨细胞分化标志基因 Cbfa1 等表达水平 增高，成年期骨量减少；FGFR3 敲除小鼠骨量减少，骨小梁矿化障碍。这些结果均提 示 FGFR3 可影响成骨细胞功能和骨形成过程。 目前已有多名学者报道利用条件性基因敲除小鼠研究 FGFR1、2 对成骨细胞的直 接调控作用，但关于 FGFR3 对成骨细胞及骨形成的直接调控作用及机制还不完全清
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本课题受国家重点基础研究发展规划 (973 计划)项目子课题 (2005CB522604)、 国家自然科学基金杰出青年基金
(30425023)、国家自然科学基金重点项目(30530410)、国家自然科学基金青年科学基金项目(30301527)资助。 8
细胞生长因子(growth factor)：是由造血系统、免疫系统或炎症反应中的活化细胞产生，能调节细胞分化增殖和诱导细胞发挥功能，是高活性多功能的多肽、蛋白质或糖蛋白。 （一）细胞生长因子的种类 细胞生长因子有多种，如表皮生长因子(EGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血小板来源生长因子(PDGF)、促红细胞生长素(EPO)、集落刺激因子(CSF)等。常见类型如表1所示
①在表皮水平上； 影响角化细胞的活性和生长因素,刺激角化细胞迁移和上皮化,刺激表皮细胞分化和矫正,强烈促进表皮修复和愈合，如EGF、KGF。 ②在真皮水平上； 刺激成纤维细胞活性,增强细胞外基质收缩和构造,提供皮肤 养分，促进皮肤伤口愈合和功能再生，如BFGF、AFGF。 ③在皮肤整体水平； 增强对环境侵袭、紫外线、污染物、刺激物、敏化剂、炎性细胞的抵抗力,巩固、增强皮肤张力,增强皮肤弹性,刺激瘢痕组织褪色,减少瘢痕形成,延缓皮肤衰老。 （二）细胞生长因子分泌特点 在分泌特点上，细胞生长因子主要属于自分泌（autocrine）和旁分泌（paracrine）。各类生长因子都有其相应的受体，是普遍存在于细胞膜上的跨膜蛋白，不少受体具有激酶活性，特别是酪氨酸激酶活性(如PDGF受体、 EGF受体等)
（三）不同细胞生长因子在美容方面的应用 1、表皮生长因子（epidermalgrowth factor，EGF）
（1）概念：EGF是一种由53个氨基酸构成的活性多肽，它的主要生理活性是诱导细胞(尤其是表皮基底层细胞) 增殖、分裂分化,促进其生长。EGF 通过与细胞膜上受体的结合，激活受体，加速皮肤新生细胞替代衰老细胞的进程，使皮肤细胞年轻化。 （2）作用位点：表皮层 （3）EGF在美容方面的功能： a、护肤、修复 EGF 在体内能促进机体表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞的生长、分裂和新陈代谢，促进微血管的生长,改善细胞生长的
白介素IL-17细胞因子及其受体家族研究进展 白介素-17(IL-17)主要由T辅助细胞TH17产生。IL-17可以直接或间接诱导多种细胞因子、趋化因子、炎症因子与抗微生物蛋白来识别介导自身免疫与慢性感染的靶基因,最近的研究已经证明,IL-17与肿瘤的发生密切相关。 白介素-17(IL-17)已经发现的成员有6个,分别就是:IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(也被称为IL-25)与IL-17F。随着研究的深入,IL-17产生细胞除了TH17细胞外,还有很多其它类型的细胞可以产生,比如:巨噬细胞、树突状细胞、CD-T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、CD8+ T细胞、调节性T细胞(Tregs)、嗜中性粒细胞、肥大细胞、骨髓源性抑制细胞(MDSCs)与淋巴组织诱导物(LTi)细胞等,在上皮细胞、周细胞、平滑肌细胞与肿瘤细胞中也可产生白介素IL-17。在IL-17家族的6个成员中,IL-17A就是IL-17家族的原型,IL-17F与之同源性最高(50%),并且编码基因定位于染色体的同一区域6p12,其它与IL-17A同源性较差,只有16%-30%,且定位在不同的染色体上。但这些细胞因子在人、鼠种属间的保守性较高(62-80%)。IL-17家族成员以同源二聚体或异源二聚体的形式发挥功能。IL-17A、IL-17E、IL-17F就是重要的促炎症因子,而IL-17B、IL-17C、IL-17D的功能还尚待研究。 白介素IL-17受体(IL-17R)家族由5个成员组成:IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE。IL-17R由27个氨基酸的N-末端信号肽、293氨基酸胞外结构域、21个氨基酸的跨膜结构域与525个氨基酸异常长的胞质尾巴构成的单程跨膜蛋白。IL-17受体家族成员之间可以组合成不同的复合物,如IL-17RA与IL-17RC复合体介导细胞对IL-17A与IL-17F的反应,IL-17RA与IL-17RB复合体介导细胞对IL-17E的反应。IL-17RA作为这个家族迄今为止最大的分子,编码的基因位于染色体22上,就是至少4个配体传递信号的通用亚基。其她受体的编码基因位于染色体3上。L-17RA广泛表达,特别就是在造血组织中表达水平高。 IL-17RB能结合IL-17B与IL-17E,它主要表达于各种内分泌组织及肾、肝与TH2细胞。 IL-17RD负调控FGF介导的Ras-MAPK及PI3K信号通路。人的IL-17RD也能抑制FGF依赖的ERK激活与FGF依赖的增殖,但鼠的IL-17RD却能结合TAK1激活MAP2K4-JNK信号通路。IL-17受体家族中被了解最少的成员就是IL-17RE,近来研究表明IL-17C可能就是它的配体。
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 肝细胞生长因子是什么 导语：肝细胞可以再生是因为我们的身体里面拥有肝细胞生长因子，如果我们的肝细胞因子受到损伤或者是说肝细胞因子减少了，都会大大地影响我们的肝 肝细胞可以再生是因为我们的身体里面拥有肝细胞生长因子，如果我们的肝细胞因子受到损伤或者是说肝细胞因子减少了，都会大大地影响我们的肝细胞再生的。想要让自己的肝细胞可以再生就要保护好我们的肝细胞再生因子，但是，大家知不知道什么是肝细胞生长因子呢？ 1HGF及其受体的结构 肝细胞生长因子(HGF)[1]最早是1984年由日本的中村敏一教授从大鼠血浆中得到的，其结构实质是含728个氨基酸的肝素结合糖蛋白. 它来自间质细胞，以旁分泌方式作用于邻近细胞，并与细胞表面的受体结合并激活酪氨酸激酶活性，具有较强的促有丝分裂、组织成形、诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用[2]. HGF的受体是原癌基因cmet编码的一种跨膜蛋白，称为Met，是由Mr为190000的前体蛋白分裂而得来，由Mr为50000的a链和Mr为145000的3链经二硫键相连而成的杂二聚体. Prat等发现某些癌细胞的Mr为190000 Met 的前体，缺乏裂解过程，不需连接配体就已有活性，因此就失去了HGF的生长控制. 各种瘤细胞和cmet转化后的细胞都过度表达Met，对HGF的反应比正常细胞更敏感强烈. 2HGF及其受体的生物学作用 (1) 启动肝再生实验证明，在众多细胞因子中，HGF是肝再生的启动信号，并在肝细胞增殖过程中起重要作用. (2) 促进细胞分裂作用HGF 在原代肝细胞的无血清培养中可刺激肝细胞DNA合成，1 g/L HGF即可 预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
15 细胞因子及其受体 免疫受体是由一个由固有免疫系统和适应性免疫系统叠加而成的免疫系统，又是一个弥散系统，在体内往复循环的免疫细胞之间没有固定的有线”连接。这样的一个系统有效运转有赖于不同细胞之间的有序分工合作,信息交换与密切协调。细胞因子（cytokine）是免疫细胞之间以及免疫细胞与其他组织之间相互交换的语言。所谓细胞因子是指是有免疫细胞或非免疫细胞（如血管内皮细胞，表皮细胞和成纤维细胞等）经刺激而合成分泌的一类生物活性分子，他们之间的信息交换与相互调节，参与免疫应答和炎症反应过程。15-1细胞因子的主要特点（General Characteristics Of Cytokines）内分泌素也具有相对分子质量小，浓度低等特点，能够远距离调解组织器官的功能。细胞因子与与内分泌素不同，他们不由专门腺体分泌，而是来自多种不同的组织和细胞，以近距离调节为主。虽然已经发现200余种细胞因子，从人类基因组计划的测序结果来看，还有更多的细胞因子将被发现，他们具有如下一些基本特征： （1）半衰期短，不在细胞内储存而是在被活化
后开始合成并且分泌的。 （2）多效（重叠）性(pleiotropism)：多种细胞可以产生同一种细胞因子，一种细胞因 子可以对不同细胞发挥不同作用。 （3）丰裕性（redundant）：两种以上的的细胞因子具有相同的或者相似的生物学作用的 现象比较常见。 （4）协同性（synergy）：两种细胞因子同时作用于一个靶细胞的效应大于他们单独效应 之和，即为协同作用。 （5）拮抗性(antagonism):有是有两种细胞因子有相互抑制的作用，即为拮抗性。（6）网络性：细胞因子能够诱导或抑制其他细胞因子的合成，形成细胞因子功能和调节 网络。 （7）效应延迟:靶细胞对细胞因子的反应通常发生在几个小时内，需要新mRNA和蛋白质 分子的原位合成。 （8）效应范围：近距离作用为主。多数细胞因子在血液中是检测不到的，他们发挥作用 的方式以旁分泌（paracrine）和自分泌 （autocrine）为主，前者指其对临近细胞
肝细胞生长因子及其受体与ⅡA期宫颈癌临 床病理关系分析 作者：王智宇, 张雪玉，包生武, 哈春芳 【摘要】目的探讨ⅡA期宫颈癌患者血清肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF)水平及其受体c-Met表达与宫颈癌临床病理特征的关系。方法采用酶联免疫吸附法(ELLSA)及免疫组化法测定48例宫颈癌ⅡA期患者外周血HGF的含量及其组织c-Met受体的表达并分析HGF/c-Met与宫颈癌临床病理特征的关系。结果血清HGF水平与病理分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关(P<0.05);组织中c-Met表达阳性率72.9%，与病理分级、浸润深度有关( P<0.05);宫颈癌患者血清HGF水平与其组织中c-Met表达阳性率成正相关。结论 HGF/c-Met参与了宫颈癌的发生发展，其表达升高可能在宫颈癌的发生、侵袭及转移中起促进作用，HGF/c-Met的联合检测可望成为判断宫颈癌预后的指标。 【关键词】肝细胞生长因子受体ⅡA期宫颈癌临床病理HGF是一种具有刺激多种类型细胞的增殖、分化、形态发生和侵袭运动的多肽生长因子，其受体c-Met为原癌基因的表达产物。HGF/c-Met在多种组织中均有表达，HGF作用于受体c-Met,形成了HGF/c-Met信号转导系统。研究表明,HGF/c-Met在许多恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用[1]。本研究采用酶联免疫吸附法(ELLSA)及免疫组化法测定ⅡA期宫颈癌患者外周血HGF的含量及其组织中c-Met 受体表达情况，分析HGF及其受体与宫颈癌临床病理特征的关系，探
讨HGF/c-Met在宫颈癌侵袭转移中的作用。 1 材料与方法 1.1 临床资料选择宁夏医科大学附属医院妇科2007年4月-2008年2月收治的ⅡA期宫颈癌病例48例，均经手术病理证实。患者年龄26～68岁，平均47岁。48例均行广泛子宫切除加盆腔淋巴结清扫术，术前未接受任何辅助治疗。病理资料：鳞癌47例，腺癌1例;低分化32例，中高分化16例;癌灶<3cm 30例，≥3cm 18例;浸润深度<50%者25例，≥50%者23例[2];淋巴结有转移4例，无转移44例;宫旁有转移2例，宫旁无转移46例。 1.2 方法 1.2.1 标本采集空腹抽取静脉血5mL, 于 4 ℃3000 r·min-1 离心15 min ,取上清液1mL分装后置- 80℃深低温冰箱冻存备用，收集同一患者宫颈组织蜡块。 1.2.2 血清HGF水平的测定采用ELISA双抗体夹心法，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，编号EK0369。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。酶标仪以450nm波长读光密度值，绘制标准曲线，计算出各样本HGF浓度。 1.2.3 组织中c-Met受体的表达采用免疫组织化学染色法(EnVision两步法)，一抗为Rabbit Anti-Hepatocyte growth factor receptor(c-Met),购自武汉博士德公司，编号为BA0468。即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒(兔)及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物公司，编号为KIT-5004、DAB-0031。所有操作步骤严格按试剂盒
细胞因子制剂在临床上的应用 一，简介 中文名称：细胞因子英文名称：cytokine 定义1：一组由多种细胞所分泌的可溶性蛋白与多肽的总称。在nmol/L或pmol/L水平即显示生物作用，可广泛调控机体免疫应答和造血功能，并参与炎症损伤等病理过程。 所属学科：免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科） 定义2：由免疫系统细胞以及其他类型细胞主动分泌的一类小分子量的可溶性蛋白质。包括淋巴因子干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、趋势化因子和集落刺激因子等。是免疫系统细胞间，以及免疫统细胞与其他类型细胞间联络的核心，能改变分泌细胞自身或其他细胞的行为或性质，通过与细胞异的膜受体而起作用。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；激素与维生素（二级学科） 定义3：细胞释放的可影响其他细胞行为的蛋白质。常指在免疫反应中起细胞间介导物作用的分子。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞免疫（二级学科） 二．细胞因子的分类 （一）根据产生细胞因子的细胞种类不同分类 1.淋巴因子（lymphokine) 于命名，主要由淋巴细胞产生，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞等。重要的淋巴因子有IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、GM-CSF和神经白细胞素等。 2.单核因子（monokine）主要由单核细胞或巨噬细胞产生，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、G-CSF 和M-CSF等。 3.非淋巴细胞、非单核-巨噬细胞产生的细胞因子主要由骨髓和胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等细胞产生，如EPO、IL-7、IL-11、SCF、内皮细胞源性IL-8和IFN-β等。（二）根据细胞因子主要的功能不同分类 1.白细胞介素（interleukin, IL) 1979年开始命名。由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用，凡命名的白细胞介素的cDNA基因克隆和表达均已成功，目前已报道IL-1-IL-15。 2.集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF) 根据不同细胞因子刺激造血干细胞或分化不同阶段的造血细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为G（粒细胞）-CSF、M（巨噬细胞）-CSF、GM（粒细胞、巨噬细胞）-CSF、Multi（多重）-CSF（IL-3）、SCF、EPO等。不同CSF不仅可刺激不同发育阶段的造血干细胞和祖细胞增殖的分化，还可促进成熟细胞的功能。 3.干扰素（interferon, IFN) 1957年发现的细胞因子，最初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种物质可干扰另一种病毒的感染和复制，因此而得名。根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为IFN-α、INN-β和IFN-γ，他们分别由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生。各种不同的IFN生物学活性基本相同，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。 4.肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF) 最初发现这种物质能造成肿瘤组织坏死而得名。根据其产生来源和结构不同，可分为TNF-α和TNF-β两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化T细胞产生，又名淋巴毒素（lymphotoxin, LT)。两类TNF基本的生物学活性相似，除具有杀伤肿瘤细胞外，还有免疫调节、参与发热和炎症的发生。大剂量TNF-α可引起恶液质，因而TNF-α又称恶液质素（cachectin)。