固定化酶在现代工业中的应用姓名：胡艳芬学号：2008132106 指导教师：张孟
摘要酶是一类有催化功能的蛋白质,具有反应条件温和, 底物专一性强, 可在水溶液和中性pH 下操作等优点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处。本文简要介绍了固定化酶的概念、制备方法及其在生物、医药、环境保护等方面的广泛应用。重点介绍一些固定化酶在现代工业中的应用，并对其应用前景进行了展望。
关键词固定化酶制备工业应用前景
酶是一类由活细胞产生的具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质,具有极高的催化效率、高度的特异性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的。由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点,符合绿色化学的要求,从而被大家高度重视,已在许多领域得到广泛的应用[1]。酶的最大缺点是其不稳定性,在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性,活性降低或丧失;而且酶反应后,会在溶液中残留,造成酶反应难以连续化、自动化,同时也不利于终产品的分离提纯,这些都大大阻碍了酶工业的发展,所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多,其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能[2]。
已固定化的酶像化学反应所用的固体催化剂那样, 既能发挥它们的催化特性, 又能回收, 并能多次反复使用, 使整个生产工艺可以连续化、自动化。近年来, 国内外科技工作者在固定化酶在工业生产中的应用做了大量研究，并得到了广泛的发展，本文将对这些成就做具体介绍。
1 固定化酶的概念
1916 年Nelson 和Griffin最先发现了酶的固定化现象后, 科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969 年日本一家制药公司第1 次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸, 开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的,而经过固定化以后,酶被束缚在一定区域内,因而这样的酶被称为固定化酶[ 3, 4 ]。
与游离酶相比, 固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时, 又克服
了游离酶的不足, 呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。
2 固定化酶的制备
酶的固定化( enzyme immob ilization) 是指采用有机或无机固体材料作为载体( carrier or support),将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中, 使其仍具有催化活性, 并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
2.1 传统的酶固定化方法
传统的酶固定化方法大致可分为4 类: 吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。
吸附法是最早出现的酶固定化方法, 包括物理吸附和离子交换吸附。该法条件温和, 酶的构象变化较小或基本不变, 因此对酶的催化活性影响小, 但酶和载体之间结合力弱, 在
不适pH、高盐浓度、高温等条件下, 酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。交联法是利用双功能或多功能交联试剂, 在酶分子和交联试剂之间形成共价键, 采用不同的交联条件和
在交联体系中添加不同的材料, 可以产生物理性质各异的固定化酶。交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段[5]。包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后, 借助引发剂进行聚合
反应, 通过物理作用将酶限定在载体的网格中, 从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的构象及酶分子的化学变化, 反应条件温和, 因而酶活力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失, 常存在扩散限制等问题, 催化反应受传质阻力的影响, 不宜催化大分子底物的反应。载体偶联法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆
结合的酶固定方法, 又称共价结合法。载体偶联法所得的固定化酶与载体连接牢固, 有良好的稳定性及重复使用性,成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其它固定方法反应剧烈, 固定化酶活性损失更加严重。
2.2 传统固定化技术的改进
保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。改善酶固定化效果的途径有: 改善表面积以及孔径等物理结构,如采用分子筛或纳米纤维微孔膜; 改善化学交联的反应及方式, 如辐照, 引发剂引发等; 改善结合的方向选择性, 如采
用定向固定化的方法; 其他手段, 如利用长臂使酶远离载体表面, 使载体- 酶体系的溶解
度随温度、pH 值等条件的改变而改变, 以便于产物的分离及酶的回收。针对不同的酶有不
同的策略, 对于某些酶可能取向很重要, 而对于其他酶可能载体造成的环境重要一些, 因此, 每种酶固定的最佳条件目前还是特异的, 没有统一的理论, 其原因可能是相互间的影响因素太多, 而酶又多由具有复杂组成和空间构型的蛋白质构成, 不存在明显的因果联系。今后可望建立起适用的模型, 使用计算机得到最优的固定策略。
2.3 新型酶固定化方法
开发新型酶固定化方法的原则是: 实现在较为温和的条件下进行酶的固定化, 尽量减少或避免酶活力的损失。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶。Mohy 等[ 6]以137 Cs 为辐射源,通过C2射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面, 经进一步活化, 用于青霉素酰化酶的固定。光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶, 由于条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。Li等[ 7]利用含芳香叠氮基的光活性酯, 在远紫外光辐照下, 叠氮基光解生成氮烯与PES 膜表面的
C- H 键间发生插入反应形成仲胺, 将脲酶共价键合到PES 膜的表面。等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体, 大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表面可以由等离子体进行有用修饰[ 8, 9], 从而引入活性基团。Puleo 等将钛合金T i26Al24V 表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基, 然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面, 或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理, 再用含碳硝化甘油接枝, 进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定, 实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
3 固定化酶在现代工业中的应用
3.1 酶蛋白工程在工业酶中的应用
目前酶蛋白质工程主要集中在工业用酶的改造, 因为工业用酶有较好的酶学和晶体学研究基础, 酶的发酵技术(包括诱变技术和筛选方法)也比较成熟, 而且其微生物的遗传工程发展较好, 其次工业酶无须进行医学鉴定, 能很快地投入使用. 如用作洗衣粉添加酶的枯草杆菌蛋白酶, 是一种天然的丝氨酸蛋白酶, 它能够分解蛋白质, 使衣服上的血迹和汗渍等很容易洗掉. 但这种酶一般比较脆弱, 在漂白剂的作用下容易被破坏而失去活性, 原因是222位的甲硫氨酸容易被氧化成砜或亚砜. 现在利用蛋白质工程技术, 用丝氨酸或丙氨酸替代后, 酶的抗氧化能力大大提高, 可在0. 5mol/L 的过氧化氢溶液中停留1小时而活性丝毫未损, 这样便可与漂白剂混合使用. 可以预见生物工程技术的发展和酶固定化技术可以相互补充, 共同发展对酶在工业领域的应用必将起到更大的推动作用。
3.2 固定化酶在食品工业中的应用
酶固定化在食品工业中的应用是早期发展起来的一个传统领域. 其中最有名的, 也是规模最大的过程, 就是采用固定化葡萄糖异构酶, 从葡萄糖生产高果糖浆. 其它还包括采用固定化乳糖酶去除牛乳中的乳糖、采用固定化脂肪酶通过转酶反应生产可可油替代品、采
用固定化耐热蛋白酶制造甜味剂2天冬甜精, 以及应用固定化L2天冬酶从富马酸铵生产天冬氨酸等[ 7]。1973 年,日本用聚丙烯酸酰胺为载体,用包埋法制成固定化天冬氨酸酶,用于工业化生产。固定化乳糖酶和固定化天门冬氨酸-β- 脱羧酶分别于1977 年和1982 年用于工业化生产。
3.2.1 固定化酶在乳制品生产中的应用
牛奶中含有一定量的乳糖,有些人体内缺乏乳糖酶,在饮用牛奶后常出现腹泻、腹胀等症状;另外,由于乳糖难溶于水,常在炼乳、冰淇淋中呈沙样结晶析出,影响风味。乳糖酶可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,如将牛奶用乳糖酶处理则可解决上述问题。Fernandes等[ 6 ]研究用琼脂糖作载体,固定来源于南极的冷适应菌Pseudoalterom onas sp的β- 半乳糖苷酶,并应用
于牛奶中乳糖的降解,生产低乳糖牛奶;Caterina等[ 7 ]运用固定化技术,研究牛奶中碱性磷酸酶的耐热性;Mona等[ 8 ]研究用离子吸附法固定来源于B acillus licheniform is 5A1的牛奶凝结酶,并用于干酪生产。
3.2.2 固定化酶在啤酒生产中应用
在啤酒生产中,需添加外源性的淀粉酶来补充天然酶的不足。此外,长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得混浊,为防止出现混浊,目前主要采用添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽。温燕梅等以化学共沉淀法制得的磁性聚乙二醇胶体粒子为载体,固定胰蛋白酶,该磁性酶对啤酒澄清、防止冷浑浊有明显效果; Stepanova等研究用DEAE-纤维素固定β-葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶,用于樱桃、李子的果酒生产。
3.2.3 固定化酶在茶饮料生产中的应用
将固定化酶法应用于茶饮料生产中,可去除异味,提高适口性,提高营养价值。李平等[ 9 ]研究从黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液中提取β-葡萄糖苷酶酶液,用丝素蛋白将其固定,此固定化酶可应用于茶汁的风味改良; 苏二正[10 ]等以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋-交联
的方法共固定化了单宁酶和β-葡萄糖苷酶,可应用于茶饮料的除浑和增香处理。
3.3 固定化酶在化工领域中的应用。
水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合成,如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成Leu - 脑啡肽前体Boc - Phe -Leu - OMe 、产率高达90 %以上;固定化嗜热菌蛋白酶可高产率及专一性催化合成高甜度低热量的二肽甜味剂Aspartame 的前
体Z - L - Asp - L - Phe -OMe 、并可同时实现天冬甜精的生物合成与DL -苯丙氨酸甲酯的光学拆分[11] 。通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备、且具有潜在的应用前景。脂肪酶既能催化天然油脂及酯类的水解,也能在有机介质中催化酯的合成、交换、氨解及肽合成而具有重要工业价值, 故固定化脂肪酶的研究颇受重视。固定化酶在化学及化工领域中的应用研究也是人们感兴趣的课题,通过反相悬浮聚合制备的聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体可直接用于洗涤剂制备,且具有潜在的应用前景。
3.4 固定化酶在皮革工业中的应用
皮革工程是经过一定的处理过程,将原料皮中的可溶性蛋白质、毛、脂肪、弹性蛋白和网硬蛋白等非制革成分去除掉,加入所需要的鞣剂、复鞣剂、加脂剂等材料以提高其使用性能,满足人们的各种需要的过程。由于酶具有较好的专一性、温和性和高效性等生物催化特性,在制革的过程中已有许多工序(浸水、浸灰、脱脂和软化等) 得到应用,在高档皮革的制造过程中则更为如此。在皮革工业废水的处理及固体废弃物的资源化与有效利用方面,酶更是得到了广泛的应用[12 ]。
在皮革的生产中,在传统的酶处理后应尽快转入下一道工序。例如,在浸水、浸灰、脱脂和软化等达到预期的目的之后,都要尽快地转入下一道工序。否则,其中的酶还存在一定的活性,还会对皮坯进行作用,影响产品的质量。如果在皮革的生产过程中采用磁性固定化酶技术,在酶处理达到预期目的之后,将其中的酶完全回收。一方面,酶还可以继续使用,有一定的经济效益;另一方面,皮革中已没有酶,不会在没有转入下一工序之前继续作用,影响皮革的质量,有利于皮革产品质量的控制。
3.5 固定化酶在处理工业废水中的应用。
在工业污水处理中,往往要用到生物曝气法。其原理是在生物细胞内酶的催化作用下产生氧化分解作用。污水中溶解性的物质透过细胞壁,在胞内酶的催化作用下,迅速完成氧化、合成一系列生化反应;被吸附在细胞壁周围的污水中的固体物质,则由细菌分泌出的胞外酶将其转化成可溶性物质,再渗入细胞壁,由胞内酶去进行生化反应。一部分有机物被氧化分解为二氧化碳、水、氨等,并放出能量,另一部分有机物则转化为生物体所必需的营养物质,组成新的原生质,通过这一过程,污水中的COD、BOD、色度等都得到降低,污水得到净化[10]。如果在皮革污水处理池中设置一固定化装置,采用现代技术将处理污水所必需的生物酶固定在其表面上,在污水处理的过程中,随着污水的运动,这些酶就可以与其中的有机物进行广泛的接触而发生所需要的生物化学反应,达到净化污水的目的。在处理的过程中,固定化酶还可以一直使用下去,而其活性也不会降低。
漆酶作为一种高效，绿色的催化剂，随着固定化技术的不断发展，扩大了漆酶的工业应用范围和前景，固定化酶在废水处理中有着重要的应用价值。工业废水中含有大量的难降解的酚类物质，如氯酚等，国内外许多学者已经对固定化酶降解有毒的酚类物质进行了大量的研究，张树江等用固定化漆酶去处废水中的2 ,4- 2 二氯酚的去除率可达99.5 %以上，且不产生二次污染，催化效率高[13 ]。随着染料工业的发展，染料结构复杂且不易降解，固定化漆酶对染料的降解也有独特的作用，且可以回收重复使用，降低成本。
4 固定化酶在其它领域的应用及展望
4.1 固定化酶在生化制药中的应用
固定化酶的另一个巨大市场是用来生产工业、医学等领域的一些纯度要求较高的制剂, 这其中有最早生产的氨基酸, 还有抗生素、核酸、蛋白质抗体、高纯度的蛋白酶等。科研人员首先于1973 年用固定化的青霉素酰化酶生产制造各种半合成的青霉素和头孢霉素, 后来,我国的科学家也不断地尝试各种固定化方法, 有的直接用戊二醛交联产该酶的大肠杆菌, 也有用ABSE- 交联琼脂糖与青霉素酰化酶直接偶联, 还有的利用三醋酸纤维素包埋和戊二醛交联相结合固定青霉素酰化酶高产菌, 这些试验的结果都显示各种固定化方法均可在很大程度上提高酶的稳定性、增加酶的转化率[14 ]。
4.2 固定化酶在生物传感器和环境保护中的应用
生物传感器是由生物活性物质与换能器组成的分析系统, 可以简便、快速地测定各种特异性很强的物质,在临床分析、工业监测等方面有着重要的意义。固定化葡萄糖氧化酶传感器是其中应用最为广泛的一种。制药厂将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和一种显色剂一起固定在试纸上, 制成检验妇女是否妊娠的试纸, 只要将该试纸浸入被检尿样中几秒钟就可以马上检测出尿样的葡萄糖是否超标, 从而断定该妇女是有血糖、尿糖还是妊娠[14 ]。
固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求[15 ] 。固定化酶一个很大的用途是处理废水中一些有毒有害物质, 防止污染，从而有效的保护了生活环境。
五结语
酶作为一种生物催化剂对人类的生产生活起到了极其重要的作用，而酶的固定化技术的产生与发展更使得酶的功能在工业生产的各个领域得到了体现。近年来酶的固定化及应用研究已得到长足进展, 并且不停的开发新型固定化技术、改进传统固定化方法。一些生物技术, 特别是蛋白质工程和基因重组等分子生物学技术的发展和酶固定化技术可以相互补充, 必将对固定化酶在环境保护、食品工业、生物传感器、有机合成等领域的应用起到更大的推动作用。而在不停进步的现代工业生产中固定化酶更将继续发挥其不可取代的作用，特别是新技术的开发利用使得固定化酶在工业生产中更具广阔的发展前景。
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Immobilized in the modern industrial application
Name: Hu Yanfen Instructor: ZhangMeng
Abstract Enzymes are a class of proteins with catalytic function, with mild reaction conditions, substrate specificity, and can be in aqueous solution and neutral pH operation, etc.. Compared with free enzyme, immobilized enzyme while maintaining its high specificity and moderate catalytic properties of enzymes, they also overcome the inadequacies of the free enzyme. This paper introduces the concept of the immobilized enzyme, preparation methods and in biology, medicine, environmental protection and other aspects of the wide range of applications. Highlights some of the immobilized enzyme applications in modern industry, and its application prospect.
Key words Immobilized Preparation Industry Application foreground
酶固定化技术及其应用 摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并且迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。 关键词：酶固定化；载体；应用 The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly. This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme technology application. 一、前言 酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，与化学催化剂相比具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强,可在水溶液和中性pH 下操作等优点。但其 高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素均可使没丧失活力。 而且，随着反应过程的进行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产 物在一起，反应后酶不能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以 上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得 方法十分迫切。 可喜的是，经过专家学者的不断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍能与底物有效的进行反应。这中酶的出现，使得酶与产物在反应液中相互分离，具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。 酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作 用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重 要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研 究新进展。 二、传统酶固定化技术
第三章酶的应用技术实践 3.2制备和应用固定化酶 探究目的： 1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习： 固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞 技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。 固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三 角架，石棉网，注射器等。 探究过程： 探究反思： 固定化酵母菌技术有哪些优点? 探究示例： 请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。 （1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是 （2）包埋法固定化是指___________________________________ 。 （3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________ _______________________ 。（答出三种即可） （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是 （5）制备固定化酵母细胞的步骤为: 【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。 （2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。 （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。 （5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。 【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多 孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵 母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。 【矫正反馈】 1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（） A.包埋法 B.物理吸附法 C.化学结合法 D.高温冷却法 2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（） A.成本高，但操作更容易 B.成本低，但操作更复杂 C.成本高，且操作更复杂 D.成本低，且操作更容易 3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（） ①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌 ①③D.②④ 让酵母细胞在缺水状态下休眠 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是 （） ①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻 酸钠溶液③酵母细胞的活化 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液 A.①②③④⑤ B.③①②⑤④ C.③⑤②①④ 6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ 7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（） A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成 8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（） A.向瓶内泵入氧气 B.应将装置放于适宜的条件下进行 C.瓶内应富含葡萄糖等底物 D.将瓶口密封，效果更好 探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。 2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下 糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。 3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。 4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的 酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌- 海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注 射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙 溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。 5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于 25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C. 4 .酵母细胞的活化是指（） A.让酵母细胞恢复运动状态 B. C.让酵母细胞内酶活性加倍 D. ④固定化酵母细胞 D.③②⑤①④ ）
酶工程课程论文 题目：酶的固定化技术及其应用 学院：食品学院 专业：食品科学与工程 班级：食品101（35） 2012-11-21
酶的固定化技术及其应用 摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。并对其研究的前景进行了简洁的预测。 关键字：酶固定化技术应用 酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。 固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。 用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶细胞或 细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应．由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术． 固定化细胞的优点是： (1)省去了酶分离纯化的时间和费用； (2)可进行多酶反应； (3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性． 但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足 之处： (1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代 谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低； (2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤 其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别 明显： (3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相 应的固定化酶活性低．
实验六十二固定化酶制备及酶活力测定 实验项目性质：综合性 所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定 计划学时：6学时 一、实验目的 1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。 2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 二、实验原理 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。 酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。 载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。 交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。 包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
选修一：考点4：制备和应用酶的固定化技术 【学习目标】 1．说出固定化酶概念和方法(A) 2．制备固定化酵母细胞(B) 【知识梳理】 （一）课题背景 酶：优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。 实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。 设想：能否有一种方法使酶发挥它的优点，而没有这些缺点？ 固定化酶：优点：容易与水溶性反应物和生成物分离，可被反复使用 实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都 是通过一系列的酶促反应才能得到的 设想：细胞中有多种酶，能否用固定化酶类似的技术来处理细胞？ 固定化细胞：优点：成本低，操作更容易 （二）、固定化酶的应用实例 高果糖浆是指果糖含量为42%的糖浆能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 （三）、固定化细胞技术 固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被化学结合或吸附，而个小的酶容易从包埋料中漏出。 包埋法固定化细胞即将微生物细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法 〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶）。 （四）、实验操作 (1)制备固定化酵母细胞 制备固定化酵母细胞需要的材料是干酵母、CaCl2和海藻酸钠溶液 1.酵母菌的活化 活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。 2.配制物质的量尝试为0.05mol/L的Cacl2溶液 3.配制海藻酸钠溶液 加热溶化海藻酸钠时要注意：微火加热并不断搅拌，防止海藻酸钠焦糊 4.海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合
第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。 3．制备固定化酶的常用方法 目前，制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用 1．应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 2．优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快等。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓
活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。 (1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。 各种固定化酶方法的比较
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。 关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定 固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍 开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶 的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与 能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。下面从传统固定化技术、传统固定化技术的改进、新型固定化技术等三个方面来概述一下酶固定化方法的研究进展： 一、传统固定化技术 ⒈吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法。吸附法包括物理吸附和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点,可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料,有时酶的纯化与固定化也可同时实现。因酶分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性,共价结合法是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。 物理吸附法常用的吸附剂有活性炭.氧化铝.硅藻土.多孔陶瓷.多孔玻璃.硅胶.羟基磷灰 石等。吸附法制备固定化酶,操作简便,条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价廉易得,而且
酶的固定化技术 摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。 关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞 Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future. Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell 前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。
2019年精选生物《生物技术实践》[第三章酶的应用技术实践第二节制备和应用固定化酶]苏教版巩固辅导[含答案解析]第四十五篇 第1题【单选题】 下列关于加酶洗衣粉的说法中，正确的是( ) ①加酶洗衣粉的效果总比普通洗衣粉的效果好②加酶洗衣粉效果的好坏受很多因素影响③加酶洗衣粉中目前常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶④加酶洗衣粉相对普通洗衣粉来讲有利于保护环境． A、②③④ B、①②③ C、①② D、①③④ 【答案】： 【解析】： 第2题【单选题】 在原材料有限的情况下，能正确表示相同时间内果胶酶的用量对果汁产量影响的曲线是
A、甲 B、乙 C、丙 D、丁 【答案】： 【解析】： 第3题【单选题】 A、温度影响果胶酶的活性 B、若温度从10℃升高到40℃，酶的活性都将逐渐增强 C、40℃与60℃时酶的活性相等 D、该酶的最适温度一定是50℃ 【答案】： 【解析】： 第4题【单选题】 目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于酶应用中面临的实际问题的是( ) A、酶对高温不敏感，但对强酸、强碱非常敏感 B、加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境 C、固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性 D、酶的催化功能很强，但需给以适当的营养物质才能较长时间维持其作用 【答案】：
【解析】： 第5题【单选题】 下列关于纤维素酶的说法，错误的是( ) A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 【答案】： 【解析】： 第6题【单选题】 下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( ) A、反应产物对固定化酶的活性没有影响 B、实验室常用吸附法制备固定化酵母细胞 C、若发酵底物是大分子，则固定化细胞优于固定化酶 D、固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显【答案】： 【解析】：
固定化酶技术与应用 姓名：高强 专业：生物科学 学号：2004083011 日期：2013年5月
固定化酶技术及应用 摘要：近年来由于固定化酶技术的发展，对固定化酶载体的研究非常活跃。本文对固定化酶载体,固定化酶的应用生产,酶传感器，固定化细胞技术进行简单介绍。 关键词：固定化酶载体应用固定化细胞 引言 固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物。1971年第一届国际酶工程会议上正式建议采用“固定化酶”的名称。所谓固定化酶，即在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶属于修饰酶，其具有以下优点：1极易将固定化酶与底物，产物分开；2可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；3在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；4反应过程能够加以严格控制；5产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；6较游离酶更适合于多酶反应；7可以增加产物的收率，提高产物的质量；8酶的使用效率提高，成本降低。鉴于固定化酶的优点，本文从固定化酶载体的研究进展,固定化酶的应用，固定化酶的生产，在食品加工中的使用，固定化细胞技术等方面进行介绍。 固定化酶载体研究进展 载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。酶蛋白的活性中心是酶催化活性所必需的，酶蛋白的空间结构也与酶活力密切相关，因而．在固定化的过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响．而且要避免酶蛋白高级结构的破坏[1]。 甲壳素及壳聚糖作为载体的固定化方法报道较多的有吸附法、通过双功能试剂交联的共价结合法。目前，使用较多的是用戊二醛作交联剂的共价结合法。载体的形态有片状、球状、膜状、无定形等。1982年．John Wiley 利用甲壳素、壳聚糖的吸附作用固定化胰蛋白酶，把甲壳素、壳聚糖固态混合研磨40h，加入粉末状胰蛋白酶混合研磨进行固定化，另一对照样加入酶液进行固定化。结果表明胰蛋白酶以粉末状进行固定化时效果更好，且研磨时间越长，固定化效果越好。得出结论：甲壳素、壳聚糖表面积的增加有利于胰蛋白酶的固定化溶液酶在数天内几乎失去全部活力，而固定化酶在室温或高于室温的条件下仍保持其活力。 纳米粒子作为酶固定化的载体，当其具有磁性时，制备的固定化酶易从反应体系中分离和回收，操作简便；并且利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。在众多纳米材料中，氧化铁因其在磁性、催化等多方面的良好特性而备受瞩目[2]。 微胶囊是一种采用高分子聚合物或其他成膜材料将物质的微粒或微滴包覆所形成的微小容器，其粒径一般在微米至毫米级范围，通常为5～400μm。将酶用微胶囊包覆后形成的微胶囊固定化酶，由于被催化物质和产物可自由通过囊壁,因而能起到酶催化剂的作用[3]。酶经过微胶囊固化后,还使酶具有如下的优点：①提高了酶的稳定性,使其可以在恶劣的条件下存活。微胶囊囊壁可将对酶活性和稳定性有影响的抑制因子、有害因子等排除在外，同时还可与一定量的稳定剂、整合剂等一起包埋，进一步增加其耐极端条件的能力；②通过选择合适的胶囊，可控制酶的释放时间。这对于多阶段加工过程中酶的活力要在后一阶段发挥的情况
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
第二节固定化酶的制备和应用 1．掌握制备固定化酶的常用方法。(重点) 2．掌握酵母菌细胞的固定化技术。(重难点) 1．固定化酶 固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．制备固定化酶的方法 (1)物理吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。 3．固定化酶的优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。 [合作探讨] 探讨1：对固定化酶的作用影响最小的固定方法是哪一种？ 提示：物理吸附法。 探讨2：为什么固定化酶不适合采用包埋法？ 提示：由于酶分子较小，容易在包埋材料中漏出，所以不适合采用包埋法固定化。 探讨3：如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法？ 提示：因为大分子物质不容易进入细胞内，应采用固定化酶技术。 [思维升华] 1．制备固定化酶的常用方法可用下图所示： 2．常用的制备固定化酶的方法
1．最广泛的细胞固定化方法 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 2．优点 (1)无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，降低了生产成本。 (2)不仅可以作为单一的酶发挥作用，且可以利用细胞中所含的复合酶完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。 [合作探讨] 探讨1：固定化细胞为什么只能用于生产胞外酶和其他能分泌到细胞外的产物？ 提示：因为固定化细胞固定的是活细胞，细胞膜具有选择透过性，细胞内有用的物质(如胞内酶)是不能自由进出细胞的。 探讨2：能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？ 提示：不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。 探讨3：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明了什么？如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，又说明了什么？ 提示：如果凝胶珠的颜色过浅，则说明了海藻酸钠溶液的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明了海藻酸钠的浓度过高，制作失败。 [思维升华] 1．制备固定化酵母菌细胞的操作流程 准备各种实验药品和器具
固定化酶在现代工业中的应用姓名：胡艳芬学号：2008132106 指导教师：张孟 摘要酶是一类有催化功能的蛋白质,具有反应条件温和, 底物专一性强, 可在水溶液和中性pH 下操作等优点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处。本文简要介绍了固定化酶的概念、制备方法及其在生物、医药、环境保护等方面的广泛应用。重点介绍一些固定化酶在现代工业中的应用，并对其应用前景进行了展望。 关键词固定化酶制备工业应用前景 酶是一类由活细胞产生的具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质,具有极高的催化效率、高度的特异性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的。由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点,符合绿色化学的要求,从而被大家高度重视,已在许多领域得到广泛的应用[1]。酶的最大缺点是其不稳定性,在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性,活性降低或丧失;而且酶反应后,会在溶液中残留,造成酶反应难以连续化、自动化,同时也不利于终产品的分离提纯,这些都大大阻碍了酶工业的发展,所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多,其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能[2]。 已固定化的酶像化学反应所用的固体催化剂那样, 既能发挥它们的催化特性, 又能回收, 并能多次反复使用, 使整个生产工艺可以连续化、自动化。近年来, 国内外科技工作者在固定化酶在工业生产中的应用做了大量研究，并得到了广泛的发展，本文将对这些成就做具体介绍。 1 固定化酶的概念 1916 年Nelson 和Griffin最先发现了酶的固定化现象后, 科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969 年日本一家制药公司第1 次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸, 开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的,而经过固定化以后,酶被束缚在一定区域内,因而这样的酶被称为固定化酶[ 3, 4 ]。
固定化酶制备及酶活力测定 实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青 实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20 实验指导：易喻 摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。 关键词：固定化酶酶活力包埋法 Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity. 前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 正文： 1.实验过程 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 ①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂
课题3酵母细胞的固定化 1．概念 利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 2．方法 (1)包埋法：多适于细胞的固定化； (2) }化学结合法物理吸附法多适于酶的固定化。 3．载体 包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 4．优点 (1)固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。 (2)固定化细胞技术制备的成本低，操作容易。 5．实例——高果糖浆的生产 (1)原理：葡萄糖―――――→葡萄糖异构酶果糖。 (2)生产过程： ①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。 ②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。 ③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。 1．固定化酶常采用化学结合法和物理吸附法，而 固定化细胞则常采用包埋法。 2．制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞 的活化―→配制CaCl 2溶液―→配制海藻酸钠溶 液―→海藻酸钠与酵母细胞混合―→固定化酵 母细胞。 3．配制海藻酸钠溶液浓度过高，则难以形成凝胶 珠；若浓度过低，则固定的酵母细胞少，影响 实验效果。 4．配制海藻酸钠溶液应小火加热或间断加热。 5．固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重 复利用，降低了成本，又提高了产品质量。
(3)反应柱：酶固定在一种颗粒状的载体上，再将其装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。 (4)优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。要想既降低生产成本，又不影响产品质量，该如何解决这一问题？ 提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，还可重复利用。 2．固定化酶和固定化细胞一般采用什么方法？为什么？ 提示：固定化酶常用化学结合法或物理吸附法。因酶分子小，易从包埋材料中漏出，故一般不用包埋法进行固定。固定化细胞常用包埋法，因个大的细胞难以被吸附或结合。 3．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？ 提示：固定化细胞技术。固定化细胞技术。 4．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？ 提示：一系列酶；固定化细胞技术。 5．如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？为什么？ 提示：固定化酶技术。因为大分子物质不容易进入细胞内，如果采用固定化细胞技术会使反应效率下降。 [跟随名师·解疑难] 直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较
2013年高中生物 3.2 制备和应用固定化酶同步训练苏教版选修1 1.(2012·海安高二期中)固定化酶与普通酶制剂相比较，主要优点是( ) A．可以反复使用，降低成本 B．固定化酶不受酸碱度、温度等的影响 C．酶的制备更简单容易 D．酶能够催化的反应类型大大增加 解析：选A。固定化酶与普通酶制剂相比较主要优点是可以反复使用，降低成本，固定化酶仍具有酶的特性。 2.下列图形依次表示包埋法、吸附法、交联法、包埋法的一组是( ) A．①②③④B．④③②① C．③①②④D．④②③① 解析：选C。考查酶固定的方法及对每种方法的原理的理解。 3.关于固定化酶技术的说法，正确的是( ) A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C．固定化酶中的酶无法重复利用 D．固定化酶技术是将酶固定在一定空间内的技术 解析：选D。固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可重复利用；其缺点是无法同时解决一系列酶促反应。在固定过程中，固定的是酶而不是反应物。 4.使用固定化细胞的优点是( ) A．能催化大分子物质的水解 B．可催化一系列化学反应 C．与反应物易接近
D．有利于酶在细胞外发挥作用 解析：选B。固定化细胞的优点是可催化一系列反应。 5.(2012·无锡高二检测)下列叙述不．正确的是( ) A．从操作角度来考虑，固定化细胞比固定化酶更容易 B．固定化细胞比固定化酶对酶活性的影响更小 C．固定化细胞固定的是一种酶 D．将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应选择固定化细胞技术 解析：选C。固定化细胞内酶的活性基本没有损失，保留了细胞内原有的多酶系统，所以固定化细胞不同于固定化酶只固定一种酶。 6.某一实验小组的同学，欲通过制备固定化酵母菌细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，实验材料及用具齐全。 (1)制备固定化酵母菌细胞常用________法。 (2)制备固定化酵母细胞的过程为： ①使干酵母与________混合并搅拌，使酵母菌活化； ②将无水CaCl2溶解在蒸馏水中，配成CaCl2溶液； ③用酒精灯加热配制海藻酸钠溶液； ④海藻酸钠溶液冷却至常温再加入已活化的酵母菌细胞，充分搅拌并混合均匀； ⑤用注射器将海藻酸钠和酵母菌细胞的混合物缓慢滴入氯化钙溶液中。 (3)该实验小组用下图所示的装置来进行葡萄糖发酵：(a是固定化酵母，b是反应柱) ①从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原因是： ________________________________________________________________________。 ②要想得到较多的酒精，加入反应液后的操作是________活塞1和________活塞2。 ③为使该实验中所用到的固定化酵母菌细胞可以反复利用，实验过程一定要在________条件下进行。