第三章酶的应用技术实践
3.2制备和应用固定化酶
探究目的：
1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理
2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习：
固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞
技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。
吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。
包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。
海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。
固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。
材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三
角架，石棉网，注射器等。
探究过程：
探究反思：
固定化酵母菌技术有哪些优点?
探究示例：
请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。
（1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是
（2）包埋法固定化是指___________________________________ 。
（3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________
_______________________ 。（答出三种即可）
（4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是
（5）制备固定化酵母细胞的步骤为:
【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。
（2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。
（4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。
（5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。
【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多
孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵
母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。
【矫正反馈】
1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（）
A.包埋法
B.物理吸附法
C.化学结合法
D.高温冷却法
2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（）
A.成本高，但操作更容易
B.成本低，但操作更复杂
C.成本高，且操作更复杂
D.成本低，且操作更容易
3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（）
①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌
①③D.②④
让酵母细胞在缺水状态下休眠
让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态
5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是
（）
①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻
酸钠溶液③酵母细胞的活化
⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液
A.①②③④⑤
B.③①②⑤④
C.③⑤②①④
6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（
7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（）
A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化
B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法
C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀
D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成
8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（）
A.向瓶内泵入氧气
B.应将装置放于适宜的条件下进行
C.瓶内应富含葡萄糖等底物
D.将瓶口密封，效果更好
探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。
2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下
糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。
3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。
4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的
酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌-
海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注
射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙
溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。
5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于
25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C.
4 .酵母细胞的活化是指（）
A.让酵母细胞恢复运动状态
B.
C.让酵母细胞内酶活性加倍
D.
④固定化酵母细胞
D.③②⑤①④
）
9?下列属于固定化酶在利用时的特点的是（）
A.有利于酶与产物分离
B.制成的加酶洗衣服可以被反复利用
C.能自由出入依附的载体
D.能催化一系列的酶促反应
10?关于固定化酶技术说法正确的是( )
A.固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术
B.固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应
C.固定化酶中的酶无法重复利用
D.固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术
11?研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的
C.水分
D.营养
()
B .可催化一系列化学反应
D .有利于酶在细胞外发挥作用
.将酶相互连接起来
C.酶制品的生产包括酶的生产、提取、分离纯化和固定化等
D.固定化细胞不属于酶制剂
15.如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制()。
A.直接使用酶 B .使用化学方法结合的酶
C.使用固定化细胞 D .使用物理吸附法固定的酶
16.下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是()。
A.酶分子很小，易采用包埋法
B.酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶
C.细胞个大，难被吸附或结合 D .细胞易采用包埋法固定
17.关于固定化酶的叙述不正确的是()。
A.既能与反应物接触，又能与产物分离 B .固定在载体上的酶可被反复利用
C.可催化一系列反应 D .酶的活性和稳定性受到限制
18.固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是()。
A.避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程
B.固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用
C.促化反应结束后，能被吸收和重复利用
D.细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用
19.关于酵母细胞活化的说法，不正确的是()。
A.酵母细胞活化就是由无氧呼吸变成有氧呼吸
B.活化就是让处于休眠状态的细胞恢复生活状态
C.酵母细胞活化所需要的时间较短D .酵母细胞活化后体积增大
20.下列关于酶的叙述中正确的是()。
A.酶都提取于动植物细胞
B.酶制剂能够重复利用
C.果酒和果汁能够用酶制剂澄清
D.酶固定后称为酶制剂
21.对配制海藻酸钠溶液的叙述不准确的是()。
A.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环
B.海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量
C.海藻酸钠的浓度过高，易形成凝胶珠
D.海藻酸钠的浓度过低，
22.目前，日用化工厂大量生产的酶制剂，其中的酶大都来自(
A.化学合成B动物体内C植物体内D微生物体内
【迁移应用】
1.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( )
A.固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显
B.在固定化酶的应用中，要控制好
pH、温度和溶解氧C.利用固定化酶降解水体中的有机磷农药，需提供适宜的营养条
件
D.利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物
第3页
2 .右图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意
图.下列叙述正确的是
A.剐溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液-
B.图1中X溶液为CaC2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠
C.图2发酵过程中搅拌的目的是为了使培养液与酵母菌充分接触
D .图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中
3.下面是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答：
酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。(1)___________ 在状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复
________ 状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时______________ 。
(2)________________________________________ 影响实验成败的关键步骤是。
(3 )如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶
珠所包埋的酵母细胞数目_________ 。
(4 )观察形成凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明______________________ ;如果形成的凝胶珠
不是圆形或椭圆形，说明—。
(5)固定化细胞技术一般采用包埋法固定化，原因是_______________ 。
(6 )该实验中CaC2溶液的作用是_____________________________ 。
4.酵母菌是一种单细胞真菌，酿酒和做面包都需要酵母菌，根据所学知识回答：
(1)在探究培养液中酵母菌种群的数量变化”的实验中，某学生的部分实验操作过程是这样的：
①从静置试管中吸取酵母菌培养液进行计数，记录数据；
②把酵母菌培养液放置在冰箱中；
③第七天再取样计算，记录数据，统计分析绘成曲线。
请纠正该同学实验操作中的错误：___________________________________________
(2)下面的流程图示意是制备固定化酵母细胞的过程，请据图回答：
配制CaC2溶液T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞
①图中酵母菌活化就是_____________________ 状态。
②影响此实验成败的关键步骤是_________________ ，此步的操作应采用
。
③观察形成的凝胶珠颜色和形状：如果颜色过浅，说明
。
④本实验所用的固定化技术是________ ，而制备固定化酶则不宜用此方
法，原因是_____________________________ 。
5.下图为固定化酶的反应柱示意图，请据图回答：
(1)请请在横线上填出各标号名称.①__________ ②_________ ③ ________ 。
⑵ 与一般酶制剂相比，固定化酶的突出优点是__________________ 和,
固定化细胞的优点是______________________ 。
(3)_________________________ ③的作用是。
(4)__________________________________________ 制作固定葡萄糖异构
酶所用的方式有____________________________________ 或____________ 。
(5)据图说出反应柱的作用原理______________________________________
A.温度
B. pH
12.使用固定化细胞的优点是
A.能催化大分子物质的水解
C.与反应物易接近
13.酶的固定方法不包括() A.
将酶吸附在固体表面 B
C.将酶包埋在细微网格里 D 将酶制成固体酶制剂，如加酶洗衣粉中的酶
14.下列关于酶制剂的叙述错误的是
A.酶制剂是包含酶的制品 B
()。
.包内酶和包外酶均可用于制成酶制品
形成凝胶珠内包埋细胞过少
E1
固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：
酶固定化技术及其应用 摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并且迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。 关键词：酶固定化；载体；应用 The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly. This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme technology application. 一、前言 酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，与化学催化剂相比具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强,可在水溶液和中性pH 下操作等优点。但其 高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素均可使没丧失活力。 而且，随着反应过程的进行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产 物在一起，反应后酶不能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以 上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得 方法十分迫切。 可喜的是，经过专家学者的不断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍能与底物有效的进行反应。这中酶的出现，使得酶与产物在反应液中相互分离，具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。 酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作 用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重 要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研 究新进展。 二、传统酶固定化技术
第三章酶的应用技术实践 3.2制备和应用固定化酶 探究目的： 1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习： 固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞 技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。 固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三 角架，石棉网，注射器等。 探究过程： 探究反思： 固定化酵母菌技术有哪些优点? 探究示例： 请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。 （1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是 （2）包埋法固定化是指___________________________________ 。 （3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________ _______________________ 。（答出三种即可） （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是 （5）制备固定化酵母细胞的步骤为: 【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。 （2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。 （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。 （5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。 【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多 孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵 母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。 【矫正反馈】 1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（） A.包埋法 B.物理吸附法 C.化学结合法 D.高温冷却法 2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（） A.成本高，但操作更容易 B.成本低，但操作更复杂 C.成本高，且操作更复杂 D.成本低，且操作更容易 3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（） ①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌 ①③D.②④ 让酵母细胞在缺水状态下休眠 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是 （） ①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻 酸钠溶液③酵母细胞的活化 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液 A.①②③④⑤ B.③①②⑤④ C.③⑤②①④ 6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ 7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（） A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成 8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（） A.向瓶内泵入氧气 B.应将装置放于适宜的条件下进行 C.瓶内应富含葡萄糖等底物 D.将瓶口密封，效果更好 探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。 2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下 糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。 3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。 4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的 酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌- 海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注 射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙 溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。 5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于 25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C. 4 .酵母细胞的活化是指（） A.让酵母细胞恢复运动状态 B. C.让酵母细胞内酶活性加倍 D. ④固定化酵母细胞 D.③②⑤①④ ）
实验六十二固定化酶制备及酶活力测定 实验项目性质：综合性 所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定 计划学时：6学时 一、实验目的 1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。 2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 二、实验原理 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。 酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。 载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。 交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。 包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。
选修一：考点4：制备和应用酶的固定化技术 【学习目标】 1．说出固定化酶概念和方法(A) 2．制备固定化酵母细胞(B) 【知识梳理】 （一）课题背景 酶：优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域。 实际问题：对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。 设想：能否有一种方法使酶发挥它的优点，而没有这些缺点？ 固定化酶：优点：容易与水溶性反应物和生成物分离，可被反复使用 实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都 是通过一系列的酶促反应才能得到的 设想：细胞中有多种酶，能否用固定化酶类似的技术来处理细胞？ 固定化细胞：优点：成本低，操作更容易 （二）、固定化酶的应用实例 高果糖浆是指果糖含量为42%的糖浆能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 （三）、固定化细胞技术 固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被化学结合或吸附，而个小的酶容易从包埋料中漏出。 包埋法固定化细胞即将微生物细胞均匀包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法 〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶）。 （四）、实验操作 (1)制备固定化酵母细胞 制备固定化酵母细胞需要的材料是干酵母、CaCl2和海藻酸钠溶液 1.酵母菌的活化 活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。 2.配制物质的量尝试为0.05mol/L的Cacl2溶液 3.配制海藻酸钠溶液 加热溶化海藻酸钠时要注意：微火加热并不断搅拌，防止海藻酸钠焦糊 4.海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合
酶的固定化技术 摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。 关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞 Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future. Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell 前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。
摘要：酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。因此酶的固定化技术研究已成为十分引人注目的领域。本文简要介绍了固定化酶技术的概念、制备方法(包括传统固定化技术、传统固定化技术的改进方法、新型固定化技术) 及其在化学化工、食品行业、临床医药、生物传感器和环境科学等领域中的应用现状与存在的问题,并对固定化酶技术的应用前景进行了展望。 关键词：固定化酶；制备；应用；磁性载体；定向固定 固定化酶的研究始于1910年,正式研究于20世纪60年代,70年代已在全世界普遍 开展。酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶 的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与 能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。下面从传统固定化技术、传统固定化技术的改进、新型固定化技术等三个方面来概述一下酶固定化方法的研究进展： 一、传统固定化技术 ⒈吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法。吸附法包括物理吸附和离子结合法。工艺简便和条件温和是该方法显著的优点,可供选择的载体涉及天然或合成的无机与有机高分子材料,有时酶的纯化与固定化也可同时实现。因酶分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性,共价结合法是目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。 物理吸附法常用的吸附剂有活性炭.氧化铝.硅藻土.多孔陶瓷.多孔玻璃.硅胶.羟基磷灰 石等。吸附法制备固定化酶,操作简便,条件温和,不会引起酶的变性失活,载体价廉易得,而且
第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。 3．制备固定化酶的常用方法 目前，制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用 1．应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 2．优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快等。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓
活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。 (1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。 各种固定化酶方法的比较
酶工程课程论文 题目：酶的固定化技术及其应用 学院：食品学院 专业：食品科学与工程 班级：食品101（35） 2012-11-21
酶的固定化技术及其应用 摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。并对其研究的前景进行了简洁的预测。 关键字：酶固定化技术应用 酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。 固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。 用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶细胞或 细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应．由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术． 固定化细胞的优点是： (1)省去了酶分离纯化的时间和费用； (2)可进行多酶反应； (3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性． 但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足 之处： (1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代 谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低； (2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤 其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别 明显： (3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相 应的固定化酶活性低．
2019年精选生物《生物技术实践》[第三章酶的应用技术实践第二节制备和应用固定化酶]苏教版巩固辅导[含答案解析]第四十五篇 第1题【单选题】 下列关于加酶洗衣粉的说法中，正确的是( ) ①加酶洗衣粉的效果总比普通洗衣粉的效果好②加酶洗衣粉效果的好坏受很多因素影响③加酶洗衣粉中目前常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶④加酶洗衣粉相对普通洗衣粉来讲有利于保护环境． A、②③④ B、①②③ C、①② D、①③④ 【答案】： 【解析】： 第2题【单选题】 在原材料有限的情况下，能正确表示相同时间内果胶酶的用量对果汁产量影响的曲线是
A、甲 B、乙 C、丙 D、丁 【答案】： 【解析】： 第3题【单选题】 A、温度影响果胶酶的活性 B、若温度从10℃升高到40℃，酶的活性都将逐渐增强 C、40℃与60℃时酶的活性相等 D、该酶的最适温度一定是50℃ 【答案】： 【解析】： 第4题【单选题】 目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于酶应用中面临的实际问题的是( ) A、酶对高温不敏感，但对强酸、强碱非常敏感 B、加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境 C、固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性 D、酶的催化功能很强，但需给以适当的营养物质才能较长时间维持其作用 【答案】：
【解析】： 第5题【单选题】 下列关于纤维素酶的说法，错误的是( ) A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种 B、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖 C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁 D、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖 【答案】： 【解析】： 第6题【单选题】 下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( ) A、反应产物对固定化酶的活性没有影响 B、实验室常用吸附法制备固定化酵母细胞 C、若发酵底物是大分子，则固定化细胞优于固定化酶 D、固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显【答案】： 【解析】：
酶固定化技术研究进展 选题说明 酶作为一种生物催化剂，具有高催化效率，高选择性，催化反应条件温和，清洁无污染等特点，其卓越的催化效能，令普通无机催化剂难以望其项背，因此酶的工业化使用一直是广受社会关注的课题，但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及其一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本，严重限制了酶的工业推广。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近些年酶工程研究的重点。酶的固定化，是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。通过固定化，可以解决天然酶的局限性，实现酶的广泛运用。 基于对于酶的工业化使用和固定化酶的兴趣，我通过互联网和数据库信息检索的方式对酶的固定化技术发展状况进行了初步探索，并对目前的研究成果进行了简要的概括。希望能使大家对这一领域有所认识。 检索过程说明 1，检索工具和数据库 1.1，百度搜索引擎 1.2，Google搜索引擎 1.3，中国期刊全文数据库 1.4，万方数据系统 1.5，重庆维普中文科技期刊数据库 2，检索过程简述
首先，我选择了使用百度和Google搜索引擎进行关键词检索，都得到了浩繁的搜索结果，所的信息主要是百科简介和企业广告信息，介绍较为浅显陈旧，可利用性较差，但可以用于简单的信息了解，在搜素过程中，尝试使用了布尔检索规则如“固定化酶and应用”、高级检索和结果中检索的检索方式，以减小数据量。也尝试了Google学术搜索，得到了很多有用信息。运用维普中文科技期刊数据库搜素“题名或关键词”为“固定化酶”的相关资料得到655条，搜素“题名或关键词”为“固定化酶应用”的相关资料得到72条，检索关键词搜素“题名或关键词”为“固定化酶研究”的相关资料得到4条. 万方数据系统搜索主题词"固定化酶",得到相关资料1024条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料23条.。中国期刊全文数据库中检索“固定化酶技术”得到相关资料2604条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料742条 关键词 酶固定化载体制备研究应用 酶固定化技术研究进展 提要： 固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术。目前已得到长足的发展。本文重点介绍了固定化酶制备的传统方法和近些年出现的一些新方法，同时对酶在一些性能优良的栽体上的固定进行了综述。 正文： 一，传统的酶固定化方法
固定化酶制备及酶活力测定 实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青 实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20 实验指导：易喻 摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。 关键词：固定化酶酶活力包埋法 Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity. 前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 正文： 1.实验过程 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 ①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂
第二节固定化酶的制备和应用 1．掌握制备固定化酶的常用方法。(重点) 2．掌握酵母菌细胞的固定化技术。(重难点) 1．固定化酶 固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．制备固定化酶的方法 (1)物理吸附法的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。 3．固定化酶的优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。 [合作探讨] 探讨1：对固定化酶的作用影响最小的固定方法是哪一种？ 提示：物理吸附法。 探讨2：为什么固定化酶不适合采用包埋法？ 提示：由于酶分子较小，容易在包埋材料中漏出，所以不适合采用包埋法固定化。 探讨3：如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法？ 提示：因为大分子物质不容易进入细胞内，应采用固定化酶技术。 [思维升华] 1．制备固定化酶的常用方法可用下图所示： 2．常用的制备固定化酶的方法
1．最广泛的细胞固定化方法 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 2．优点 (1)无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，降低了生产成本。 (2)不仅可以作为单一的酶发挥作用，且可以利用细胞中所含的复合酶完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，使营养物质和产物的扩散受到一定的限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键性的限制因素。 [合作探讨] 探讨1：固定化细胞为什么只能用于生产胞外酶和其他能分泌到细胞外的产物？ 提示：因为固定化细胞固定的是活细胞，细胞膜具有选择透过性，细胞内有用的物质(如胞内酶)是不能自由进出细胞的。 探讨2：能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？ 提示：不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。 探讨3：如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明了什么？如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，又说明了什么？ 提示：如果凝胶珠的颜色过浅，则说明了海藻酸钠溶液的浓度偏低，固定的酵母菌细胞数目较少；如果凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明了海藻酸钠的浓度过高，制作失败。 [思维升华] 1．制备固定化酵母菌细胞的操作流程 准备各种实验药品和器具
固定化酶制备及应用的研究进展
固定化酶制备及应用的研究进展摘要：本文主要从分析酶单独应用中的不足、酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、化学工业、能源等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。 关键字：酶；酶的固定化；载体；酶固定化应用领域 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。本文将从酶生
物催化剂固定化载体、固定化方法和技术及固定化酶的应用等几个方面出发，归纳和综述这些方面近年来的研究进展。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。
专论与综述 固定化酶制备方法研究进展 曹树祥 黎苇 (九江职业大学,九江332000) 摘要 对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对 目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方 法的优缺点进行了比较。 关键词 固定化酶 吸附 包埋 共价键结合 肽键结合 交联 本世纪60年代,一项新的技术——固定化酶技术开始发展起来。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物,称为“水不溶酶”或“固相酶”。后来发现,也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。将酶置于超滤装置中时,高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧,而反应物可以透过膜流出,在这种情况下,酶本身仍是可溶的,只不过被固定在一个很有限的空间内,因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。1997年第1届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称。 从60年代起,固定化酶的研究迅速发展,固定化方法目前已超过200种以上。近来研究较多且应用最广的两种方法分别为卡拉胶聚糖包埋法和海藻酸钙凝胶包埋法。本文依据国内外有关文献及作者在这一领域的试验与体会就固定化酶的主要制备方法作简要介绍与评述。 1 固定化酶制备方法的分类 固定化酶的制备方法可分为如下几类: (1)吸附法:物理吸附法、离子吸附法等。 (2)包埋法:聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。 (3)共价键结合法:重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇-二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等。 (4)肽键结合法:酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。 (5)交联法。 2 吸附法 2.1 物理吸附法[1] 使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。常用的载体有:(1)有机载体,如面筋、淀粉等;(2)无机载体,如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。用此法制成的固定化酶,活力损失少,但酶与载体的结合不牢固,易于脱落,很少有实用价值。 2.2 离子吸附法[1] 此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合,酶吸附于载体上较为牢固。此法在工业上应用较广泛,常用的载体有:(1)阴离子交换剂,如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等;(2)阳离子交换剂,如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-120、IR-200、Dowex-50等。 1999-01-12收到初稿,1999-05-30收到修改稿。
课题3酵母细胞的固定化 1．概念 利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 2．方法 (1)包埋法：多适于细胞的固定化； (2) }化学结合法物理吸附法多适于酶的固定化。 3．载体 包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 4．优点 (1)固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。 (2)固定化细胞技术制备的成本低，操作容易。 5．实例——高果糖浆的生产 (1)原理：葡萄糖―――――→葡萄糖异构酶果糖。 (2)生产过程： ①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。 ②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。 ③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。 1．固定化酶常采用化学结合法和物理吸附法，而 固定化细胞则常采用包埋法。 2．制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞 的活化―→配制CaCl 2溶液―→配制海藻酸钠溶 液―→海藻酸钠与酵母细胞混合―→固定化酵 母细胞。 3．配制海藻酸钠溶液浓度过高，则难以形成凝胶 珠；若浓度过低，则固定的酵母细胞少，影响 实验效果。 4．配制海藻酸钠溶液应小火加热或间断加热。 5．固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重 复利用，降低了成本，又提高了产品质量。
(3)反应柱：酶固定在一种颗粒状的载体上，再将其装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。 (4)优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。要想既降低生产成本，又不影响产品质量，该如何解决这一问题？ 提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，还可重复利用。 2．固定化酶和固定化细胞一般采用什么方法？为什么？ 提示：固定化酶常用化学结合法或物理吸附法。因酶分子小，易从包埋材料中漏出，故一般不用包埋法进行固定。固定化细胞常用包埋法，因个大的细胞难以被吸附或结合。 3．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？ 提示：固定化细胞技术。固定化细胞技术。 4．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？ 提示：一系列酶；固定化细胞技术。 5．如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？为什么？ 提示：固定化酶技术。因为大分子物质不容易进入细胞内，如果采用固定化细胞技术会使反应效率下降。 [跟随名师·解疑难] 直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较