DNA甲基化检测技术全攻略
近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。
特异位点的甲基化检测
甲基化特异性PCR(MS-PCR)
这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序
这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)
DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。
荧光定量法(Methylight)
此种方法利用TaqMan? 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。
Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC
标记的亚硫酸氢盐转化的未甲化的DNA特异的TaqMan探针能与目标序列杂交。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号。信号强度与PCR产物的量成正比，据此可计算出样品的
甲基化程度。
甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析
亚硫酸氢盐处理后，甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异，这种差异可通过熔解曲线分析来发现，因为甲基化DNA含有更多的GC，相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的
变化，可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技术可检出极微小的差别。
使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物，相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪。目前市场上有多款PCR仪可满足要求，包括Illumina的Eco、QIAGEN的Rotor-Gene Q、罗氏LightCycler 480等。
焦磷酸测序
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基
化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量
甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点
的C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实
的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。
QIAGEN目前提供三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMark Q24 的强项在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。需要大样品量的应用更适合在PyroMark Q96 ID 上进行。在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最
大化可能会使实验成本变得很高。而PyroMark Q96 MD 装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。
为配合焦磷酸测序，QIAGEN还推出了PyroMark CpG Assays。这些预设计的甲基化分析使用特别定制的算法来设计出焦磷酸分析所用的PCR和测序引物，从而实现了基因组内特异靶点的甲基化分析。
基于芯片的甲基化图谱分析
就甲基化图谱分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多个公司都提供了这种工具，
包括安捷伦的Human CpG Island Microarray Kit，Illumina的HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，Roche NimbleGen的Human DNA Meth 2.1M Deluxe Promoter Array 和Affymetrix的seven-array GeneChip? Human Tiling 2.0R Array Set。
平台不同，过程也各异。安捷伦和NimbleGen的分析过程中，基因组DNA分成两份，一份用来做MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比例显示出该区域的甲基化程度。
安捷伦的244,000-element array覆盖了27000多个人CpG岛和甲基化不足区域(UMR)。NimbleGen的Human 2.1M Deluxe Promoter array也覆盖了27000多个CpG岛，
还包括了27000多个启动子区域，所有这些都是以100 bp的分辨率。然而这两个平台都不能以单核苷酸的分辨率报告甲基化状态，但是Illumina的Infinium和GoldenGate分析做得到。
Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。分析利用两个位点特异的探针拷问这些化学上差异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定拷问位点的甲基化水平。
此产品虽评价颇高，可惜目前已停产，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了每个样品中超过45万个甲基化位点，实现了基因区域和CpG岛的全面覆盖。此外，还附加了甲基化专家所精选的高价值内容，包括CpG 岛之外的CpG位点，在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点，以及肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格，让它成为筛选GWAS 群体的理想选择。索取HumanMethylation450 BeadChip芯片的更多资料相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析更适合高通量的验证研究，它以溶液的形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA与分析oligo混合，oligo与未甲基化位点的U互补，或者与甲基化位点的C互补。杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的oligo来产生通用PCR的模板。最后，用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品专家介绍，其产品的最大优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将甲基化定位在一段区域，而通过Illumina分析，你能精确测定某个CpG 位点的甲基化水平。索取GoldenGate甲基化分析的更多资料
高通量测序
新一代测序仪的飞速发展，使得测序成本大幅度下降，也使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。近两年，多个研究小组将传统的甲基化工具(如DNA的亚硫酸氢盐转化)与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合，绘制出了多张甲基化图谱。
而第三代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可能。一年前，美国Pacific Bio science s公司利用独有的单分子实时(SMRT)测序技术，直接测定了DNA的甲基化。这项成果发表在《Nature Methods》杂志上。
SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。
研究人员使用这些动力学特征，鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化，并发现再结合circular consensus sequencing，他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰(mA、mC和hmC)。
飞行质谱
美国Sequenom公司的MassARRAY? 平台也可用于DNA甲基化分析。MassARRAY? EpiTYPER? DNA 甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和
MALDI-TOF 检测原理，可实现多重CpG的分析检测。
碱基特异性酶切(MassCLEAVE)实验由亚硫酸氢盐处理待测DNA 开始。经过亚硫酸氢盐处理，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C) 转变为尿嘧啶(U)，由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化。利用5' 末端带有T7-启动子的引物进行PCR 扩增，产物经SAP (虾碱性磷酸酶)处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化，飞行质谱能测出每个片段的分子量，配套软件 EpiTYPER 则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。
MassARRAY甲基化检测无需任何荧光标记，每个反应覆盖长达500 bp的多个CpG 位点，且灵敏度高，可检测低至5%的甲基化水平。目前有多家公司提供MassARRAY甲基化检测服务，如北京毅新兴业。
4℃离心，7500g X 5min，弃上清液
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
DNA甲基化检测技术全攻略 近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。 特异位点的甲基化检测 甲基化特异性PCR(MS-PCR) 这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。 这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。 亚硫酸氢盐处理+测序 这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA) DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。 这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。 荧光定量法(Methylight) 此种方法利用TaqMan? 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。 Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC 区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
甲基化研究方法学回顾 1 整体水平甲基化分析 1.1 高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法 HPLC是一种比较传统的方法，能够定量测定整体水平DNA 甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]首次报道。过程是将DNA 样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光测定吸收峰值及其量，计算5m C/(5m C+5℃)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这是一种检测DNA 甲基化的标准方法。但它需要较精密的仪器。Fraga等2002年[19]运用高效毛细管电泳法(HPCE)处理DNA 水解产物，以确定5mC的水平。与HPLC相比，HPCE更加简便、快速、经济。HPLC及HPCE测定整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。Oefner等1992年[20]提出变性高效液相色谱法（DHPLC）用于分析单核苷酸和DNA 分子。邓大君等2001[21]将其改进与PCR联用建立了一种检测甲基化程度的DHPLC分析方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增，由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR扩增时，其变性温度也相应上升，使PCR产物在色谱柱中保留的时间明显延长，这样就可以测定出PCR产物中甲基化的情况。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中所有CpG位点甲基化的情况，但不能对甲基化的CpG位点进行定位。 1.2 SssI 甲基转移酶法[22]
SssI甲基转移酶能够催化DNA 的CpG位点发生甲基化。3 H-S-腺苷甲硫氨酸(3 H-SAM)在SssI甲基转移酶催化作用使基因组DNA 的CpG位点发生甲基化。通过测定剩余的放射性标记的SAM即可得到原整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA 甲基化水平成反比。这种方法的缺点是所使用的SssI甲基转移酶不稳定，致结果不够精确。 1.3 免疫化学法[23] 这种方法是基于单抗体能够与5m C发生特异性反应。应用荧光素标记抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA 特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5m C的水平，其荧光素强度与5m C水平成正比。Oakeley等199 7年[23]报道了这种方法。这种方法需要精密的仪器。 1.4 氯乙醛法 Oakeley等1999年[24]首先描述了这种使用氯乙醛和荧光标记的方法。首先，将DNA 经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变（Frommer等1992年）[25]，然后经过银或色谱柱去除D NA 链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5m C就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5m C的水平成正比。这种方法可以直接测定整体5m C水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。 2 特异性位点的DNA 甲基化的检测 2.2.1 甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法
甲基化检测方法 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。
甲基化检测(detection of methylation) 概念：DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA 甲基化转移酶(DNMTs) 的作用下使CpG 二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA 甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA 修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA 的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG 岛以外的CpG 序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG 则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA ，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR 产物进行测序就可以判断CpG
位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR 产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting ，HRM） 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物, 这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC 含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞（＞106个）、组织（＞300mg）、血液（＞1ml）、血清（》等样品材料，基因组DNA（体积》20卩I，浓度》50 ng/口l）。
甲基化检测方法 Prepared on 22 November 2020
甲基化检测（d e t e c t i o n o f m e t h y l a t i o n）概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG 岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为
尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。