DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
第一步：试剂准备
（1）3 M NaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序
1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
3、加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。
第三步：初步脱盐
1、强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
2、向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
3、加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
4、室温孵育5-10分钟。
5、5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。（应出现一种白色的小颗粒。）弃去上清。
6、加入1.0mL 70%的乙醇，涡旋振荡，5000 X g离心10秒，弃去上清。该步骤重复进行，共3次。
7、将第三次上清弃去后，离心管高速离心2分钟，用塑料移液管枪头移去剩余上清。
第四步：完成DNA修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱。
1、适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
2、充分涡旋振荡悬浮颗粒，再室温孵育5分钟。
3、5000 X g离心以移除管顶所有成分。加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。再旋转，除去上清。再次重复该步骤。
4、第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟。
5、用塑料移液管头除去所有剩余上清。试管室温晾干10-20分钟（必须除去酒精气味）。
6、加入TE缓冲液。注意：加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。例如，如果加入25μl TE，基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。用手轻打或轻敲内容物至管顶（但是不要离心）。
7、50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
8、高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本（上清）到新管。
9、进行MSP或测序，或-15～-25℃可保存达2个月，-80℃可保存6个月。避免重复融化和解冻；可分量储存。不要将DNA存储在自动除霜冰箱。
10、当从一管中转移已解冻的DNA以备用时，避免将试剂Ⅲ转移到PCR反应管中。
通常首先将管充分离心，使残留的试剂Ⅲ固体成颗粒状。
三、MSP
（1）引物合成
运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物，引物由上海生物工程有限公司合成。见
表1
表1 甲基化引物序列及扩增条件
hMLH1引物引物序列(5’～3’)产物长度温度甲基化(M) 正义ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 115 bp 55℃甲基化(M) 反义CCTCATCGTAACTACCCGCG 115 bp 55℃非甲基化(U) 正义TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 124 bp 55℃非甲基化(U) 反义ACCACCTCATCATAACTACCCACA 124 bp 55℃（2）PCR反应条件
a 反应体系：10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲
基化上下游引物分别为1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至总体积50μl。
b 循环条件：
共35个循环
（3）PCR产物结果判定：琼脂糖凝胶电泳
a 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但非甲基化特异性引物未
扩增出相应长度的片断，则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性。
b 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断。则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。
盛年不重来，一日难再晨。及时宜自勉，岁月不待人。 PID 控制的基本原理 1．PID 控制概述 当今的自动控制技术绝大部分是基于反馈概念的。反馈理论包括三个基本要素：测量、比较和执行。测量关心的是变量，并与期望值相比较，以此误差来纠正和控制系统的响应。反馈理论及其在自动控制中应用的关键是：做出正确测量与比较后，如何用于系统的纠正与调节。 在过去的几十年里，PID 控制，也就是比例积分微分控制在工业控制中得到了广泛应用。在控制理论和技术飞速发展的今天，在工业过程控制中95%以上的控制回路都具有PID 结构，而且许多高级控制都是以PID 控制为基础的。 PID 控制器由比例单元（P）、积分单元（I）和微分单元（D）组成，它的基本原理比较简单，基本的PID 控制规律可描述为： G(S ) = K P + K1 + K D S (1-1) PID 控制用途广泛，使用灵活，已有系列化控制器产品，使用中只需设定三个参数（K P ，K I和K D ）即可。在很多情况下，并不一定需要三个单元，可以取其中的一到两个单元，不过比例控制单元是必不可少的。 PID 控制具有以下优点： （1）原理简单，使用方便，PID 参数K P、K I和K D 可以根据过程动态特性变化，PID 参数就可以重新进行调整与设定。 （2）适应性强，按PID 控制规律进行工作的控制器早已商品化，即使目前最新式的过程控制计算机，其基本控制功能也仍然是PID 控制。PID 应用范围广，虽然很多工业过程是非线性或时变的，但通过适当简化，也可以将其变成基本线性和动态特性不随时间变化的系统，就可以进行PID 控制了。 （3）鲁棒性强，即其控制品质对被控对象特性的变化不太敏感。但不可否认PID 也有其固有的缺点。PID 在控制非线性、时变、偶合及参数和结构不缺点的复杂过程时，效果不是太好； 最主要的是：如果PID 控制器不能控制复杂过程，无论怎么调参数作用都不大。 在科学技术尤其是计算机技术迅速发展的今天，虽然涌现出了许多新的控制方法，但PID 仍因其自身的优点而得到了最广泛的应用，PID 控制规律仍是最普遍的控制规律。PID 控制器是最简单且许多时候最好的控制器。 在过程控制中，PID 控制也是应用最广泛的，一个大型现代化控制系统的控制回路可能达二三百个甚至更多，其中绝大部分都采用PID 控制。由此可见，在过程控制中，PID 控制的重要性是显然的，下面将结合实例讲述PID 控制。 1.1.1 比例（P）控制 比例控制是一种最简单的控制方式，其控制器的输出与输入误差信号成比例关系。当仅有比例控制时系统输出存在稳定误差。比例控制器的传递函数为： G C (S ) = K P (1- 2) 式中，K P 称为比例系数或增益（视情况可设置为正或负），一些传统的控制器又常用比例带（Proportional Band，PB），来取代比例系数K P ，比例带是比例系数的倒数，比例带也称为比例度。 对于单位反馈系统，0 型系统响应实际阶跃信号R0 1(t)的稳态误差与其开环增益K 近视成反比，即： t→∞
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
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不需精确也不可能100%地控制在某一水平； (2)生物过程的各状态变量之间存在一定的连带关系，难以检测的生物量在一定程度上可通过易检测的物理化学量间接检测，因此相当部分的生化过程控制是一种间接的优化和控制； (3)相当数量的工业规模或实验室规模的生物过程，没有合适的定量数学模型可循，控制和优化操作必须依靠操作人员的经验和知识。 2、实现发酵过程的优化与控制，必须解决的5个问题 答：(1)系统动力学； (2)生物模型； (3)传感器技术； (4)适用于生物过程的最优化技术； (5)计算机─检测系统─发酵罐之间的接口技术(如神经网络、专家系统) 3、生化过程控制理论存在的难点。 答：(1)无论是前馈还是反馈控制，都必须建立在在线监测的各种参数上，但适用于生化反应过程的传感器的研究大大落后于生物工业的发展。 (2)各种微生物具有独特的生理特性、生产各种代谢产物又有各自的代谢途径，应用于生化反应过程的控制理论不具有普适性。 (3)控制理论自身的局限，至今不能模拟生化反应过程的高度非线性的多容量特性。 (4)在具体的控制模型构建时，缺乏以细胞代谢流为核心的过程分析，采用以动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法实质上是化学工程动力学概念在发酵工程上的延伸。 (5)目前发酵动力学模型主要通过经验法、半经验法或简化法得到，一般为非结构动力学模型，如Monod、Moser、Tessier、Contois等模型方程。 二、生化过程参数中物理参数检测技术
【统计过程控制】统计过程控制的四个基本原理 作者：盈飞无限关键词：统计过程控制 导语：统计过程控制，即：Statistical Process Control，简称SPC。作为一种先进方法论，统计过程控制主要对制造流程进行测量、控制与品质改善。在此基础上产生的专门质量管理工具——SPC软件，也被广泛应用于制造业的质量改进中。 传统的质量管理，主要是通过纸笔记录进行数据采集，企业负责人或者说质量主管主要靠“猜”。这种方法对人的经验过度依赖，非常不利于质量管理的效果。统计过程控制将在实时生产过程中获得的以产品或其他形式存在的质量参数绘制在事先确定好控制限的图表上，从而帮助企业对生产的过程进行实时的管控与分析，效果显著。下面文章将具体介绍统计过程控制的四个基本原理，帮助读者更好地学习、了解这种先进的质量管理方法。 1、统计过程控制原理之过程 所谓过程指的是共同工作以产生输出的供方、生产者、人、设备、材料、方法和环境以及使用输出的顾客之集合。过程的性能取决于供方和顾客之间的沟通、过程设计及实施的方式、动作和管理方式等。过程控制系统的其他部分只有它们在帮助整个系统保持良好的水平或提高整个过程的性能时才有用。 2、统计过程控制原理之有关性能的信息 通过分析过程输出可以获得许多与过程实际性能有关的信息。但是与性能有关的最有用的信息还是以研究过程本质以及其内在的变化性中得到的。过程特性（如温度、循环时间、进给速率、缺勤、周转时间、延迟以中止的次数等）是我们关心的重点。我们要确定这些特性的目标值，从而使过程操作的生产率最高，然后我们要监测我们与目标值的距离是远还是近，如果得到信息并且正确地解释，就可以确定过程是在正常或非正常的方式下运行。若有必要可采取适当的措施来校正过程或刚产生的输出。若需要采取措施，就必须及时和准确，否则收集信息的努力就白费了。 3、统计过程控制原理之对过程采取措施 通常，对重要的特性（过程或输出）采取措施从而避免它们偏离目标值太远是很经济的。这样能保持过程的稳定性并保持过程输出的变差在可接受的界限之内。采取的措施包括变化操作（例如：操作员培训、变换输入材料等），或者改变过程本身更基本的因素（例如：设备需要修复、人的交流和关系如何，或整个过程的设计——也许应改变车间的温度或湿度）。
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
过程检测与控制仪表知识 员工培训教材 马仁
过程控制与检测仪表课件 一、过程控制仪表： 1）是实现工业生产过程自动化的重要工具。控制检测仪表可分为八大单元：变动单元、调节单元、计算单元、显示单元、转换单元、给定单元、执行单元和辅助单元。（理论以“够用为度”，实践以“实用为主”） LT 控制系统方框图 说明：图中控制对象代表生产过程中的某个环节，控制对象输出的是被控变量（如压力、流量、温度、液位等温度变量）。这些工艺变量经变动单元转换成相应的电信号或气压信号后，一方面送显示单元供指示和记录，同时又送到调节单元中与给定单元送来的给定值进行比较，调节单元将比较后的偏差值进行一定的运算后，发出控制信号，控制执行单元的动作，将阀门开大或关小。改变控制量（如燃料油、蒸汽等介质流量的多少）直至被控变量与给定值相等为止，此时阀门会
平衡在某一位置，使工艺介质达到工艺要求。 ①LT—检测锅炉汽包水位的变化并将汽包水位高低这一物理量转换成仪表间的标准统一信号。 ②LC—接受液位测量变送器的输出标准信号，与工艺控制调节（控制器）器要求的水位信号相比较得出偏差信号的大小和方向，并按一定的规律运算后输送一个对应的标准统一信号。 ③LV—接受控制器的输出信号后，根据信号的大小和方向控制阀门的开度，从而改变给水量，经过反复测量和控制使锅炉汽包水位达到工艺要求。 一个控制系统基本由给定单元、控制对象、变送单元、调节（控制）单元、执行单元组成。 锅炉汽包水位控制系统原理图 二、检测与过程控制仪表（通常称自动化仪表）分类方法很多，根据不同原则可以进行相应的分类，如： 按照能源（所使用的）：气动仪表、电动仪表、液动仪表。 根据是否引入微处理机可分为：智能仪表和非智能仪表。 根据信号形式可分为：模拟仪表和数字仪表。 检测与过程控制仪表最通用的分类是按照仪表在测量与控制系统中的作用划分的：
Ensembl data bank 甲基化测序BSP法的那个黑白点状图（黑表示甲基化、白点表示非甲基化）是怎么做出来的呀上 用BiQ ANALYZER软件，免费的可以下载，安装需要最新的java程序 ，关于后续的一些步骤，我看了一篇国内的硕士论文，如下： 2.2.1.4.6连接反应产物的转化 (l)每个连接反应准备1个含有氨节青霉素的LB平板，涂板前半小时将平板从冰箱 中取出平衡至室温。 (2)离心使连接反应内容物汇集到管底，吸取10ul连接反应产物加到置于冰上的 1.5ml离心管中. (3)将冻存的JM109高效率感受态细胞从一70℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融化 (大概5分钟)，轻轻振动离心管使之混匀。 (4)向步骤2准备的每个转化管中加入50ul感受态细胞。 (5)轻轻振动小管混匀，冰浴30分钟。 (6)在精确的42℃水浴中热击45一50秒(不要振动)。 (7)迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。 (8)每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的200ulLB培养基， (9)在37℃振荡培养(150rpm)1小时。 (10)将每个转化培养基200ul涂到LB/氨苄/IPTG/X-Gal平板上。 (11)将平板于37℃恒温箱中过夜培养(16一24小时)。 2.2.L4.7阳性克隆筛选 从培养箱中取出平板，置于4℃冰箱使蓝色充分显现。挑取白斑菌落到5mLB培 基，37℃摇床上培养过夜。吸取lml菌液送测序，引物为通用引物M13。 进入丁香园，是从做MSP开始的。从对DNA甲基化的一无所知到MSP实验成功，经历了很多艰难，同时也收获得了不少经验。从丁香园的帖子可以看出，近几年来，国内对DNA 甲基化的研究在逐年增加，战友们在实验中遇到的困难也不少。在这里谈一下对MSP,及BSP的一点体会，希望能对新手们有所帮助，也请老手们批评补充。 亚硫酸氢盐转化和PCR扩增是MSP,BSP的两个基本步骤。亚硫酸氢盐转化，估计现在做手工修饰的也不多了，试剂盒能够很方便的帮我们解决问题。但PCR中的引物设计，现在可能还是个难题。看到很多帖子里提到的引物都是来源于文献的，但事实上在很多情况下，我们是没法找到现存引物的，因此掌握BSP,MSP引物的设计就显得非常必要了。 BSP，MSP引物设计的一个最大问题在于亚硫酸氢盐的转化使得模板的序列复杂性大大降低，而且经常产生T或G或者富含GC片段交替出现的序列。这个会使引物选择变得困难。因此，往往我们需要设计巢式引物来解决这个问题。BSP,MSP引物的设计，除了要遵循引物设计的基本原则外，还要注意一下一些规则：
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
《过程控制原理及应用》阶段练习题—2 第二章过程装备控制基础 2.4 什么是单回路控制系统？什么是反馈、负反馈、正反馈？为什么通常的自动控制系统都是负反馈控制系统？ 2.5 在控制系统的设计中，被控变量的选择应遵循哪些基本原则？ 2.6 在控制系统的设计中，如何选择操纵变量？ 2.7 在控制系统的设计中，对被控变量的测量会带来哪些滞后？各是由什么原因引起的？ 2.8 什么是调节器的控制规律？调节器有哪几种基本控制规律？ 2.9 比例、积分、微分控制分别用什么量表示其控制作用的强弱？并分别说明 它们对控制质量的影响。 2.10 调节器参数整定的目的是什么？工程上常用的整定方法有哪些？简介之。 2.11图2-1是聚合釜温度和流量的串级控制系统， （1）画出该控制系统的方框图。 （2）指出该系统的主﹑副对象，主﹑副变量，主﹑副调节器各是什么？ （3）当冷却水压力突然增大时，该系统是如何实现其控制作用的？ 图2-1 聚合釜温度与流量的串级控制系统示意图 2.12 某液位的阶跃响实验测得如下数值：
当其阶跃扰动量为Δu＝20%时，试求： （1）画出液位过程的阶跃响应曲线； （2）确定液位过程中的K ﹑T ﹑τ（设该过程用一阶惯性加纯滞后环节近似描述）。 2.13 为什么说串级控制系统的主回路是定值控制系统，而副回路是随动控制系统？ 2.14 什么是前馈控制系统？为什么控制系统中不单纯采用前馈控制，而是采用前馈－反馈控制系统？ 2.15 为什么前馈调节器不能常用常规的调节器？ 2.16 比值控制系统有哪些类型？对单闭环比值控制系统，当主流量和副流量分别有波动时，控制系统是如何实现控制过程的？ 2.17 选择性控制系统有哪些类型？各有什么特点？ 2.18 均匀控制系统设置的目的是什么？它有哪些特点？ 2.19 什么是分程控制系统？它区别于一般控制系统的最大特点是什么？ 2.20 分程控制系统应用于哪些场合？
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法） 基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点. 第一部分基因组DNA的提取。 DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。 验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序
《过程控制原理及应用》阶段练习题—3答案 第三章 过程检测技术 3.1 解：（1）取ΔI 为绝对误差， δI 为相对误差， δIr 为示值相对误差，q 为引用误差。相 应各值如下表所示： （2）由于 q max =q 1=2.0 因此该仪表的精度等级为2。 3.2 解：该仪表的最大引用误差为： 国家规定的精度等级中没有0.6级仪表，而该仪表的最大引用误差超过了0.5级仪表的允许误差，故该台仪表的精度等级应为1.0级。 3.3 解 ： 测量所允许的最大误差为 Δt max =500×2.5%=12.5℃ 1.5级仪表测量范围上限只有100 ℃，直接排除之。 2.0级仪表所允许的最大误差为 Δt max,2=（550+50）×2.0%=12℃ 2.5级仪表所允许的最大误差为 Δt max,3=（500+100）×2.5%=15℃ 故只有2.0级满足Δt max,2＜Δt max 的情况。因此，测量500℃左右的温度， 应选2.0级量程是-50~550 ℃的仪表。 3.4 解：因为压力有波动，故仪表上限应大于最大工作压力的3/2，即 MPa N 5.1)2/3(1=?> %6.0500 3%100max max ±=±=??=N x δ
为了满足测量精度的要求，被测压力的最小值不应低于满量程的1/3，即 MPa N 1.237.0=?< 故应选择量程范围为0~1.6MPa 的压力表。 工艺允许的引用误差最大值为： %25.1%1006 .102.0=?=允δ 故应选择精度等级为1.5级的压力计。 3.5 答：弹簧管式压力计主要是由压力感受元件和放大指示机构构成，其中压力感受元件是一根弯曲成约270°圆弧的扁圆形或椭圆形截面的空心金属管；放大指示机构是由拉杆、齿轮以及指针组成。当通入被测压力后，扁圆或椭圆形截面的弹簧管有变圆的趋势，并迫使弹簧管的自由端发生相应的弹性变形，这个变形借助于拉杆，经齿轮传动机构予以放大，最终由固定于小齿轮上的指针将被测值在刻度盘上指示出来。在弹性范围内，弹簧管自由端的位移与被测压力近似成线性关系，因此通过测量自由端的位移可直接测得相应的被测压力的大小。 3.6 答：压力测量仪表的选用主要考虑以下三个方面：仪表类型、仪表量程范围和仪表精度。仪表类型的选择主要考虑被测介质的性质、现场工作环境以及是否有特殊要求（如是否需要信号远传，自动记录或报警）；仪表量程是根据被测压力的大小来确定；仪表精度根据生产上所允许的最大测量误差来确定。 3.7 答：热电偶测温仪表是利用热电效应原理来测温的。由两种不同的导体组成闭合回路时，如果两接触点的温度不同，回路中将产生热电动势，该热电动势与导体材料和两接触点的温度有关。当两种导体材料固定以后，如果一个接触点的温度为已知，另一接触点的温度即可由热电动势算出。因此，测出回路的热电动势，即可得到另一接触点的温度，即待测温度。 热电偶测温是将一端温度，即冷端温度作为恒定值。在实际应用过程中，冷端温度大多是变化的，从而给测量带来误差。为了保证测量的准确性，就需要对冷端温度进行补偿，使热电偶的冷端温度保持恒定。常用的冷端温度补偿的方法有恒温法、示值修正法、补偿电桥法等。 3.8 答：热电阻测温仪表是利用金属导体或半导体的电阻值随温度变化而变化的性质来测量温度的。
PCR 扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发 展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记 跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计 算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR 从定性到定量质的跨越，具有里程碑 意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检 测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领 域研究中。本文对实时荧光定量PCR 的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过 荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定： PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号标准偏差的10 倍。(2)Ct 值：C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已 经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA 拷贝数。只有在荧光产
DNA甲基化检测技术全攻略 近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。 特异位点的甲基化检测 甲基化特异性PCR(MS-PCR) 这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。 这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。 亚硫酸氢盐处理+测序 这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA) DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。 这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。 荧光定量法(Methylight) 此种方法利用TaqMan? 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。 Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC
免疫组化入门实验操作 一、实验目的： 1.了解免疫组化基本原理。 2.了解免疫组化实验操作及注意事项。 3.免疫组化结果判定。 通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。 二、实验原理： 三、实验材料： 一抗：CD5、CK8、Ki67 二抗：MaxVision3 其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。 四、实验步骤：
1.脱蜡水化 二甲苯5min，二甲苯5min，二甲苯5min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，95%酒精2min，85%酒精2min，自来水冲洗。 2.抗原修复 高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液，电磁炉煮沸后放入切片，扣紧锅盖，功率调至800W，至压力阀均匀喷气后计时 1.5min，移开高压锅室温冷却10min，自来水冷却。 3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗3×3min。 4.一抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）相应一抗，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3×3min。 5.二抗 甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3×3min。 6.DAB 甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB，显色5分钟，自来水冲洗。 7.苏木素复染 每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素，20-30秒后自来水冲洗30s以上，或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。 8.封片 梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接电吹风吹干，中性树胶封固。