酵母菌、霉菌常用培养基的配制
一、目的要求
了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。
学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。
二、基本原理
麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。
三、实验材料
(一)药品
葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HP04、KCl、MgSO4·7H2O，FeS04、琼脂。
(二)仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅。
(三)玻璃器皿
移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。
(四)其他物品
药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。
四、实验内容
(一)麦芽汁培养基的配制
1．培养基成分
新鲜麦芽汁一般为10-15波林。
2．配制方法
(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。
(2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。
(3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。
(4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH 至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。
(5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。
(6)分装、加塞、包扎。
(7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。
（二)马铃薯葡萄糖培养基的配制
1、培养基成分
马铃薯20g
葡萄糖 2 g
琼脂 1.5-2g
水100ml
自然pH
2．配制方法
(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。
（2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。
(3)分装、加塞、包扎。
(4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。
(三)豆芽汁葡萄糟培养基的配制
1．培养基成分
黄豆芽10g
葡萄糖5g
琼脂 1.5-2g
水100ml
自然pH
2．配制方法
(1)称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100 m1水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。
（2)配制时，按每100 m1 10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2 g琼脂，继续加热融化，补足失水。
(3)分装、加塞、包扎。
(4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。
(四)察氏(czapck)培养基的配制
1．培养基成分
蔗糖3g
NaN030.3g
K2HP04 0.1g
KCl 0.05g
MgSO4·7H2O 0.05 g
FeS04 0.001 g
琼脂 1.5-2g
蒸馏水100ml
自然pH
常用缓冲液及培养基配方 LB液体培养基： Bacto-蛋白胨10g 酵母抽提物5g 氯化钠10g 加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。LB固体培养基： 每升LB液体培养基中加入12g琼脂粉，高压灭菌后保存。 SOB液体培养基 Bacto-蛋白胨20g 酵母抽提物5g NaCl 0.5g 加950 ml水溶解，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用5 N NaOH调pH至7.0，定容至1000 ml，高压灭菌后保存。使用前加入5ml经灭菌的2mol/LMgCl2。 SOC液体培养基 SOB中加入经灭菌的葡萄糖溶液至终浓度为20mmol/L。 麦康凯固体培养基 每1000ml水中加52g培养基粉，煮沸溶解后分装，高压灭菌。 NA固体培养基 牛肉浸膏3g 酵母浸膏1g 蛋白胨蔗糖琼脂粉 5g 10g 15g 加950ml蒸馏水溶解，调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。 TB培养基： 将下列组分溶解在0.9L水中： Bacto-蛋白胨12g 酵母抽提物24g 甘油4ml 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/ 0.72 mol/L K2HPO4的溶液。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌。 溶液Ⅰ 葡萄糖2.25 g 50mmol/L 1mol/L Tris·Cl(pH8.0) 6.25ml 20mmol/L 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 5ml 10mmol/L 调pH至8.0后，用水定容至250 ml，高压灭菌后保存。 溶液Ⅱ 10 mol/L NaOH 2ml 10% SDS 10ml 用水定容至100 ml，现配现用。 溶液Ⅲ 5 mol/L 醋酸钾60ml
146种培养基配方 ——2009年2月1日星期日by尛森蟲1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(青虫菌)、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O0.1ｇ Na2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the li quid , then autoclave at 121℃for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌)、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ(乳酸菌培养基Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌) 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY (蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基)
146种培养基配方 1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用） 牛肉膏3g 蛋白胨5g 氯化钠10g 琼脂15~20g pH 7.0~7.2 水1000mL 2、2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g 硝酸钾1g 氯化钠0.5g 磷酸氢二钾0.5g 硫酸镁0.5g 硫酸亚铁0.01g 琼脂20g 水1000mL pH 7.2～7.4 配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000mL。121℃灭菌20min。 查氏（Czapek）培养基（培养霉菌用） 硝酸钠2g 磷酸氢二钾1g 氯化钾0.5g 硫酸镁0.5g 硫酸亚铁0.01g 蔗糖30g 琼脂15~20g 水1000mL pH 自然 121℃灭菌20min。
4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用） 葡萄糖10g 蛋白胨5g 磷酸二氢钾1g 七水合硫酸镁0.5g 1/3000孟加拉红 100mL （rose bengal，玫瑰 红水溶液） 琼脂15—20g pH 自然 蒸馏水800mL 112℃灭菌30min。 临用前加入0.03%链霉素稀释液100mL，使每毫升培养基中含链霉素30μg。 5、马铃薯培养基（简称PDA）（培养真菌用） 马铃薯200g 蔗糖（或葡萄糖）20g 琼脂15—20g pH 自然 培养基的配制：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补足水至1000mL。121℃灭菌30min。 6、麦芽汁琼脂培养基 培养基的配制： (1)、取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。 (2)、将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。 (3)、将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。 (4)、将滤液稀释到5—6波美度，pH约6.4，加入2%琼脂即成。121℃灭菌30min。 7、无氮培养基（自生固氮菌、钾细菌）
常用抗生素 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 常用培养基 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨10g 酵母提取物5g 氯化钠10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。(实验室一般都不调PH) SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨20g 酵母提取物5g 氯化钠0.5g 1 mol/L 氯化钾2.5ml
伊红美蓝培养基 原理 一般用来鉴定大肠杆菌。 伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。 当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。 在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。 常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。 用伊红美蓝培养基鉴定水中大肠杆菌 步骤如下： ①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。 ②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。 ③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。 ④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。 ⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。 配置方法 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20~30g 蒸馏水 1000ml 2%伊红水溶液 20ml 0.5 %美蓝水溶液 13ml 储备培养基的制备 先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 制法
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正PH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 麦康凯培养基 原理 1.全称麦康凯琼脂或是麦康凯培养基 2.一种用于分离鉴定细菌的培养基，大肠杆菌在其上呈红色或粉红色，有的菌落只是中间呈现红色。 配置方法 蛋白胨 17g 脙胨3g 猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g 氯化钠 5g 琼脂 17g 蒸馏水1000mL 乳糖10g 0.01%结晶紫水溶液 10mL 0.5%中性红水溶液 5mL 麦康凯-制法 1 将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL 加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。 2 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。 注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。 吲哚试验 吲哚（indol）试验有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。 LB培养基 配方 胰化蛋白胨 1g 酵母提取物 0.5g NaCl 1g 琼脂 1.5-2g 水100ml LB培养基-LB培养基条件 LB培养基-固态培养基 LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。 LB固体培养基倒板 1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
毕赤酵母表达的培养基配制［5］ 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Y east Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Y east Extract 0.5％ NaCl 0.5％ PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。 2.3 YPD （又称YEPD） Y east Extract Peptone Dextrose Medium，（Y east Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。 2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Y east Extract Peptone Dextrose Medium）： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol （山梨醇）1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。 2.5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基） （34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml 的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。 2.6 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸） 在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。2.7 RD Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基） （含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸） 1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；
酵母菌、霉菌常用培养基得配制 一、目得要求 了解合成培养基、半合成培养基与天然培养基得配制原理、学习与掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基与察氏培养基得配制方法。 二、基本原理 麦芽汁培养基与马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌与霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也就是培养酵母菌及霉菌得一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基,马铃薯葡萄糖培养基与豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基,而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现得自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现得ｐH。 三、实验材料 (一)药品 葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HＰ０4、KCl、ＭｇSO4·７H2O,ＦｅＳ04、琼脂。(二)仪器 天平、高压蒸汽灭菌锅。 (三)玻璃器皿 移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。 (四)其她物品 药匙、ｐH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。 四、实验内容 (一)麦芽汁培养基得配制 １、培养基成分 新鲜麦芽汁一般为1０—15波林、 2.配制方法
(1)用水将大麦或小麦洗净,用水浸泡６—1２h,置于15℃阴凉处发芽,上盖纱布,每日早、中、晚淋水一次,待麦芽伸长至麦粒得两倍时,让其停止发芽,晒干或烘干,研磨成麦芽粉,贮存备用。 (２)取一份麦芽粉加四份水,在６5℃水浴锅中保温3-4h,使其自行糖化,直至糖化完全(检查方法就是取0。5mｌ得糖化液,加２滴碘液,如无蓝色出现,即表示糖化完全)。 (3)糖化液用4-6层纱布过滤,滤液如仍混浊,可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清,加水20m1,调匀至生泡沫,倒入糖化液中,搅拌煮沸,再过滤)、 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度,将滤液用水稀释到１0—15波林,调ｐH 至6、4。如当地有啤酒厂,可用未经发酵,未加酒花得新鲜麦芽汁,加水稀释到1０—1５波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时,加入2%琼脂,加热融化,补充失水。 (６)分装、加塞、包扎、 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 ｍｉｎ。 (二)马铃薯葡萄糖培养基得配制 1、培养基成分 马铃薯20ｇ 葡萄糖 2 g 琼脂1、5—２g 水100mｌ自然ｐH 2.配制方法 (1)配制２0％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g,切成小块,加水１000m１。80℃浸泡lh,用纱布过滤,然后补足失水至所需体积、10０Pａ灭菌２0 min。即成20％马铃薯浸汁,贮存备用、
常用培养基概念及配 方
LB培养基：是微生物学实验中最常用的培养基，用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。用于培养大肠杆菌、枯草杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。 改良MC培养基：用于乳酸菌饮料中乳酸菌的菌落计数；原理：大豆蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖和乳糖为可发酵糖类提供碳源；乳酸菌发酵糖产酸使菌落周围碳酸钙溶解，以辨别乳酸菌；琼脂是培养基的凝固剂；中性红为pH指示剂。MRS培养基：乳酸菌培养基，由多种成分组成，适用于乳酸菌的生长，用来分离培养乳酸菌的一类培养基，一种常用的培养基，宜培养分离乳酸菌。由于该培养基十分适于乳酸菌的生长，而且抑制其他菌的生长，因此具有分离乳酸菌的功能。当乳酸菌长成后在培养基上显黄色，之后会变淡黑色。以此分离乳酸菌。 乳酸菌：凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总
称。常见菌种有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌等 自配高浓度污水：葡萄糖5550 mg／L+(NH4)2SO4,1170 mg／L+KH2PO4，170 mg／L+COD为5000 mg／L。 自配污水：葡萄糖555 mg／L+(NH4)2SO4，117mg／L+KH2PO4 17 mg／ L+CaC12 0，08 mg／L+MgSO4，1，534 mg／L+NaHCO3 550．8 mg／ L+FeC13·6H2O 0．25 mg／L+C0D 500 mg／L+氨氮为30 mg／L． 一、LB培养基配制
1、PDA培养基（用于分离、培养植物内生真菌）： 马铃薯（去皮）200g , 葡萄糖20g , 蒸馏水1000 ml , 琼脂粉15g。用于分离内生真菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的氯霉素和硫酸链霉素各50 μ g/ml，用于抑制细菌的生长。2、NA培养基（用于分离、培养植物内生细菌）： 牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。用于分离内生细菌时在倒平板之前加入已过滤除菌的放线菌酮50μg/ml，用于抑制真菌生长。115℃，20min 灭菌。 3、LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0； 4、DSM1培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，胰蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL，pH=7.0； 5、DSM2培养基：磷酸三钾26.631 g（pH=7.0)，二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，细菌学蛋白胨10 g，葡萄糖1 g 蒸馏水至1000 mL,pH=7.0； 6、Msgg培养基：磷酸钾5 mmoL/L(pH7.0)，MOPs 100 mmoL/L（pH7.0），MgCl2 2 mmoL/L，CaCl2 700 mmoL/L，MnCl2 50 μM，FeCl3 50 μM，ZnCl2 1 μM，VB1 2 μM，甘油0.5 %，谷氨酸0.5 %，色氨酸50 μg/mL，苯丙氨酸50 μg/mL，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。 7、N%NA培养基：牛肉膏3.0 g，细菌学蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂粉N*10 g， 8、BGM1培养基：牛肉膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，磷酸三钾26.631 g（pH7.0），二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，葡萄糖1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。 9、BGDM培养基：牛肉膏3 g，细菌学蛋白胨10 g，NaCl 5 g，磷酸三钾26.631 g（pH7.0），二水柠檬酸三钠9.999 g，硫酸镁0.2465 g，硫酸铵19.821 g，葡萄糖1 g ，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。 10、镰刀菌酸配制：10 mM标准品FA储存液（40 μg/mL）的配制：精密称取0.1792 g定溶于18%（v/v）谱纯甲醇100L，用1N NaOH 调节pH到6.5。换算的质量浓度（w/v）=1792 μg /mL。 11、LB培养基：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g，琼脂1.5 g，水100 mL，pH7.0, 121℃20 min。 24、PCR产物的电泳 主要仪器： 电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、微波炉、离心机等。 主要实验试剂： 1、50×TAE （2 M Tris，1M 醋酸，50 mM EDTA（pH8.0）） 2、10×上样缓冲液（loading buffer） 3、分子量标准DNA Marker 4、琼脂糖 5、EB （溴化乙锭）（黑暗保存） 25、琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、DNA marker（λHindIII digest，自带6×loading Buffer，在103房间海尔冰箱中存放）
1、Ampicillin□组份浓度100mg/ml Ampicillin （100mg/ml）□配制量50mL □配制方法1. 称量5g Ampicillin置于50mL离心管中。 2. 加入40mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至50mL。 3. 用0.22μm滤膜过滤除菌。 4. 小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。 2、IPTG □组份浓度24mg/mL IPTG （24mg/mL）□配制量50mL □配制方法1. 称量1.2g IPTG置于50mL离心管中。 2. 加入40mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至50mL。 3. 用0.22μm滤膜过滤除菌。 4. 小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。 3、X- Gal□组份浓度20mg/mL X- Gal （20mg/mL）□配制量50mL □配制方法1. 称取1g X-Gal置于50mL离心管中。 2. 加入40mL DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50mL。 3. 小份分装（1mL/份）后，-20℃保存。 4、LB培养基□组份浓度1％（W/V）Tryptone，0.5％（W/V）Yeast Extract，1％（W/V）NaCl □配制量1L □配制方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中 Tryptone 10g；Yeast Extract 5g ；NaCl 10g 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加5N NaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0。 4. 高温高压灭菌后，4℃保存。 5、LB/Amp培养基□组份浓度1％（W/V）Tryptone 0.5％（W/V）Yeast Extract 1％（W/V）NaCl 0.1mg/mL Ampicillin □配制量1L □配制方法1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中 Tryptone 10g Yeast Extract 5g NaCl 10g 2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加5N NaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0。 4. 加去离子水将培养基定容至1L。 5. 高温高压灭菌后，冷却至室温。 6. 加入1mL Ampicillin（100mg/mL）后均匀混合。 7. 4℃保存。 6、TB培养基□组份浓度1.2％（W/V）Tryptone
培养基配方 1 斜面菌种保存培养基 1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 1.2麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml （视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 2.1平板计数琼脂培养基 将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。 3志贺氏菌检测
3.1 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115℃高压灭菌15min。 3.2 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2ml。
酵母菌、霉菌常用培养基的配制 一、目的要求 了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。 学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。 二、基本原理 麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。 三、实验材料 (一)药品 葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HP04、KCl、MgSO4·7H2O，FeS04、琼脂。 (二)仪器 天平、高压蒸汽灭菌锅。 (三)玻璃器皿 移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。 (四)其他物品 药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。 四、实验内容 (一)麦芽汁培养基的配制
1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。 (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH 至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 （二)马铃薯葡萄糖培养基的配制 1、培养基成分 马铃薯20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水100ml 自然pH
芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ， 蒸馏水1000ml ，琼脂18g 。调节, 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL △中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g, 磷酸氢 二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节— 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
三、需氧性测定 1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节，分装试管，，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。 四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，，带冷至45-50摄氏度时，速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察 将测试菌种以三点法点接在牛奶平板上，一般于30度培养1,3,5,7和14天，如菌落周围和下面呈透明，表明酪素已被分解。
146种常用培养基配方 THE COMPOSITION OF MEDIA 培养基及成分 1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（青虫菌）、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O 0.1g Na2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml
031*-2./4,+ 5 86779\_V_[_PUY\RQTXYWYS^QO\OWYS YXWUXR:bkkiNIIlllHk_d_j_H`hfH`g Ofic`ceecg EKJJ faIfeF rqq 74p 76z 7:5256658vq 76 ro Jf v 4z 7:5256658-}vq 76eyU .A so ]q uq 76icuEKRZXoaYEQp ,vq 76A to |qoss 17hkWhLcA uo xSR /C r 76p SDYE nsq BGMA UZ\S ELM faIfeF su 74p 76*./}vq 76 ro Jf ros 4*./}-}vq 76eyU .A so ]q uq 76icuEKRZXoaYEQp ,vq 76A to |qoss 17hkWhLcA uo xSR /C r 76p SDYE nsq BGMA ]GS_e ELJ faIfeF nsq BIVGMA r + ro Jlwgt\E -} r +rH .A so ]q~yqq 76Nme 0uEKR_FoaA to O]v ,,1-~C~qos 76@EP`:~+,xoq A uo ]me 0u^j{[Qp ,r +A vo TvTzicYEdn ,svA wo ]q r 76z 7:5256658C rqq 74p 76DYb *ZXA xo u BGMA
031*-2./4,+ 5 9678 :UWPWTW JOSULKNRSQSMV KIUIQSM SRQORL;Y``^HGGaaaF`WZW_WFX][FX\ i x if ]wZjnOFp>hfio y wv j |{l @hfoj y w j v|{l ?ihh 21< aU jfki /wv j |{l M ijfml /w j v|{l r qh 21I_Xyix@TAaUN@R_Xy iJbu ihh 21@LkLm[V 1．营养肉汤 成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4。 制法：按上述成分混合，溶解后校正pH，121℃高压灭菌15min。 2．营养琼脂培养基 成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。 制法：将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧瓶内，121℃，15min高压灭菌备用。 3．MRS培养基 成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄 （琼脂15~20g），蒸馏水1000mL。糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 .7H2O 0.58g，MnSO4 4H2O 0.25g， 制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.2~6.4，分装于三角瓶中，121℃,灭菌15min。 4．脱脂乳培养基 成分：牛奶，蒸馏水。 制法：将适量的牛奶加热煮沸20~30min，过夜冷却，脂肪即可上浮。除去上层乳脂即得脱脂乳。将脱脂乳盛在试管及三角瓶中，封口后置于灭菌锅中在108℃条件下蒸汽灭菌10~15min，即得脱脂乳培养基。 5．培养基A 成分：蛋白胨10.0g，酵母提取物1.0g，葡萄糖10.0g，NaCL5.0g，琼脂15.0g，水1000mL。制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至7.0~7.2，分装于三角瓶中，121℃，灭菌15min。 6．PTYG培养基 成分：胰胨Tryptone（Oxoid）5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉（Oxoid）10g，葡萄糖10g，吐温80 0 1mL，琼脂15~20g，L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，盐溶液4mL。 制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.8~7.0，分装于三角瓶中，115℃灭菌30min。 盐溶液制备：无水氯化钙0.2g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 。7H2O 0.48g，NaCO3 毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％16种培养基配方
毕赤酵母常用培养基与载体
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