毕赤酵母表达常用溶液及相关培养基的配制
一、各种母液的配制
10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基4℃保存。
34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵+100g硫酸铵,溶于1000ml水中,过滤除菌。
500*B(0.02%生物素Biotin4℃保存保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml
水中,过滤除菌。
100*H(0.4%Histidine组氨酸4℃保存保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,(加热至50℃以促进溶解,过滤除菌。
10*D(20%Dextrose葡萄糖保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中,过滤
除菌。10*M(5%Methanol甲醇保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀,
过滤除菌。
10*GY(10%Glycerol甘油保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。
100*AA(0.5%of each Amino Acid,各种氨基酸4℃保存,保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌。
1M磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer,pH6.0,将1mol/L的K2HPO4溶液132ml
与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀,其pH为6.0,若需调节pH,用磷酸和氢氧化钾调节。
二.毕赤酵母表达的培养基配制
2.1LB(Luria-Bertani培养基:
Trypton l%
Yeast Extract0.5%
NaCl l%(pH7.0
制作平板时加入2%琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZ
αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin25ug/ml。
2.2LLB(Low Salt LB培养基:
Trypton l%
Yeast Extract0.5%
NaCl0.5%(pH7.0
制作平板时加入2%琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时,加入Zeocin25ug/ml,可以4℃条件下保存1~2周。
2.3YPD(又称YEPD
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium,酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基
Trypton2%
dextrose(glucose2%
+agar2%
+Zeocin100μg/ml
液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin100ug/ml,成为YPDZ培养基,可以4℃条件下保存1~2周。
2.4YPDS+Zeocin培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium:
yeast extract1%
peptone2%
dextrose(glucose2%
sorbitol1M
+agar2%
+Zeocin100μg/ml
不管是液体YPDS培养基,还是YPDS+Zeocin培养基,都必须存放4℃条件下,有效期1~2周。
2.5MGY
Minimal Glycerol Medium(最小甘油培养基(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素。
将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的
10*GY母液混匀即可,4℃保存,保存期为2个月。
2.6MGYH
Minimal Glycerol Medium+Histidine(最小甘油培养基+0.004%组氨酸
在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀,4℃保存,保存期为2个月。
2.7RD
Regeneration Dextrose Medium(葡萄糖再生培养基(含有:1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;
1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸
1.将186g的山梨醇定容至700ml,高压灭菌;
2.冷却后于45℃水浴;
3.将100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。
2.8RDH
Regeneration Dextrose Medium+Histidine(葡萄糖再生培养基+0.004%组氨酸在RD培养基配制的第三步中,在加入10ml的100*H母液,同时无菌水的体积减少至78ml即可,其余配制方法与RD相同。4℃保存。
2.9RD及RDH平板的制备
1.将186g的山梨醇和15-20g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;
2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、100ml的
10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液和88(78ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀;
3.迅速制备平板。4℃可保存数月。
2.10RD及RDH的TOP琼脂的制备(常用于酵母菌的包被
1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml,高压灭菌;冷却后于60℃水浴;
2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4,将100ml的10*D、100ml的
10*YNB;2ml 的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液和88(78ml无菌水混匀,预热至45℃后,与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀;
3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温,备用。
2.11MD与MDH
Minimal Dextrose Medium+(Histidine最小葡萄糖培养基+(0.004%组氨酸
(含有:1.34%YNB;;4*10-5%生物素;2%葡萄糖
1.100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液,用800ml的无菌水定容至1000ml即可;
2.如配制MDH,可在上述的MD中加入10ml的100*H即可;
3.如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。
2.12SOC培养基:
Trypton l%
Yeast Extract0.5%
NaCl0.05%
Glucose(1mol/L2%
121℃高压灭菌20min,冷却后,4℃保存
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
146种培养基配方 ——2009年2月1日星期日by尛森蟲1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(青虫菌)、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O0.1ｇ Na2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the li quid , then autoclave at 121℃for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌)、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ(乳酸菌培养基Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌) 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY (蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基)
实验一培养基的配制 实验目的 1.明确培养基的配制原理。 2.掌握配制培养基的一般方法和步骤。 实验内容 学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。 实验原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。 各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏 I 号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在96 C 以上熔化成液体，而在 45 C左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH 偏酸；细菌、放线菌的 pH 为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的 pH 值调到一定的范围。 牛肉膏蛋白胨培养基配方 牛肉膏 3.0 g 蛋白胨10.0g NaCl 5.0g 水1000mL pH 高氏 7.4~7.6 I 号培养基配方 可溶性淀粉 20g NaCl 0.5g KNO 3 1g K 2HPO 4 ? 3H2O0.5g MgS04 7H20 0.5g FeS04 ? 7H20 0.01g 琼脂15—25g 水1000mL
pH 7.4~7.6 马铃薯培养基配方 马铃薯(去皮) 葡萄糖(或蔗糖) 琼脂水 自然 pH 200g 20g 15~25g 1000ml 察氏培养基配方 蔗糖30g NaNO3 2g K2HPO4 1g KCl 0.5g MgS04 7H2O FeS04 7H2O 0.5g 0.01g 琼脂15~25g 蒸馏水自然 pH 1000ml 实验器材 牛肉膏，蛋白胨， NaCl ，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCI , KNO 3, K2HPO4? 3H2O, MgS04 ? 7H2O, FeS04 ? 7出0,马铃薯，蔗糖等。 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙， pH 试纸 (pH 5.5~9.0) ，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 实验步骤 1．牛肉膏蛋白胨培养基配制方法 (1) 称量：按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、 NaCL 放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 (2) 溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时．需不断搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。 ⑶调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始 pH ,如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
毕赤酵母表达的培养基配制［5］ 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Y east Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Y east Extract 0.5％ NaCl 0.5％ PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。 2.3 YPD （又称YEPD） Y east Extract Peptone Dextrose Medium，（Y east Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。 2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Y east Extract Peptone Dextrose Medium）： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol （山梨醇）1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。 2.5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基） （34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml 的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。 2.6 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸） 在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。2.7 RD Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基） （含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸） 1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；
酵母菌、霉菌常用培养基得配制 一、目得要求 了解合成培养基、半合成培养基与天然培养基得配制原理、学习与掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基与察氏培养基得配制方法。 二、基本原理 麦芽汁培养基与马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌与霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也就是培养酵母菌及霉菌得一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基,马铃薯葡萄糖培养基与豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基,而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现得自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现得ｐH。 三、实验材料 (一)药品 葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HＰ０4、KCl、ＭｇSO4·７H2O,ＦｅＳ04、琼脂。(二)仪器 天平、高压蒸汽灭菌锅。 (三)玻璃器皿 移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。 (四)其她物品 药匙、ｐH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。 四、实验内容 (一)麦芽汁培养基得配制 １、培养基成分 新鲜麦芽汁一般为1０—15波林、 2.配制方法
(1)用水将大麦或小麦洗净,用水浸泡６—1２h,置于15℃阴凉处发芽,上盖纱布,每日早、中、晚淋水一次,待麦芽伸长至麦粒得两倍时,让其停止发芽,晒干或烘干,研磨成麦芽粉,贮存备用。 (２)取一份麦芽粉加四份水,在６5℃水浴锅中保温3-4h,使其自行糖化,直至糖化完全(检查方法就是取0。5mｌ得糖化液,加２滴碘液,如无蓝色出现,即表示糖化完全)。 (3)糖化液用4-6层纱布过滤,滤液如仍混浊,可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清,加水20m1,调匀至生泡沫,倒入糖化液中,搅拌煮沸,再过滤)、 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度,将滤液用水稀释到１0—15波林,调ｐH 至6、4。如当地有啤酒厂,可用未经发酵,未加酒花得新鲜麦芽汁,加水稀释到1０—1５波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时,加入2%琼脂,加热融化,补充失水。 (６)分装、加塞、包扎、 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 ｍｉｎ。 (二)马铃薯葡萄糖培养基得配制 1、培养基成分 马铃薯20ｇ 葡萄糖 2 g 琼脂1、5—２g 水100mｌ自然ｐH 2.配制方法 (1)配制２0％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g,切成小块,加水１000m１。80℃浸泡lh,用纱布过滤,然后补足失水至所需体积、10０Pａ灭菌２0 min。即成20％马铃薯浸汁,贮存备用、
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
培养基配方 1 斜面菌种保存培养基 1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基） 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 1.2麦芽汁琼脂培养基 麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的3~4倍加水，搅拌均匀后，37℃左右浸泡1小时，然后缓缓加温至55~63℃（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温4~6小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml （视试管大小而定），121℃灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。 2 基菌落总数检测 2.1平板计数琼脂培养基 将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g 加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121℃下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。 3志贺氏菌检测
3.1 GN增菌液 成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0 制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115℃高压灭菌15min。 3.2 HE琼脂 成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂18~20g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5 制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至50~55℃，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。 注2：甲液的配置： 硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。 注3：乙液的配置： 去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。 注4：Andrade指示剂的配置： 酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2ml。
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
常用培养基的配制 （一）营养琼脂培养基 【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。 【成分】牛肉膏 3g NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼脂 20g 【pH值】7.2±0.2 【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基 【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃20min高压灭菌备用。 （三）半固体培养基 【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g 【pH值】7.6 【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。 （四）营养肉汤培养基 【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 牛肉粉（牛肉浸汁） 3g 【pH值】7.2±0.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，分装小试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min 高压灭菌备用。 （五）葡萄糖蛋白胨水培养基 【用途】供甲基红试验及V-P试验之用。 【成分】蛋白胨5g 葡萄糖5g K2HPO4 (K2HPO4·3H2O) 5g (0.65g) 【pH值】7.0～7.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装试管，每管2～3ml，经112.6 ℃ 20min高压灭菌备用。 （六）伊红美蓝培养基（EMB培养基）
https://www.doczj.com/doc/8b14097144.html,/experiment/plant2/159568.shtml 11. Glucose Asparagine （葡萄糖、天门冬素琼脂） Glucose （葡萄糖）10g Asparagine （天门冬素）0.5g K2HPO4 0.5g Water （水）1000ml pH 7.2-7.4 适用范围：刺孢小单孢菌绛红变种、紫色小单孢菌（绛红小单孢菌） 12. Gause′s Synthetic Agar （高氏合成一号琼脂） KNO3 1g Soluble starch（可溶性淀粉）20g K2HPO4 0.5g MgSO4.7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 0.01g Agar （琼脂）20g water （水）1000ml pH 7.2-7.4 适用范围：刺孢小单孢菌绛红变种、紫色小单孢菌（绛红小单孢菌）、白黄链霉菌、白色链霉菌、抗生链霉菌、双重轮丝链霉菌、产色链霉菌、烬灰链霉菌、天蓝色链霉菌、灭蚊链霉菌、红霉素链霉菌、青色链霉菌、球孢链霉菌、浅灰链霉菌、灰色链霉菌、吸水链霉菌、淡紫灰链霉菌、黄色长孢链霉菌、藤黄色链霉菌、细黄链霉菌、黑化链霉菌、玫瑰色链霉菌、华美链霉菌、嗜热链霉菌、委内瑞拉链霉菌、紫色直丝链霉菌、紫色链霉菌、绿色链霉菌 13. Wort Agar （麦芽汁琼脂） Dilute the world (without hop) to 12 Brix. Add 15g agar into 1000ml of the diluted word..Melt the agar by heating, then distribute the medium into tubes. Autoclave at 110 for 30 minutes. (将发酵啤酒的原料（未加酒花），稀释至12柏林，加琼脂15克，溶化后分装。15磅灭菌30分钟。) 适用范围：克鲁斯假丝酵母、郎比可假丝酵母、解脂假丝酵母、马其顿假丝酵母、拟热带假丝酵母、粗壮假丝酵母、皱褶假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、阿舒假囊酵母、白地霉、果香地霉、地霉属、异常汉逊酵母、异常汉逊酵母变种、阿拉伯糖醇汉逊酵母、施氏汉逊酵母、菅囊酵母、伯顿毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、粘红酵母、小红酵母、胶红酵母、深红酵母、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、椰园酿酒酵母、发酵性酵母、洛格酵母、罗斯酵母、鲁氏酵母多形鲁氏酵母、威尔酵母、酵母、路德类酵母、栗酒裂殖酵母、掷抱酵母、贝雷丝孢酵母、皮状丝孢酵母、糙孢曲霉、无壳曲霉、鲜橙曲霉、红曲霉、紫红曲霉、红色红曲霉、红曲霉菌 14. Potato Dextrose Agar PDA (马铃薯、葡萄糖琼脂) Potato extract (马铃薯汁) 1000ml Dextrose(glucose) (葡萄糖) 20g Agar (琼脂) 20g [Note]: Potato extract: Slice potatoes thin. Add 1000ml of water, immediately to prevent Oxidtion of juice and boil until soft. (approximately 30min.). Filter through cotton-cloth. Autoclave at 115℃for 20 minutes.（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000
D M E M(A)细胞培养基（粉末型）成分
DMEM(H) 细胞培养基（粉末型）成分 DMEM(L) 细胞培养基（粉末型）成分
双蒸水。（2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基，轻轻搅拌，不要加热。 （3）水洗包装袋的内部，转移全部的痕量干粉到容器内。 （4）加NaHCO3到培养基中。 （5）用双蒸水稀释到想要的体积，搅拌溶解。注意不要过分搅拌。 （6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值，由于pH值在过滤时会上升到，因而调节pH值使它比最终想要的pH值低到。培养基在过滤前要保持密封。 配制培养基要注意以下问题： ●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 ●配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 ●配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 ●所用器皿应严格消毒。 ●配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
●液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。 DMEM各种成分都有什么作用 一般的基础培养基包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物。 （1）无机盐：对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。 （2）氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)都是细胞用以合成蛋白质的必需氨基酸，不能由其他氨基酸或糖类转化合成。除此之外，还需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，对细胞的培养特别重要，能促进各种氨基酸进入细胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，还是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应补加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培养液中。 （3）维生素：是维持细胞生长的一种生物活性物质，在细胞中大多形成
毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％