纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术 Nanopore Sequencing 2019 - Patent Landscape Analysis 随着各种技术的新产品推出，哪些公司将在知识产权方面引领纳米孔测序？ 纳米孔测序是极具前景的下一代测序技术 据麦姆斯咨询介绍，纳米孔测序是新一代测序（NGS）技术之一，被认为能够彻底革新DNA分析。随着时间地推移，目前已经开发出了不同形式的纳米孔测序技术，包括蛋白质纳米孔、固态纳米孔和复合纳米孔。该技术可以高速生成超长读数，减少样品制备时间以及将读数重组成原始序列所需要的数据处理时间。 这项新技术可以开发一个需要遗传指纹来快速识别癌症类型和病原体的全新客户群。根据DataBridge的数据，全球下一代测序市场将快速增长，市场规模预计将从2017年的48.3亿美元增长到2024年的163.5亿美元，2018~2024年期间的复合年增长率（CAGR）预计为19.2%。 目前，Oxford Nanopore Technologies是唯一一家将基于纳米孔的测序仪推向市场的公司。不过，还有其它几家公司正在开发自己的相关技术，Oxford Nanopore Technologies公司可能很快将不再是纳米孔测序仪的唯一供应商。例如，Two Pore Guys公司宣布将在2019年春季发布其产品套件。 随着新产品在未来的相继推出，了解纳米孔测序市场相关参与者的知识产权（IP）状况和策略，同时发现专利新申请人及其所带来的威胁至关重要。为此，著名市场研究机构Yole 子公司Knowmade深入调研了基于纳米孔的测序技术（蛋白质、固态和复合）及其应用（肿瘤学、植物遗传学等）中涉及的知识产权主要参与者。本报告可以帮助读者发现业务风险和机遇，预测新兴应用，支持战略决策以加强市场地位。 纳米孔测序全球专利申请趋势 对专利申请趋势的分析表明，从2008年到2013年，纳米孔测序相关的专利申请获得了重要增长。这一增长源自于学术研究团队（哈佛大学和加州大学）对纳米孔测序概念的验证。
２０１０年第１０期杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景 等交叉学科的迅猛发展。 １．１第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。１．１．１聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。４５４采用焦磷酸合成测序法ＨＪ，避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极大的肯定。 Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升，报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ １．１．２连接酶合成测序法２００７年ＡＢＩ公司在Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前ＳＯＬＩＤ３．０测序通量可达２０Ｇ，而测序片段仅有３５—５０ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片段长度方面做出重大突破。 ＤａｎａｈｅｒＭｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅ—ｎｏｍｉｃｓ公司推出的ＤＮＡ纳米阵列与组合探针锚定连接测序法＂１则具有更高的容错能力，试剂的消耗也进一步减少，目前已顺利完成３个个体基因组的测序工作。 １．２第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。 Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来加以区分不同的碱基信号。 ２应用与实践 Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“：“如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以让我们知道的更多。 ２．１ＤＮＡ水平的应用 ２．１．１全基因组测序新一代测序技术极大地推
高通量测序常用名词汇总 一代测序技术：即传统的Sanger 测序法，Sanger 法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以 A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧 核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：n ext gen eration seque ncing ( NGS又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (Deep sequencing )。NGS主要的平台有Roche(454 &454+), lllumina ( HiSeq 2000/2500、GAIIx、MiSeq)，ABI S0LiD 等。 基因：Gene是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid ，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'- 磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA 链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。RNA：Ribonucleic Acid ，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。核 糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子称之为RNA链。RNA是存在于生物细胞以及部分病 毒、类病毒中的遗传信息载体。不同种类的RNA链长不同，行使各式各样的生物功能，如
新一代测序法简介 新一代测序方法是一种直接测序法，它既可以分析基因和DNA的组成(定性分析)，也可以测定同一类型基因在表达过程中产生的数量（定量分析），以及不同类型基因或DNA 之间的差别所在（交叉对比分析）。自2004年，454测序技术发展以来，已经出现的测序产品超过六种之多。这些产品的技术特点见下表： 产家名称产品技术特点优缺点 化学反应测序方法误读率样品准备高通量程度 Roche (454 Life Science) 焦磷酸标记的链 反应 焦磷酸基 标记 <1% 较复杂，需PCR 中等 Illumina（Solexa）四色可逆终止码合成法1%—3% 较复杂，需PCR 中—高ABI(SOLID) 双色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高Helicos Bioscience 单色可逆终止码合成法2%—8% 简单，无需PCR 高—超高Intelligent Biosystm 四色可逆终止码合成法1%—5% 较复杂，需PCR 中—高 Pacific Bioscience 四色焦磷酸基标 记焦磷酸基 标记 3%—8% 简单，无需PCR 高 VisiGen 焦磷酸基标记 FRET 焦磷酸基 标记 3%—8% 简单，无需PCR 高 在这些技术中，从所分析的样本在测序前是否需要扩增，大致可以分为两类，即克隆扩增型和单分子测序型。两种类型在测序技术上区别并不大，但对结果的影响却有不小的差别。主要体现在两个方面：（1）单分子测序更能反应细胞或组织内分子的真实情况，尤其是在需要定量分析的情况下。而克隆扩增型中的PCR反应使得样品中DNA分子的扩增机会并不完全均等，这会对基因表达的定量分析造成影响；（2）单分子测序具有通量更高的优势。克隆扩增使得同一类型的分子数目急剧上升，在提高同类型分在在固相表面出现的几率同时，也降低了不同类型分子出现的机会。 面重点介绍Pacific Biosciences公司推出的Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing（单分子实时DNA测序）。 首先，在这一测序技术中有主要有两个关键的技术： 一、荧光标记的脱氧核苷酸避免了碱基的空间位阻效应。显微镜现在也无法实现实时看到“单分子”，但是它可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA 链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样； 二、纳米微孔（Zero-mode waveguide (ZMW)）。因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景，这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有10nm的纳米孔，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学
下一代测序技术 摘要：DNA测序技术对生物学的发展有着最根本的意义。Sanger法测序经过了30年的应用和发展，而在过去三年中，以454, solexa, SOLiD为代表的高通量测序平台已经大幅度降低了测序成本，提高了测序速度，成为基因组测序市场的主流。在此基础上，各种下一代测序技术正在快速研发，将使基因组测序和重测序的通量和成本更加平民化，为基因组学、遗传学、生物医学和健康科学等领域的发展创造更加广阔的前景。本文将对所有新的测序技术的原理、优势和应用进行总结和展望。 1977年Maxim、Gilbert发明的化学降解法测序技术和Sanger发明的双脱氧末端终止法测序技术不仅为他们赢得了诺贝尔奖，也使得从DNA序列层面研究分子遗传学成为可能。特别是后者，从最开始的凝胶电泳到越来越高通量的毛细管电泳，从开始的手工操作到越来越多自动测序仪的出现，各种改进的Sanger 测序技术统治了DNA测序领域三十年，至今仍在长片段测序，大片段文库测序方面有广泛的应用。人类基因组计划（HGP）的完成就是靠Sanger测序法。 在耗费了庞大成本的人类基因组计划宣布完成之后，越来越多的物种基因组测序工作对测序成本和通量提出了更高的要求，新一代测序技术（也被称为第二代测序技术）开始登上历史舞台。2005年454 life science公司率先推出了焦磷酸测序技术，使测序成本较Sanger法降低了100倍，速度快了（提高）100倍，人类基因组测序逐步进入了100，000美元时代。如今，454 FLX测序仪（Roche Applied Science）、基于“边合成边测序”的Solexa测序仪(Illumina Inc.)和使用“边连接边测序”的SOLiD测序仪(Applied Biosystems)已经成为基因组测序市场的主流机型。除此之外，2008年一年内又有HeliScope单分子测序仪（Helicos）和Polonator(Dover/Harvard)两种测序机型商品化。 在NHGRI（美国人类基因组研究中心）的支持和推动下，未来几年内测序成本将在目前基础上再下降100倍，最终使个人基因组测序成本降至1000美元，人类将革命性的进入个人基因组时代。高通量和低成本的测序技术将进入到普通实验室，基因组测序的简单化将使分子生物学飞跃发展，个人基因组测序产业化也将对健康医学等领域产生革命性的影响。本文将首先对目前已经商品化的新一代测序技术（454、Solexa、SOLiD、HeliScope）做一介绍和比较，再对正在研发中的各种下一代测序方法（第三代测序技术）的原理和应用做一详细的介绍和展望。 1. Roche 454测序技术 2005年454生命科学公司在《自然》杂志发表论文，介绍了一种区别于传统Sanger法的全新高通量测序方法，将测序成本降低了100倍以上，开创了第二代测序技术的先河，454测序仪也成为最先商品化的第二代测序仪。正是在此基础上，其它如Solexa、SOLiD等第二代测序仪才相继问世。454测序技术的原理在于首先使用乳液PCR（emulsion PCR）技术（图一a）扩增已经连接上接头的基因组文库片段，扩增子结合在28 μm的磁珠表面，将乳液破坏后用变性剂处理磁珠，再将含有扩增子的磁珠富集到芯片表面，用测序引物进行测序。在测序过程中，454使用了一种“焦磷酸测序技术”（Pyrosequencing），即在合成DNA 互补链的过程中，每加入一种单核苷酸（dNTP），如与模板链配对结合，就会释放出一个焦磷酸，与底物腺苷-5’-磷酸硫酸（APS）在A TP硫酸化酶作用下合成A TP，与荧光素（Luciferin）一起在荧光素酶(Luciferase)的作用下，会发出一个光信号，由芯片背后连接的电荷耦合装置（CCD，Charge Coupled Device）捕捉。454测序技术合成DNA链使用的是普通单核苷酸，没有任何标记，合成中也没有切割基团等生化反应，因此读长可以达到300-400bp。但没有阻断（block）和去阻断（de-block）过程也意味着对连续重复单核苷酸的阅读只能根据信号强度来判断，容易对其中插入和缺失碱基阅读错误。454测序技术相比较其他第二代测序技术如Solexa和SOLiD, 在读长上有着巨大的优势，但是目前成本要略高。总体而言，高读长使得454技术比较利于De Novo拼接和测序。
作者：尹银亮、陈会平、毛良伟译来源：生物谷 原文刊登于《分析化学》综述Analytical Chemistry 原文标题：Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies 索引信息：https://www.doczj.com/doc/3a14542208.html,/10.1021/ac2010857 | Anal. Chem. 2011, 83, 4327–4341 原文作者：Thomas P. Niedringhaus, Denitsa Milanova, Matthew B. Kerby, Michael P. Snyder,and Annelise E. Barro 译者资料： 尹银亮，香港华大基因研发中心有限公司email：stevenyinbio@https://www.doczj.com/doc/3a14542208.html, 陈会平，毛良伟，武汉华大基因科技有限公司 【内容】 第二代测序 第二代测序成本 第三代测序技术 单分子测序法 边连接边测序法 边合成边测序法 纳米孔测序技术 蛋白质纳米孔测序法 固态纳米孔测序法 长距离阅读DNA的扩展方法 总结性评论 DNA测序正处在技术上天翻地覆剧变的阵痛之中，其突出特点是，测序通量（测序数据量）的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本急剧下跌，并伴随着以巨资购买仪器以引进新技术的需求。以前看似高不可攀的奢侈性研究活动（如个人基因组测序，宏基因组学研究，以及对大量重要物种的测序），在短短几年之间，正以急速的步伐而变得越来越切实可行了。本篇综述将集中讨论在第三，第四代测序方法背后的故事：它们所面临的挑战；各种方法的局限性；以及它们带给我们的充满诱惑的前景。 第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌 体X174的，全长5375个碱基。其测序方法和历史过程以前已做过详细回顾。 后来的四色荧光桑格测序法（每一种荧光代表四种碱基中的一种）被用在自动毛细管电泳测序系统中，此系统由应用生物系统有限公司（Applied Biosystems Inc.）推上市场，后来该公司被整合入生命技术公司(Life Technologies)和贝克曼.考尔特公司(Beckman Coulter inc.)（见表1）。发表于2001年的第一个人类基因组
高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术 （"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。 高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。 实验过程 1.样本准备(sample fragmentation) 2.文库构建(library preparation) 3.测序反应(sequencing reaction) 4.数据分析(data analysis) 测序平台 自从2005年454 Life Sciences公司(2007年该公司被Roche正式收购)推出了454 FLX焦磷酸测序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以来，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了两个强有力的竞争对手，曾推出过3730xl DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)的Applied BioSystem(ABI)这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform)，为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。(见表一) 公司名称技术原理技术开发者 Apply Biosystems(ABI) 基于磁珠的大规模并行克隆连接 DNA测序法 美国Agencourt私人基因组学公司(APG) Illumina 合成测序法英国Solexa公司首席科学家David Bentley Roche 大规模并行焦磷酸合成测序法 美国454 Life Sciences公司的创始人Jonathan Rothberg Helicos 大规模并行单分子合成测序法美国斯坦福大学生物工程学家Stephen Quake Complete Genomics DNA纳米阵列与组合探针锚定连接 测序法 美国Complete Genomics公司首席科学家radoje drmanac 表一:主流测序平台一览 Roche 454焦磷酸测序 (pyrophosphate sequencing) Illumina Solexa 合成测序 (sequence by synthesize) Illumina Genome AnalyzerIIx测序原理 Illumina公司的新一代测序仪Hiseq 2000和Hiseq 2500具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势，可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组DNA的随机片段附着到光学透明
新一代高通量测序技术SOLiD简介 目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454 (GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。这些高通量测序仪的共同点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，且测序所得序列较短：其中的454序列最长，为200～300个碱基，其余三种序列都只有几十个碱基。测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用领域。这就要求我们在熟悉各种高通量测序仪内在技术特点的基础上进行选择。 基因组所引进的SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)是ABI（Applied Biosystems）公司生产的高通量测序仪。目前这台SOLiD运行稳定，SOLiD实验及数据分析小组也可以为大家提供专业的技术服务。所以接下来的关键是如何把SOLiD测序仪应用到符合其技术特点的科研项目中。本短文将简单介绍SOLiD测序流程，双碱基编码原理及数据分析原理，以帮助大家了解SOLiD测序仪的技术特点和应用范围。 1.SOLiD关键技术及其原理 SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。 1.1. SOLiD文库构建 使用SOLiD测序时，可根据实际需要，制备片段文库(fragment library)或末端配对文库(mate-paired library)。简单地说，制备片段文库就是在短DNA片段（60～110 bp）两端加上SOLiD 接头（P1、P2 adapter）。而制备末端配对文库，先通过DNA环化、Ecop15I酶切等步骤截取长DNA片段（600bp到10kb）两末端各25 bp进行连接，然后在该连接产物两端加上SOLiD接头。两种文库的最终产物都是两端分别带有P1、P2 adapter的DNA双链，插入片段及测序接头总长为120～180 bp。 1.2:油包水PCR 我们知道，文库制备得到大量末端带P1、P2 adapter但内部插入序列不同的DNA双链模板。和普通PCR一样，油包水PCR也是在水溶液进行反应，该水相含PCR所需试剂，DNA模板及可分别与P1、P2 adapter结合的P1、P2 PCR引物。但与普通PCR不同的是，P1引物固定在P1磁珠球形表面(SOLiD将这种表面固定着大量P1引物的磁珠称为P1磁珠)。PCR反应过程中磁珠表面的P1引物可以和变性模板的P1 adapter负链结合，引导模板合成，这样一来，P1引物引导合成的DNA链也就被固定到P1磁珠表面了。 油包水PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR 反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。A BI公司提供的SOLiD 实验手册已经把小水滴体积及水相中DNA模板和磁珠的个数比等重要参数进行了技术优化和流程固定，尽可能提高“优质小水滴”(水滴中只含一个DNA模板一个P1磁珠)的数量，为后续SOLiD 测序提供只含有一种DNA模板扩增产物的高质量P1磁珠。
下一代测序（NGS）彻底改变了基因组学研究领域，使全基因组测序比以往任何时候都更有效率。然而，典型的NGS工作流程是鲜有革新的，因为它面临许多手动操作步骤和来自成本、通量以及结果变异性的诸多挑战。传统的样品制备和数据分析方法非常耗时，并更易出错。 针对这些挑战，自动化技术为此提供了相应的解决方案，并通过减少样品间变异提高了最终数据的精准度。然而，为您的NGS工作流程选择适合的自动化设备是一个复杂的过程。为了给您的实验室配备最佳的自动化整合系统，首先要对以下的四个因素进行评估，然后再作出决定： ? 自动化将如何影响您的实验流程？ ? 您可选的自动化方案有哪些？ ? 需要多少培训？ ? 您的自动化解决方案是否需要扩展，以满足未来的需求？
Ilumina文库构建杂交选择和靶向捕获簇扩增和测序Ilumina文库构建杂交选择和靶向捕获簇扩增和测序
图3，高通量PCR纯化自动化工作流程 您是否在纯化时使用真空泵和离心过滤？图3描述了一个中高通 进一步加速：靶标富集技术 量的自动化工作流程图。 基于磁珠技术的靶标富集方法，比如SureSelect靶标富集 试剂盒和SureSelect人全外显子试剂盒，能使您仅对感兴 趣的基因片段测序，提高了几个数量级的实验效率。这些操 作很容易实现和高度扩展，凸显出Bravo自动化液体处理 平台的速度和精度的优势。
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深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展 摘要：回顾了经典DNA测序技术原理，重点阐述了深度测序技术在基因组测序中的研究策略，并结合目前比较常见的二代测序仪来分析比较相互之间的特点和优势，最后，对即将到来的三代测序法的研究进展给予了简单的介绍。 关键词：深度DNA测序基因组测序仪 DNA测序技术的发展过程漫长而艰辛，然而，我们现在获取的大部分DNA序列信息还是依靠基于Sanger在1977年建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”的DNA测序技术获得的。另外就是Maxam和Gilbert建立的“化学降解测序法”。在过去的七年当中，DNA测序技术的发展至少受到来自四个方面的影响：首先是人类基因组计划的出现，这项计划的实施过程中，科学家们面临了巨大的经费问题，因为传统的Sanger测序法无论怎么优化，都无法大幅度降低测序的成本，这很大程度促进了人们对在测序过程中如何降低成本的技术方面的研究。第二，人类以及其他主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段阅读（short-read）成为可能,这极大的促进了短片段测序技术的发展。第三，新型分子生物学技术的不断涌现导致了越来越多的诸如RNA表达染色体构象等生物现象的出现，这就需要有高通量DNA测序手段去解释这些问题，这也极大的促进了新型测序技术的发展。第四，其他学科领域的技术的发展，例如计算机技术，数据存储及分析技术，聚合酶工程技术等，极大地支持了DNA测序技术的应用。本文主要是对目前新一代DNA测序（也叫深度测序）技术（Next-generation DNA sequencing technologies）的研究策略及目前国际DNA测序最新进展做一简要的综述。 1.Sanger测序法 先来回顾一下经典的DNA测序法，从上世纪九十年代早期开始，几乎所有的DNA测序都是利用半自动化的毛细管电泳Sanger测序技术完成的（图1-a）。后来出现了高通量测序法，这种方法首先要对DNA预处理，获取大量的待测序模板即质粒或PCR产物。然后在测序一种发生测序生化反应，这个过程会产生大量长短不一（因为终止位点不一样），末端被荧光标记的延伸产物。再用分辨率高的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，利用计算机软件自动“读
下一代测序技术的内容概览 高通量DNA测序技术（下一代测序技术NGS）在过去的15年里已经有了快速的发展，新的方法也在继续实现商业化。随着技术的发展，对基础和应用科学中的相关应用范围也在增加。这篇综述的目的是提供一个对NGS方法论的概述以及相关的应用。每个简要的讨论之后都跟有制造商和基于网页的可视化。关键词搜索，例如用Google，可能也会提供有帮助的网页链接和信息。 方法的建立 DNA测序方法的建立是Sanger双脱氧合成法以及Maxam-Gilbert的化学裂解法。Maxam-Gilbert化学裂解法是基于DNA的化学修饰然后在邻近修饰过的核苷酸附件的位点进一步裂解DNA骨架。Sanger测序采用了特殊的链终止核苷酸（双脱氧核苷酸），它缺少一个 3‘OH连接位点。因此，不能够在DNA聚合酶的作用下合成磷酸二酯键，结果是正在伸长的DNA链在该位置终止了。双脱氧核苷酸是具有放射性的或者具有荧光标记的，便于分别在测序凝胶或者自动测序仪器上识别。尽管原始的Maxam-Gilbert方法的化学特性已经被进行修饰来帮助消除有毒性的反应物，但是Sanger测序通过合成双脱氧核苷酸的方法已经变成了一种测序的标准。 Sanger测序法在1977年被创建，并且在UNIT7.4中被详尽的描述了。尽管通过当前NGS 标准测序相对较慢，但是在Sanger末端终止法的改进，自动化，以及商业化这些方面已经使它能够在当前的多种应用范围中成为最适当的测序方法。特别的，超薄的凝胶板电泳已经被多通道毛细血管电泳代替了，逐渐还出现了自动填充可循环的毛细血管以及电动样品加样，这对提高Sanger测序过程的速度与便利性有很大的贡献。在Sanger测序中已经出现的最显著的创新点有：（1）荧光染色的发展，（2）采用末端循环测序降低所要求的输入DNA的质量并且用耐热聚合酶高效准确的将终止物染色与正在伸长的DNA链结合起来，（3）解释和分析序列软件的发展。在自动化的Sanger测序项目中的主导者是Applied Biosystem（AB）。当前商业化的AB测序仪全部使用的是荧光染色和毛细管电泳（CE）。用于DNA测序或者片段分析协议的机器的容量在发生改变，4组毛细血管（SeqStudio Genetic Analyzer），8到24组毛细管（3500 Series Genetic Analyzer），以及48到96组（3700 Series Genetic Analyzer）。所以的这些测序仪产生了600-1000个碱基的正确的序列。尽管多年以来，不同种类基于Sanger测序的测序仪器已经被引进，包括来自Licor，Amersham，MilliGen，Perkin Elmer 和Dupont，所以的这些除了AB仪器都已经被停产了。 Sanger测序技术在一些应用中任然非常有用，而这些应用中高通量测序是不被要求的。一些DNA测序的核心设备和以测序来获利的公司提供了Sanger测序服务。对于个体测序反应对公共的用法是在一个特殊的模板上用特殊的DNA引物，例如去检验质粒的构建和PCR 产物。既然来自大量的商家的用于DNA纯化的分子生物试剂盒和试剂以及相对较高质量的合成产物都是可用的，这就使得甚至是相对较大的Sanger测序项目都能够在合理的时间框架和成本范围内完成。 除了检测DNA的序列AB仪器上的毛细管电泳（CE）还被应用到测量酶对基于荧光标记的DNA底物的选择活性，列如，可以分析DNA片段的大小。毛细管电泳同样能够用来同时分析一个单反应中的多个底物，产物或者反应介质，通过不同的荧光标记。CE被用在DNA 聚合酶和DNA连接酶动力学，以及包括冈崎片段和核糖核苷酸的删除修复的偶联酶通路的研究中。AB CE在在糖生物学中也是很有用的，可以用来分析荧光标记的多糖。 第二代测序方法 术语“下一代”隐含着DNA测序技术发展的下一步，同时也表明将会产生一个以下一代命名的新技术。我们更喜欢用下一代，第三代等这些术语，因为我们意识到上述的自动化的
什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行 细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
新一代测序技术研究内容 新一代测序技术不仅仅是生命科学基础研究的重要工具，它即将发展为一个新型的巨大产业群，彻底改变生命科学相关产业和医学的发展模式，并给人类社会带来不可估量的巨大影响。 该技术主要包括基因组学、转录组学、表观组学三个方面的研究。 （1）基因组学 基因组学，或称基因体学，是研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物、医学和工业领域的重大问题。此外，基因组学能为一些疾病提供新的诊断和治疗方法，有助于医生获得更多的治疗信息并进行个性化医疗。同时，基因组学还被用于食品与农业部门。 在新一代测序技术中，基因组学方面主要包括以下八个方面的测序研究： ①全基因组从头测序 从头测序即de novo测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；并为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序
列信息。 ②全基因组重测序 随着测序成本降低和已知基因组序列物种增多，全基因组重测序已经成为动植物育种、群体进化、药物研发、疾病研究和临床诊断中最为迅速而有效的方法之一。全基因组重测序是对基因组序列已知物种的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平进行差异性分析的测序方法。在全基因组水平上扫描并检测与生物体重要性状相关的突变位点，具有重大的科研价值和产业价值。 ③外显子测序 外显子测序是指利用序列捕获技术将探针能覆盖到的全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后再进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定外显子捕获平台探针设计区域及侧翼200bp序列的遗传信息，极大地提高了人类基因组中外显子区域的研究效率，显著降低了研究成本。目前主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的结构变异。 ④目标区域测序 目标区域测序是指利用特制的探针对客户感兴趣的蛋白编码区域DNA或某段特定序列进行捕获，富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大地提高了基因组中特定目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。通过目标区域测序，可以对候选位点或候选基因进行验证，也可以进一步找到候选区域或候选基因内的易感位点，适用于候选基因关联分析等研究。
新一代测序技术组装拼接软件velvet使用简介 目前用于新一代的测序的主要仪器有Illumina/Solexa的Genome Analyzer、ABI的Solid和Roche的454，它们都能高通量的测序，产生大量的测序结果，接下来就要对序列进行拼接，用于拼接的软件也有很多，比如velvet、soap、abyss、maq等，454的还有专门的newbler。平时用velvet比较多，就简单介绍一下。 velvet对短序列的拼接效果比较好，所以多用于对Illumina等产生的短序列片段进行组装拼接。下面以Illumina的GAII产生的结果为例进行说明。 一、单端测序 单端测序可以直接对fastq格式的原始文件进行处理，首先是用velveth 命令建立hash表子集 输入./velveth会出来使用帮助： Usage: ./velveth directory hash_length {[-file_format][-read_type] filename} [options] directory : directory name for output files hash_length : odd integer (if even, it will be decremented) <= 75 (if above, will be reduced) filename : path to sequence file or – for standard input File format options: -fasta -fastq -fasta.gz -fastq.gz -eland